一种硒污染土壤修复细菌稳定剂的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种硒污染土壤修复细菌稳定剂。属于环境微生物技术领域。该稳定剂组成如下：甘油10-20份，蔗糖10-20份，葡萄糖5-10份，丁二酸钠2-6份，硝酸钠2-10份，亚硝酸钠1-8份，紫外线吸收剂5-10份，磷酸氢二钠1-10份，磷酸二氢钠1-10份，过氧化钙5-10份。该稳定剂能提高土壤中的氧气含量，能够增强细菌在修复硒污染土壤过程中的存活能力、环境适应能力和修复能力，具有较好的实际应用前景。
【专利说明】
一种砸污染土壤修复细菌稳定剂[0001]
技术领域
[0002]本发明属于环境微生物技术领域，涉及一种硒污染土壤修复细菌稳定剂。
[0003]【背景技术】
[0004]我国有些地区如湖北恩施和陕西安康则属于高硒地区，其土壤中硒含量严重超标而导致硒中毒如脱毛、贫血等情况的发生。另外，由于富硒产业的发展，在富硒农作物的生产过程中不断往土壤中施加硒制剂，使得许多农田土壤从原本缺硒或硒适量的状态转变为硒超标乃至硒污染的情况。因此，对以上情况需要进行硒污染修复治理。目前土壤硒污染治理的主要方式是植物修复，但植物生长周期长，收获植物难以处理等缺陷。近年来研究发现，许多微生物能够将土壤中毒性最强的亚硒酸钠和硒酸钠还原为毒性较低的单质纳米硒，成为植物不易吸收的状态，降低植物的含硒量，是进行硒污染土壤修复的环境友好、成本低廉的方法。
[0005]利用微生物进行硒污染环境治理的过程中，存在一个突出的问题就是硒污染环境的条件十分复杂，且土壤环境中含氧量低，受到阳光中的紫外线照射时间长，使得所采用的微生物在其中的生活力下降甚至完全不能存活，最终导致硒污染环境的微生物修复效率下降，甚至完全不能进行修复。目前市场上和文献中尚没有克服此类难题的实用技术的公开报道。因此，如开发出一种硒污染土壤修复细菌稳定剂，提高功能菌种在复杂环境中的稳定性、存活能力和除硒能力，则能有效解决修复菌种环境适应力差的问题，有效发挥微生物除硒优势和解决硒污染环境微生物修复效率低下的问题。
[0006]
【发明内容】
[0007]本发明的目的在于提供一种硒污染土壤修复细菌稳定剂。该稳定剂能增加土壤中氧气含量，提高功能菌种在复杂环境中的稳定性、存活能力和除硒能力，能有效解决修复菌种环境适应力差的问题，有效发挥微生物除硒优势和解决硒污染环境微生物修复效率低下的问题。
[0008]本发明提供的硒污染土壤修复细菌稳定剂，组成如下:甘油10-20份，蔗糖10-20 份，葡萄糖5-10份，丁二酸钠2-6份，硝酸钠2-10份，亚硝酸钠1-8份，紫外线吸收剂5-10份， 磷酸氢二钠1-10份，磷酸二氢钠1-10份，过氧化钙5-10份。
[0009]稳定剂中的紫外线吸收剂为水杨酸苯酯、2_(2~羟基-5~甲基苯基)苯并三氮唑、 邻羟基苯甲酸苯酯、2，4-二羟基二苯甲酮、2-羟基-4-甲氧基二苯甲酮、2-羟基-4-正辛氧基二苯甲酮、2-( 2 羟基-3 ’，5 二叔苯基)-5-氯化苯并三唑、单苯甲酸间苯二酚酯中的一种或几种。
[0010]本发明提供的硒污染土壤修复细菌稳定剂，能使30 cm处的土壤氧含量从12%增加至与空气氧含量相近即20%左右；能使施加到土壤中的细菌24 h后的数量达到1.2乂105-1.5 X 107个/g土壤，远大于未添加稳定剂的土壤修复细菌数量;污染土壤中的亚硒酸盐含量也较未添加稳定剂的修复土壤下降更快。因此，本发明提供的硒污染土壤修复细菌稳定剂能有效提高修复细菌的存活能力和除硒效率，具有较好的实际应用前景。
