一种碱蓬筛选制备耐碱性木聚糖酶的制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种碱蓬筛选制备耐碱性木聚糖酶的制备方法，属于耐碱性木聚糖酶制备技术领域。本发明取葡萄糖、纤维素等混合，经高温灭菌制得细菌培养基，接种短小芽孢杆菌M?26，培养得短小芽孢杆菌菌落备用，收集碱蓬茎叶碾磨后，与硫酸钾、硫酸镁混合灭菌制得空白碱蓬培养基，接种短小芽孢杆菌菌落，重复培养筛选得耐碱短小芽孢杆菌菌落，过滤得滤液，离心得上清液，与硫酸铵混合，并冰水浴处理，离心得下层沉淀，冷冻干燥制得耐碱性木聚糖酶。本发明的有益效果是：本发明制备步骤简单，生产周期缩短了11.2%，产率提高了25.6%以上；所得产品耐高温性好，耐碱性和酶活性均提高了28～30%，使用效果佳。
【专利说明】
一种碱蓬筛选制备耐碱性木聚糖酶的制备方法
技术领域
[0001]本发明涉及一种碱蓬筛选制备耐碱性木聚糖酶的制备方法，属于耐碱性木聚糖酶制备技术领域。【背景技术】
[0002]木聚糖酶在自然界分布广泛，可从动物、植物和微生物中获得。例如，海洋及陆地细菌、海洋藻类、真菌、酵母菌、瘤胃和反刍动物细菌、蜗牛、甲壳动物、陆地植物组织和各种无脊椎动物中都有木聚糖酶存在。微生物来源的木聚糖酶普遍存在于自然界中，且种类繁多，应用领域广泛，因此对微生物木聚糖酶的研究报道很多。日前研究和应用得最多的是细菌和真菌来源的木聚糖酶，其中，细菌可以产生碱性和酸性木聚糖酶，而真菌只可产生碱性木聚糖酶。真菌中以丝状真菌分泌的胞外酶最高。目前，木聚糖酶主要利用真菌和细菌等微生物进行发酵生产。木聚糖酶可以应用在酿造、饲料工业中。木聚糖酶可以分解酿造或饲料工业中的原料细胞壁以及￠-葡聚糖，降低酿造中物料的粘度，促进有效物质的释放，以及降低饲料用粮中的非淀粉多糖，促进营养物质的吸收利用，并因而更易取可溶性脂类成分。碱性木聚糖酶是在碱性条件下具有较高酶活的木聚糖酶。产生的微生物种类较多，主要是细菌产生，真菌也能产生但较少。碱性木聚糖酶主要用于造纸工业。造纸常规漂白是采用次氯酸盐法，该方法向环境中排放大量的氯气，从而污染了环境。采用碱性木聚糖酶可以代替次氯酸的漂白，从而起到环境保护的作用。但目前生产的碱性木聚糖酶生产周期长，产率低， 所得产品耐高温性差，耐碱性和酶活性低，使用效果差。
【发明内容】
[0003]本发明所要解决的技术问题:针对目前生产的碱性木聚糖酶生产周期长，产率低， 所得产品耐高温性差，耐碱性和酶活性低，使用效果差的弊端，提供了一种取葡萄糖、纤维素等混合，经高温灭菌制得细菌培养基，接种短小芽孢杆菌M-26，培养得短小芽孢杆菌菌落备用，收集碱蓬茎叶碾磨后，与硫酸钾、硫酸镁混合灭菌制得空白碱蓬培养基，接种短小芽孢杆菌菌落，重复培养筛选得耐碱短小芽孢杆菌菌落，过滤得滤液，离心得上清液，与硫酸铵混合，并冰水浴处理，离心得下层沉淀，冷冻干燥制得耐碱性木聚糖酶的方法。本发明通过耐碱植物碱蓬浆液作为发酵碳源，由于其组织液含碱量较高，进行筛选制备耐碱性木聚糖酶，同时制备步骤简单，产率高，所得产品耐高温性好，耐碱性和酶活性高。
[0004]为解决上述技术问题，本发明采用如下所述的技术方案是:(1)按重量份数计，分别称量55?75份去离子水、10?20份葡萄糖、5?10份纤维素和5 ?10份硫酸镁置于培养皿中，搅拌混合并置于l〇〇°C下高温灭菌处理10?15min，静置冷却制备得细菌培养基，再按接种量10%，将短小芽孢杆菌M-26接种至上述制备的细菌培养基中，将其置于37°C下，按200?220r/min摇床振荡培养2?3天，培养得短小芽孢杆菌菌落，备用；(2)收集碱蓬茎叶，对其洗净并碾磨成碱蓬浆液，随后按重量份数计，分别称量55?75份碱蓬浆液、5?10份磷酸钾和5?10份硫酸镁搅拌混合并置于培养皿中，在紫外灯下灭菌处理15?20min后，制备得空白碱蓬培养基；(3)按接种量10%，分别将步骤(1)培养的短小芽孢杆菌菌落接种至5份相同质量上述制备的空白碱蓬培养基上，控制培养温度为37°C，在200?220r/min下分别摇床振荡培养2?3 