一种具有免疫调节活性的绿豆多糖的制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种具有免疫调节活性的绿豆多糖的制备方法，包括以下步骤：取清洗干净的绿豆，粉碎过筛，浸泡除脂，离心，收集残渣烘干，加入蒸馏水，离心，收集上清液并浓缩；将浓缩的上清液进行脱蛋白处理，透析脱盐，冻干，得绿豆粗多糖；3)绿豆粗多糖进行阴离子交换层析，490nm紫外检测，收集目的洗脱液；4)将目的洗脱液进行凝胶过滤层析，206nm紫外检测，收集洗脱峰，即为纯化的绿豆多糖。本发明的方法能够得到具有免疫调节活性的绿豆多糖，而且该多糖能够刺激RAW264.7小鼠巨噬细胞分泌产生NO、TNF?α和IL?6因子，经过超声处理后绿豆多糖功效更强。
【专利说明】
一种具有免疫调节活性的绿豆多糖的制备方法
技术领域
[0001] 本发明涉及植物提取技术领域，特别涉及一种具有免疫调节活性的绿豆多糖的制 备方法。
【背景技术】
[0002] 绿豆，属于蝶形花科，菜豆族豇豆属中的一个种，是温带、亚热带地区广泛种植的 豆类之一，在中国已有两千余年的栽培史，是重要的药食物同源物质，被誉为"食中要物"， "济世粮谷"，"清热解暑良药"。中医认为:绿豆味甘，性凉，归心经，具有清热解毒解暑除烦、 利水消肿、清胆养胃、润肠通便、明目、降血糖、降血压、降血脂、抗肿瘤、抗过敏、保护肝脏和 心血管、增强免疫力、排铅等功效，适用于暑热烦渴、里热、小便不利、水肿、皮疹、食物及药 物中毒等。
[0003] 从天然成分中含有的多糖由于其潜在的生物学功能吸引了越来越多的关注，尤其 是其抗氧化和生物活性，如清除自由基，抑制脂质氧化，促进自然杀伤细胞(NK)的细胞毒 性，激活巨噬细胞和增强白细胞介素等。多糖的生物活性主要取决于几个参数，包括糖的组 成、分子量、糖苷键类型等。天然多糖在食品和医药方面的应用，使得研究都集中在从天然 的植物、动物、微生物中分离和纯化所得到的多糖。
[0004] 国内外关于多糖的提取方法有很多，包括:溶剂提取法、酸提法、碱提法、酶解法、 超滤法、超声法，微波法等。分离纯化多糖方法包括:沉淀法、盐析法、超滤法等。
[0005] 本发明在此基础上提出一种具有免疫调节活性的绿豆多糖的制备方法。该方法能 够得到具有免疫调节活性的绿豆多糖，经过DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换层析和 凝胶过滤层析纯化得到的绿豆多糖。
【发明内容】
[0006] 本发明所要解决的技术问题是提供一种具有免疫调节活性的绿豆多糖的制备方 法，该方法能够得到具有免疫调节活性的绿豆多糖，而且该多糖能够刺激RAW264.7小鼠巨 噬细胞分泌产生N0、TNF-a和IL-6因子，经过超声处理后绿豆多糖功效更强。
[0007] 本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的：
[0008] -种具有免疫调节活性的绿豆多糖的制备方法，包括以下步骤：
[0009] 1)取清洗干净的绿豆，粉碎过筛，浸泡除脂，离心，收集残渣烘干，加入蒸馏水，离 心，收集上清液并浓缩；
[0010] 2)将步骤1)得到的浓缩的上清液进行脱蛋白处理，透析脱盐，冻干，得绿豆粗多 糖；
[0011] 3)将步骤2)得到的绿豆粗多糖进行阴离子交换层析，490nm紫外检测，收集目的洗 脱液；
[0012] 4)将步骤3)得到的目的洗脱峰进行凝胶过滤层析，206nm紫外检测，收集洗脱峰， 即为纯化的绿豆多糖。