[0011]【具体实施方式】
[0012]下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明，但不用来限制本发明的范围。 实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程。下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。[〇〇13] 实施例1:硒污染土壤修复细菌稳定剂的配制:甘油10-20份，蔗糖10-20份，葡萄糖5-10份，丁二酸钠2-6份，硝酸钠2-10份，亚硝酸钠 1-8份，紫外线吸收剂5-10份，磷酸氢二钠1-10份，磷酸二氢钠1-10份，过氧化钙5-10份，将以上份数的物质充分混合均匀。
[0014]稳定剂中的紫外线吸收剂为水杨酸苯酯、2-(2~羟基-5~甲基苯基)苯并三氮唑、 邻羟基苯甲酸苯酯、2，4-二羟基二苯甲酮、2-羟基-4-甲氧基二苯甲酮、2-羟基-4-正辛氧基二苯甲酮、2-( 2 羟基-3 ’，5 二叔苯基)-5-氯化苯并三唑、单苯甲酸间苯二酚酯中的一种或几种。
[0015]实施例2:硒污染土壤修复细菌筛选与菌粉制备:修复细菌筛选:以含0.2 mM Na2Se03的LB平板为分离培养基，将采集的土壤样品稀释成10—1至10—8悬液，取适宜稀释度涂布在分离平板上，25°C培养l-15d。挑选能够还原Na2Se03 产生红色单质硒的细菌(初步判断依据为红色菌落)作为下一步研究的目标菌。将初筛获得的细菌重新接种至含与不含Na2Se03的LB平板上进一步确定是否具有还原Na2Se03产生红色单质硒的能力，记录形态并保藏。在0-100 Mm Na2Se〇3浓度梯度的LB平板上进行耐硒能力测定，挑选耐硒能力最强的菌株作为修复菌株。[〇〇16]菌粉制备:制备LB平板，划线活化修复菌株，在37°C下培养24 h;将在活化平板上生长的单菌落接种于LB液体培养基中，在37 °C下培养24 h作为种子培养液;将制备好的种子液按3%的接种量接种于含1 mM亚硒酸钠的LB液体培养基中，37°C、120 rpm培养48h。在获得的菌悬液中加入20%灭菌后的脱脂牛奶，在-20?-50°C下冷冻，在真空下干燥获得菌粉。
[0017] 应用实例一:利用制备的稳定剂与修复细菌菌粉室内试验修复硒污染土壤，检测其中修复细菌存活数量和修复效率，其过程和结果如下:A.从湖北省恩施自治州鱼塘坝高硒区选择4个地点采集高硒土壤，去除作物和杂草等的根茎叶，适当碾碎成小的土块或土壤颗粒，采集和处理时间为2015年7月6日；B.将制备的稳定剂与修复细菌菌粉按20:1的比例混合均匀；C.将B中的混合物以20g/kg土壤的比例与硒污染土壤样品充分混合；D.在混合好的B土壤样品中洒入一定的水，量以土壤湿润为宜；E.D中处理好的土壤装于塑料盆中，常温状态下放置48 h;F.另设未添加稳定剂的对照:除为添加稳定剂之外，其余过程同A-D;G.采用国标GB 15618-1995检测原始土壤样品中重金属种类和含量，采用孙奉翠等 (2013)介绍的加速溶剂萃取-固相萃取-高效液相色谱-串联质谱(ASE-SPE-HPLC-MS/MS)分析方法检测土壤样品中抗生素的种类和含量。检测后表明，采集自湖北省恩施自治州鱼塘坝的高硒土壤中的Cd2+、Ni2+、Pb2+和Co2+超过国家标准，四环素、氨苄青霉素、庆大霉素含量均大于50 yg/kg;H.