一种蛋白质固定化的新方法
【专利摘要】本发明公开了一种蛋白质固定化的新方法，采用的是氰基硼氢化纳还原法，包括步骤11：制备环氧化琼脂糖；步骤12：对步骤1中得到的环氧化琼脂糖进行氨化处理；步骤13：制备甲酰载体；步骤14：将蛋白质与甲酰载体进行偶联。本发明中对蛋白质的固定化方法不需要在碱性条件下进行，条件温和，对蛋白质天然属性的影响较小或没有影响。
【专利说明】
一种蛋白质固定化的新方法
技术领域
[0001]本发明涉及生物医学领域，具体是指一种蛋白质固定化的新方法。
【背景技术】
[0002]蛋白质的固定化有许多种方法，目前最常用的是用溴化氰活化琼脂糖，然后将蛋白质接到活化的琼脂糖上，这种方法需要在碱性条件下进行，有事会对蛋白质的构象及性质产生一定的影响，因而该方法在使用上受到了限制。
【发明内容】
[0003]本发明的目的在于提供一种不需要在碱性条件下进行的蛋白质固定化的新方法，使蛋白质固定化的条件更加温和，降低对蛋白质天然属性的影响。
[0004]本发明通过下述技术方案实现:采用的是氰基硼氢化纳还原法，包括以下步骤: 步骤11:制备环氧化琼脂糖；
步骤12:对步骤I中得到的环氧化琼脂糖进行氨化处理；
步骤13:制备甲酰载体；
步骤14:将蛋白质与甲酰载体进行偶联。
[0005]进一步地，所述步骤11中制备环氧化琼脂糖步骤进一步包括步骤111:
步骤111:将洗净抽干后的琼脂糖悬浮于重蒸水中，依次混入浓度为2M的氢氧化钠和浓度为5%的环氧氯丙烷，将这一悬浮液于40°C振荡反应2小时，然后转入砂芯漏斗，用大量的水抽滤洗净；
或步骤111为:将吸干的琼脂糖在砂芯上用水洗净并吸干，然后分别混入二甘油醚及浓度为2mg/ml的硼氢化钠和浓度为0.6M的氢氧化钠溶液，将这一悬浮液于25°C振荡保温反应8小时后转移到砂芯漏斗，用大量的水抽滤洗胶。
[0006]进一步地，所述步骤14中蛋白质和甲酰载体的偶联步骤进一步包括:
步骤141:将蛋白质与氰基硼氢化钠溶解于PH为6.4的浓度为0.1M的醋酸缓冲液中，所述醋酸缓冲液中还包括ImM的氯化锰、ImM的氯化镁、ImM的氯化钙以及0.2M的α-甲基甘露糖苷；
步骤142:将步骤141中所得到的溶液与步骤13中制得的甲酰载体混合，置4 °C搅动反应过夜；
步骤143:将步骤142中所得到的凝胶悬于1%的戊二醛溶液中，所述戊二醛溶液中还包含氰基硼氢化钠以及0.2M的专一的糖，再置4°C搅动反应过夜。
[0007]步骤144:将凝胶置于PH为7.4浓度为IM的三(羟甲基)氨基甲烷缓冲液中，所述三(羟甲基)氨基甲烷缓冲液中还包含有氰基硼氢化钠，室温反应I小时；
步骤145:反应完成后，将凝胶转移至砂芯漏斗上，用重蒸水洗去未反应的氰基硼氢化钠；
步骤146:分别用2M的氯化钠、PH为4.0的浓度为0.2M的醋酸缓冲液、以及PH为9.0的浓度为0.1的碳酸缓冲液洗凝胶，用重蒸水洗至中性后，置于PH为7.4的浓度为0.2M的三(羟甲基)氨基甲烷缓冲液中，加入防腐剂叠氮化纳，置4°C冰箱中保存。
[0008]进一步地，所述步骤141中的醋酸缓冲液也可用磷酸缓冲液。
[0009]本发明具有以下优点及有益效果:
本发明中对蛋白质的固定化方法不需要在碱性条件下进行，条件温和，对蛋白质天然属性的影响较小或没有影响。
【具体实施方式】
[0010]下面结合实施例对本发明作进一步地详细说明，但本发明的实施方式不限于此。
[0011]实施例:
本实施例中采用的是伴刀豆球蛋白，按如下步骤进行:
步骤11:制备环氧化琼脂糖
步骤111:将20克洗净后抽干的琼脂糖悬浮于30毫升的重蒸水中，依次混入13毫升的2M氢氧化钠和3毫升的环氧氯丙烷，各物质的终浓度分别为:30%(v/v)琼脂糖凝胶，5%环氧氯丙烷，0.4M氢氧化钠，将这一悬液与40 °(:振荡反应2小时，然后转入砂芯漏斗，用大量的水抽滤洗净:;
或步骤111为:将I克吸干的琼脂糖在砂芯上用水洗净并吸干，然后分别混入I毫升二甘油醚及I毫升含2毫克每毫升硼氢化钠的0.6M氢氧化钠溶液，将这一悬液与25°C正当保温反应8小时后转移到砂芯漏斗，用大量的水抽滤洗胶(此反应中温度较为重要，过高或过低都影响反应效率)。
[0012]步骤12:对步骤I中得到的环氧化琼脂糖进行氨化处理