[0013] 优选地，上述技术方案中，所述制备方法包括以下步骤：
[0014] 1)取清洗干净的绿豆，粉碎过60目筛，95 %乙醇浸泡3d除脂，离心，收集残渣烘干， 加入蒸馏水，离心，收集上清液并浓缩；
[0015] 2)将步骤1)得到的浓缩的上清液用Sevag法进行脱蛋白处理，再装入透析袋4°C过 夜透析脱盐，冻干，得绿豆粗多糖；
[0016] 3)将步骤2)得到的绿豆粗多糖用蒸馏水溶解，13000r/min离心20min，上清液进行 阴离子交换层析，梯度洗脱后，490nm紫外检测，合并收集洗脱液，收集得到两个主峰；
[0017] 4)将步骤3)得到的目的洗脱液分别进行凝胶过滤层析，等度洗脱后，在206nm紫外 检测，分别收集得到两个目的洗脱峰，即纯化的绿豆多糖。
[0018] 优选地，上述技术方案中，所述制备方法还包括：
[0019] 5)将步骤2)得到的绿豆粗多糖、步骤4)得到的纯化的绿豆多糖进行超声改性处 理，得到目的绿豆多糖。
[0020] 优选地，上述技术方案中，所述步骤1)具体为：
[0021] 11)取清洗干净的绿豆，粉碎，过60目筛，按固液比1:2加入95%乙醇，浸泡3d除脂；
[0022] 12)离心收集残渣，烘干，按料液比1:4-1:10，在温度为60-90°C条件下，持续搅拌 l-4h，离心，收集上清液并浓缩。
[0023]优选地，上述技术方案中，所述步骤2)采用的Sevag法进行脱蛋白处理具体为:将 浓缩的上清液与Sevage试剂按5:1混合，振荡，离心，去蛋白；所述Sevage试剂为氯仿和正 丁醇按体积比5:1混合形成。
[0024]优选地，上述技术方案中，所述步骤3)具体为：
[0025]将步骤2)得到的绿豆粗多糖用蒸馏水溶解，离心，上清液上DEAE-琼脂糖凝胶FF填 料柱，用超纯水平衡过夜，梯度洗脱，洗脱液为0-2M NaCl溶液，洗脱流速4ml/min，以8ml/管 速度自动收集，在490nm紫外检测，收集目的洗脱液，冻干。
[0026]优选地，上述技术方案中，所述步骤4)具体为：
[0027]将步骤3)得到的目的洗脱液上丙烯葡聚糖凝胶s-300填料柱，等度洗脱，洗脱液为 0.15M NaCl溶液，洗脱流速为0.5ml/min，自动收集，在206nm紫外检测，收集得到两个目的 洗脱峰，即纯化的绿豆多糖。
[0028]优选地，上述技术方案中，所述步骤5)的超声改性处理的反应为:将绿豆粗多糖、 纯化的绿豆多糖分别用一定蒸馏水溶液溶解在l〇ml烧杯中，温度在0°C恒温中，将超声波反 应器的超声波探头浸入溶液15-20毫米，设定频率在30-50kHz，500-700W，超声过程中总超 声时间lmin，其中连续超声1 Os则中间需间隔3s。
[0029]优选地，上述技术方案中，所述步骤12)的按料液比1:8;提取温度为90°C;提取时 间4h;离心条件：3500r、lOmin;烘干温度为60°C。
[0030] 10.根据权利要求8所述的具有免疫调节活性的绿豆多糖的制备方法，其特征在 于，所述超声改性条件为:超声频率为50kHz，700W。
[0031] 优选地，上述技术方案中，透析过夜的时间为8-12h，所述透析袋4°C过夜透析脱盐 需要进行流水透析。
[0032]本发明上述技术方案，具有如下有益效果：
[0033]本发明的方法能够得到具有免疫调节活性的绿豆多糖，而且该多糖能够刺激 RAW264.7小鼠巨噬细胞分泌产生NO、TNF-a和IL-6因子，经过超声处理后绿豆多糖功效更 强。本方法具有绿豆多糖筛选、纯化等作用，最终得到绿豆多糖MWP-1和MWP-2。同时，本发明 还具有以下有有益效果：