采用H〇ltZClaw(1987)等介绍的方法检测湖北省恩施自治州鱼塘坝的未处理高硒土壤中+4价硒平均含量为86.21 mg/kg，处理48 h后土壤中+4价硒平均含量降低到5.1 mg/ kg，处理48 h后对照土壤中+4价平均硒含量为53.6 mg/kg;1.采用荧光显微镜计数法检测添加稳定剂处理24 h后土壤中的修复细菌细胞平均数量为1.5 X 107个/g 土壤，对照土壤中的修复细菌细胞平均数量为1.1 X 102个/g 土壤；J.利用土壤氧气含量测定仪检测添加稳定剂处理24 h后土壤中氧气平均含量为 25.6%，24 h后对照土壤中的氧气平均含量为17.2%。[〇〇18] 应用实例二:利用制备的稳定剂与修复细菌菌粉室外实地修复硒污染土壤，检测其中修复细菌存活数量和修复效率，其过程和结果如下:A.在湖北省恩施自治州鱼塘坝高硒区选择平整地块，面积约为10 mX 10 m，处理组和对照组各设3个重复，去除作物和杂草等的根茎叶，试验时间为2015年7月6日；B.将制备的稳定剂与修复细菌菌粉按20:1的比例混合均匀；C.在农田翻耕之前，将B中的混合物以10kg/亩的比例均匀撒于硒含量超标的农田中， 按常规方法对农田进行翻耕；D.另设未添加稳定剂的对照:除为添加稳定剂之外，其余过程同A-C;E.采用国标GB 15618-1995检测原始农田土壤样品中重金属种类和含量，采用孙奉翠等(2013)的加速溶剂萃取-固相萃取-高效液相色谱-串联质谱(ASE-SPE-HPLC-MS/MS)分析方法检测土壤样品中抗生素的种类和含量。检测后表明，试验农田土壤中的Cr2+、Cd2+、Ni2+、 Pb2+和Co2+超过国家标准，未检测到抗生素；卩.采用11〇1丨2〇13￥(1987)等介绍的方法检测试验土壤中+4价硒平均含量为77.5 11^/ kg，处理48 h后土壤中+4价硒平均含量降低到6.7 mg/kg，对照土壤中+4价硒含量为48.9mg/kg；G.采用荧光显微镜计数法检测添加稳定剂处理24 h后土壤中的修复细菌细胞平均数量为1.2 X 105个/g 土壤，对照土壤中的修复细菌细胞平均数量为1.2 X 102个/g 土壤；H.利用土壤氧气含量测定仪检测添加稳定剂处理24 h后30 cm深处土壤中氧气平均含量为20.1%，对照30 cm深处土壤中的氧气平均含量为11%。
【主权项】
1.一种硒污染土壤修复细菌稳定剂。2.权利要求1所述的稳定剂组成为:甘油10-20份，蔗糖10-20份，葡萄糖5-10份，丁二酸 钠2-6份，硝酸钠2-10份，亚硝酸钠1-8份，紫外线吸收剂5-10份，磷酸氢二钠1-10份，磷酸二 氢钠1-10份，过氧化妈5-10份。3.权利要求2中所述的紫外线吸收剂为水杨酸苯酯、2-(2~羟基-5?甲基苯基)苯并三 氮唑、邻羟基苯甲酸苯酯、2，4-二羟基二苯甲酮、2-羟基-4-甲氧基二苯甲酮、2-羟基-4-正 辛氧基二苯甲酮、2-( 2 羟基-3 ’，5 二叔苯基)-5-氯化苯并三唑、单苯甲酸间苯二酚酯中 的一种或几种混合。
【文档编号】B09C1/10GK105969705SQ201610612556
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2016年7月30日
【发明人】袁志辉, 周海燕, 雍婕, 程益, 肖红仕, 吴永尧
【申请人】袁志辉, 吴永尧, 湖南农业大学, 周海燕