环氧活化的琼脂糖凝胶用大量水洗净后将其悬于1.5倍体积的浓氨水中，将这一悬液在40°C振荡温育1.5小时，反应完成后转入砂芯漏斗中，用重蒸水洗净。
[0013]步骤13:制备甲酰载体
于I克想吸干的氨化琼脂糖中加入I毫升25%的戊二醛溶液和82毫克氰基硼氢化钠，将此混合物在40°C温育振荡2小时，再用重蒸水洗净。
[0014]步骤14:将蛋白质与甲酰载体进行偶联
步骤141:将10?50毫克的伴刀豆球蛋白和12毫克的氰基硼氢化钠溶解于I毫升的PH为6.4的浓度为0.1M醋酸缓冲液中，所述醋酸缓冲液中还包括ImM的氯化锰、ImM的氯化镁、ImM的氯化钙以及0.2M的α-甲基甘露糖苷；
步骤142:将步骤141中所得到的溶液与0.5克甲酰载体混合，置4°C搅动反应过夜；
步骤143:将步骤142中所得到的凝胶悬于2毫升1%的戊二醛溶液中，所述戊二醛溶液中还包含48毫克氰基硼氢化钠以及0.2M的专一的糖，再置4°C搅动反应过夜。
[0015]步骤144:将凝胶置于2毫升PH为7.4浓度为IM的三(羟甲基)氨基甲烷缓冲液中，所述三(羟甲基)氨基甲烷缓冲液中还包含有6.2毫克氰基硼氢化钠，室温反应I小时；
步骤145:反应完成后，将凝胶转移至砂芯漏斗上，用重蒸水洗去未反应的氰基硼氢化钠；
步骤146:分别用2M的氯化钠、PH为4.0的浓度为0.2M的醋酸缓冲液、以及PH为9.0的浓度为0.1的碳酸缓冲液洗凝胶，用重蒸水洗至中性后，置于PH为7.4的浓度为0.2M的三(羟甲基)氨基甲烷缓冲液中，加入防腐剂叠氮化纳，置4°C冰箱中保存。
[0016]本发明并不局限于前述的【具体实施方式】。本发明扩展到任何本说明书中披露的任一新的方法或过程的步骤或任何新的组合。
【主权项】
1.一种蛋白质固定化的新方法，其特征在于，采用的是氰基硼氢化纳还原法，包括以下步骤: 步骤11:制备环氧化琼脂糖； 步骤12:对步骤I中得到的环氧化琼脂糖进行氨化处理； 步骤13:制备甲酰载体； 步骤14:将蛋白质与甲酰载体进行偶联。2.根据权利要求1所述的一种蛋白质固定化的新方法，其特征在于，所述步骤11中制备环氧化琼脂糖步骤进一步包括步骤111: 步骤111:将洗净抽干后的琼脂糖悬浮于重蒸水中，依次混入浓度为2M的氢氧化钠和浓度为5%的环氧氯丙烷，将这一悬浮液于40°C振荡反应2小时，然后转入砂芯漏斗，用大量的水抽滤洗净； 或步骤111为:将吸干的琼脂糖在砂芯上用水洗净并吸干，然后分别混入二甘油醚及浓度为2mg/ml的硼氢化钠和浓度为0.6M的氢氧化钠溶液，将这一悬浮液于25°C振荡保温反应8小时后转移到砂芯漏斗，用大量的水抽滤洗胶。3.根据权利要求1所述的一种蛋白质固定化的新方法，其特征在于，所述步骤14中蛋白质和甲酰载体的偶联步骤进一步包括: 步骤141:将蛋白质与氰基硼氢化钠溶解于PH为6.4的浓度为0.1M的醋酸缓冲液中，所述醋酸缓冲液中还包括ImM的氯化锰、ImM的氯化镁、ImM的氯化钙以及0.2M的α-甲基甘露糖苷； 步骤142:将步骤141中所得到的溶液与步骤13中制得的甲酰载体混合，置4°C搅动反应过夜； 步骤143:将步骤142中所得到的凝胶悬于1%的戊二醛溶液中，所述戊二醛溶液中还包含氰基硼氢化钠以及0.2M的专一的糖，再置4 °C搅动反应过夜； 步骤144:将凝胶置于PH为7.4浓度为IM的三(羟甲基)氨基甲烷缓冲液中，所述三(羟甲基)氨基甲烷缓冲液中还包含有氰基硼氢化钠，室温反应I小时； 步骤145:反应完成后，将凝胶转移至砂芯漏斗上，用重蒸水洗去未反应的氰基硼氢化钠； 步骤146:分别用2M的氯化钠、PH为4.0的浓度为0.2M的醋酸缓冲液、以及PH为9.0的浓度为0.1的碳酸缓冲液洗凝胶，用重蒸水洗至中性后，置于PH为7.4的浓度为0.2M的三(羟甲基)氨基甲烷缓冲液中，加入防腐剂叠氮化纳，置4°C冰箱中保存。4.根据权利要求3所述的一种蛋白质固定化的新方法，其特征在于:所述步骤141中的醋酸缓冲液也可用磷酸缓冲液。
【文档编号】C07K17/02GK105968207SQ201610310137
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2016年5月12日
【发明人】周洁
【申请人】成都易创思生物科技有限公司