[0034] 1.水提取，水做溶剂，安全，污染，价格低廉。
[0035] 2.对绿豆多糖进行提取并进行纯化工艺。
[0036] 3.经过系统提取纯化研究，绿豆水提多糖MWP-1和MWP-2。
[0037] 4.水提取粗多糖提取工艺简单，对企业的技术要求低，可适应与大范围的推广。
【具体实施方式】
[0038] 下面对本发明的具体实施例进行详细描述，以便于进一步理解本发明。
[0039] 以下实施例中所有使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0040] 以下实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过商业途径获得。
[00411实施例1绿豆粗多糖的制备
[0042] 分别研究提取温度、提取时间以及料液比对绿豆多糖得率的影响。
[0043] (1)提取温度、提取时间以及料液比对绿豆蛋白得率的影响。
[0044] 准确称取100g的绿豆粉碎，过60目筛后，将样品与95%乙醇按固液比1: 2浸泡3天 除脂，离心收集残渣，烘干。将烘干后的残渣放入500mL三角瓶中，加入蒸馏水，按照一定的 料液比、在一定提取温度下、搅拌提取一定时间后，离心收集上清液，将上清液浓缩，脱蛋 白、脱盐，冻干，得绿ii粗多糖(命名:MWP)。
[0045] 分别考察料液比1:4、1:6、1:8、1:10,搅拌提取时间lh、2h、3h、4h;以及提取时间60 °C、70°C、80°C、90°C，为考察因素和指标，建立起正交分析表。
[0046]单因素试验结果如下：
[0047] 设定绿豆样品为100g。
[0048] 其中，固液比设为1:6,搅拌时间为2h，实验分析提取温度对多糖得率的影响，结果 如表1所示：
[0049] 表1:固液比1:6，搅拌时间2h，提取温度对多糖得率的影响。
[0051]其中，固液比设为1:6,提取温度为90°C，实验分析提取时间对多糖得率的影响，结 果如表2所示：
[0052] 表2:固液比1:6，提取温度90°C，提取时间对多糖得率的影响。
[0055]其中，提取温度为90°C，搅拌时间为2h，实验分析固液比对多糖得率的影响，结果 如表3所示：
[0056] 表3:提取温度90°C，搅拌时间2h，固液比对多糖得率的影响。
[0058]结果表明（如表1-表3所示）：在料液比1:8，提取时间4h，提取温度90°C效果较好， 得到的粗多糖溶液，经过透析冻干后，多糖得率达到5.11 %。
[0059]实施例2绿豆粗多糖的纯化 [0060] (1)第一次纯化处理：阴离子交换层析
[0061 ]使用JiKTAexPlorel〇〇仪器，将绿豆粗多糖样品用蒸馏水溶解，离心（转速 13000r/min，20min)后，上清液装上DEAE-琼脂糖凝胶FF(GE公司生产，货号17-0709-01)柱， 用超纯水平衡过夜，梯度洗脱，洗脱液为0-2M NaCl，洗脱流速4ml/min，以8ml/管速度自动 收集，490nm紫外检测，分别收集目的洗脱液，冻干。
[0062] (2)第二次纯化处理:丙烯葡聚糖凝胶s-300凝胶过滤层析
[0063] 将上述得到的目的洗脱液分别进一步的进行凝胶过滤层析，填料为丙烯葡聚糖凝 胶s-300，等度洗脱。洗脱液为0.15M NaCl溶液，流速为0.5ml/min。
[0064] 在206nm紫外检测总糖含量并结合苯酚-硫酸法进行糖含量的定量的分析，最终在 206nm产生的两个主要峰。将两个主要峰分别收集命名为MWP-1和MWP-2。
[0065] 将这两个峰分别冻干，得纯化后的绿豆多糖(简称:MWP_1和MWP-2)。
[0066]实施例3超声对绿豆多糖免疫活性的影响
[0067] 使用depu92-ii超声波反应器研究不同超声频率和不同超声功率对绿豆多糖免疫 活性的影响。通过N0因子含量变化来确认对免疫活性的影响。其中，N0含量越高说明免疫活 性增强能力越大。
[0068]将绿豆粗多糖用一定蒸馏水溶液溶解在10ml烧杯中，温度在0°C恒温中，超声波 探头浸入溶液约20毫米，设定频率在30-50kHz，500-700W，超声过程中总超声时间lmin，其 中连续超声l〇s中间间隔3s，防止超声过程中产生过多的热量对多糖结果产生影响。
[0069] 设定相同的多糖浓度，超声功率为500w，超声频率为30、40、50紐2，实验分析超声 频率对绿多糖免疫活性的影响，结果如表4所不：
[0070] 表4:相同的多糖浓度，超声功率为500w，超声频率为30、40、50kHz，超声频率对绿 豆多糖免疫活性的影响。
[0072] 设定相同的多糖浓度，超声频率为50kHz，超声功率为500、600、700W，实验分析超 声功率对绿豆多糖免疫活性的影响，结果如表5所示：
[0073] 表5:相同的多糖浓度，超声频率为50kHz，超声功率为500、600、700W，超声功率对 绿豆多糖免疫活性的影响。
[0075]结果表明（如表4-表5所示）：超声频率为50kHz、700W，所得到的超声多糖的免疫活 性最强。
[0076] 实施例4超声前后的各种多糖的免疫活性作用
[0077] 超声前的多糖包括:粗多糖(MWP)、分离纯化后得到的纯化多糖(MWP-1和MWP-2)。 [0078]将上述各组多糖溶于水中，通过实施例3的方法超声处理得：超声后粗多糖 (MWP'）、超声后纯化多糖(MWP-r和MWP-2'）。
[0079] 实验同时设定对照组(未添加多糖组）。
[0080] 测定上述各组多糖的对RAW264.7小鼠巨噬细胞N0的含量变化，进行细胞实验测定 N0因子含量变化，从而证明绿豆多糖的免疫活性作用。
[0081] 表6:超声前后的各种多糖的免疫活性作用结果。
[0083]结果表明（如表6所示）：超声后的绿豆多糖均比超声前的N0浓度明显提高，其中纯 化后的两种绿多糖提尚最多，可达51.14%和42.41%。
[0084] 本发明的方法能够得到具有免疫调节活性的绿豆多糖，而且该多糖能够刺激 RAW264.7小鼠巨噬细胞分泌产生N0、TNF-a和IL-6因子，经过超声处理后绿豆多糖功效更 强。本方法具有绿豆多糖筛选、纯化等作用，最终得到绿豆多糖MWP-1和MWP-2。
[0085] 虽然本发明已以实施例公开如上，然其并非用于限定本发明，任何本领域技术人 员，在不脱离本发明的精神和范围内，均可作各种不同的选择和修改，因此本发明的保护范 围由权利要求书及其等同形式所限定。
【主权项】
1. 一种具有免疫调节活性的绿豆多糖的制备方法，包括以下步骤： 1) 取清洗干净的绿豆，粉碎过筛，浸泡除脂，离心，收集残渣烘干，加入蒸馏水，离心，收 集上清液并浓缩； 2) 将步骤1)得到的浓缩的上清液进行脱蛋白处理，透析脱盐，冻干，得绿豆粗多糖； 3) 将步骤2)得到的绿豆粗多糖进行阴离子交换层析，490nm紫外检测，收集目的洗脱 液； 4) 将步骤3)得到的目的洗脱峰进行凝胶过滤层析，206nm紫外检测，收集洗脱峰，即为 纯化的绿?多糖。2. 根据权利要求1所述的具有免疫调节活性的绿豆多糖的制备方法，其特征在于，所述 制备方法包括以下步骤： 1) 取清洗干净的绿豆，粉碎过60目筛，95%乙醇浸泡3d除脂，离心，收集残渣烘干，加入 蒸馏水，离心，收集上清液并浓缩； 2) 将步骤1)得到的浓缩的上清液用Sevag法进行脱蛋白处理，再装入透析袋4 °C过夜透 析脱盐，冻干，得绿豆粗多糖； 3) 将步骤2)得到的绿豆粗多糖用蒸馏水溶解，13000r/min离心20min，上清液进行阴离 子交换层析，梯度洗脱后，490nm紫外检测，合并收集洗脱液，收集得到两个主峰； 4) 将步骤3)得到的目的洗脱液分别进行凝胶过滤层析，等度洗脱后，在206nm紫外检 测，分别收集得到两个目的洗脱峰，即纯化的绿豆多糖。3. 根据权利要求1或2所述的具有免疫调节活性的绿豆多糖的制备方法，其特征在于， 所述制备方法还包括： 5) 将步骤2)得到的绿豆粗多糖、步骤4)得到的纯化的绿豆多糖进行超声改性处理，得 到目的绿豆多糖。4. 根据权利要求1或2所述的具有免疫调节活性的绿豆多糖的制备方法，其特征在于， 所述步骤1)具体为： 11) 取清洗干净的绿豆，粉碎，过60目筛，按固液比1:2加入95%乙醇，浸泡3d除脂； 12) 离心收集残渣，烘干，按料液比1:4-1:10，在温度为60-90°C条件下，持续搅拌l_4h， 离心，收集上清液并浓缩。5. 根据权利要求1或2所述的具有免疫调节活性的绿豆多糖的制备方法，其特征在于， 所述步骤2)采用的Sevag法进行脱蛋白处理具体为:将浓缩的上清液与Sevage试剂按5:1混 合，振荡，离心，去蛋白；所述Sevage试剂为氯仿和正丁醇按体积比5:1混合形成。6. 根据权利要求1或2所述的具有免疫调节活性的绿豆多糖的制备方法，其特征在于， 所述步骤3)具体为： 将步骤2)得到的绿豆粗多糖用蒸馏水溶解，离心，上清液上DEAE-琼脂糖凝胶FF填料 柱，用超纯水平衡过夜，梯度洗脱，洗脱液为0-2M NaCl溶液，洗脱流速4ml/min，以8ml/管速 度自动收集，在490nm紫外检测，收集目的洗脱液，分别冻干。7. 根据权利要求1或2所述的具有免疫调节活性的绿豆多糖的制备方法，其特征在于， 所述步骤4)具体为： 将步骤3)得到的目的洗脱液分别上丙烯葡聚糖凝胶s-300填料柱，等度洗脱，洗脱液为 0.15M NaCl溶液，洗脱流速为0.5ml/min，自动收集，在206nm紫外检测，收集得到两个目的 洗脱峰，即纯化的绿豆多糖。8. 根据权利要求3所述的具有免疫调节活性的绿豆多糖的制备方法，其特征在于，所述 步骤5)的超声改性处理的反应为:将绿豆粗多糖、纯化的绿豆多糖分别用一定蒸馏水溶液 溶解在10ml烧杯中，温度在0°C恒温中，将超声波反应器的超声波探头浸入溶液15-20毫米， 设定频率在30-50kHz，500-700W，超声过程中总超声时间lmin，其中连续超声10s则中间需 间隔3s。9. 根据权利要求4所述的具有免疫调节活性的绿豆多糖的制备方法，其特征在于，所述 步骤12)的按料液比1:8;提取温度为90°C ;提取时间4h;离心条件：3500r、lOmin;烘干温度 为 60。。。10. 根据权利要求8所述的具有免疫调节活性的绿豆多糖的制备方法，其特征在于，所 述超声改性条件为:超声频率为50kHz，700W。
【文档编号】A61P37/02GK105968223SQ201610524332
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2016年7月5日
【发明人】任贵兴, 么杨, 桑伟
【申请人】中国农业科学院作物科学研究所