天；(4)待培养完成后，选取菌丝生长最茂盛的菌落，再按接种量10%，分别接种至5份相同质量、步骤(2)制备的空白碱蓬培养基上，保持培养条件不变，继续筛选得生长最茂盛的菌落，随后重复上述步骤，筛选3?5代，筛选得耐碱短小芽孢杆菌菌落；(5)对上述制备的耐碱短小芽孢杆菌菌落过滤并收集滤液，将滤液置于7500?8000r/ min下离心分离10?15min，收集上层清液，再按固液比1:5,将硫酸铵添加至上层清液中，搅拌混合并至于0?5 °C下冰水浴处理1?2h，待处理完成后，将其置于8800?10000r/min下离心分离10?15min，收集下层沉淀并对其真空冷冻干燥，即可制备得一种耐碱性木聚糖酶。
[0005]本发明的应用方法:将本发明制得的耐碱性木聚糖酶添加至质量浓度为7?8%纸浆中，添加量为42?46g/T，控制温度为50?55°C，纸浆pH为7.5?8.5，在80以1^11下搅拌均匀，静置50?60min，即可。该耐碱性木聚糖酶耐碱性和酶活性高，耐高温性好，使用后可有效提高纸浆的漂白率，减少化学漂白剂的用量，值得推广与使用。
[0006]本发明与其他方法相比，有益技术效果是:(1)本发明制备步骤简单，生产周期缩短了 11.2%，产率提高了 25.6%以上；(2)所得产品耐高温性好，耐碱性和酶活性均提高了 28?30%，使用效果佳。【具体实施方式】
[0007]首先按重量份数计，分别称量55?75份去离子水、10?20份葡萄糖、5?10份纤维素和5?10份硫酸镁置于培养皿中，搅拌混合并置于100°C下高温灭菌处理10?15min，静置冷却制备得细菌培养基，再按接种量10%，将短小芽孢杆菌M-26接种至上述制备的细菌培养基中，将其置于37°C下，按200?220r/min摇床振荡培养2?3天，培养得短小芽孢杆菌菌落， 备用；然后收集碱蓬茎叶，对其洗净并碾磨成碱蓬浆液，随后按重量份数计，分别称量55? 75份碱蓬浆液、5?10份磷酸钾和5?10份硫酸镁搅拌混合并置于培养皿中，在紫外灯下灭菌处理15?20min后，制备得空白碱蓬培养基;再按接种量10%，分别将培养的短小芽孢杆菌菌落接种至5份相同质量上述制备的空白碱蓬培养基上，控制培养温度为37°C，在200? 220r/min下分别摇床振荡培养2?3天;待培养完成后，选取菌丝生长最茂盛的菌落，再按接种量10%，分别接种至5份相同质量、制备的空白碱蓬培养基上，保持培养条件不变，继续筛选得生长最茂盛的菌落，随后重复上述步骤，筛选3?5代，筛选得耐碱短小芽孢杆菌菌落； 最后对上述制备的耐碱短小芽孢杆菌菌落过滤并收集滤液，将滤液置于7500?8000r/min 下离心分离10?15min，收集上层清液，再按固液比1:5,将硫酸铵添加至上层清液中，搅拌混合并至于〇?5°C下冰水浴处理1?2h，待处理完成后，将其置于8800?10000r/min下离心分离10?15min，收集下层沉淀并对其真空冷冻干燥，即可制备得一种耐碱性木聚糖酶。
[0008]实例 1首先按重量份数计，分别称量55份去离子水、20份葡萄糖、10份纤维素和10份硫酸镁置于培养皿中，搅拌混合并置于100°C下高温灭菌处理10min，静置冷却制备得细菌培养基，再按接种量10%，将短小芽孢杆菌M-26接种至上述制备的细菌培养基中，将其置于37°C下，按 200r/min摇床振荡培养2天，培养得短小芽孢杆菌菌落，备用;然后收集碱蓬茎叶，对其洗净并碾磨成碱蓬浆液，随后按重量份数计，分别称量55份碱蓬浆液、5份磷酸钾和5份硫酸镁搅拌混合并置于培养皿中，在紫外灯下灭菌处理15min后，制备得空白碱蓬培养基;再按接种量10%，分别将培养的短小芽孢杆菌菌落接种至5份相同质量上述制备的空白碱蓬培养基上，控制培养温度为37°C，在200r/min下分别摇床振荡培养2天;待培养完成后，选取菌丝生长最茂盛的菌落，再按接种量10%，分别接种至5份相同质量、制备的空白碱蓬培养基上，保持培养条件不变，继续筛选得生长最茂盛的菌落，随后重复上述步骤，筛选3代，筛选得耐碱短小芽孢杆菌菌落;最后对上述制备的耐碱短小芽孢杆菌菌落过滤并收集滤液，将滤液置于7500r/min下离心分离lOmin，收集上层清液，再按固液比1:5,将硫酸铵添加至上层清液中，搅拌混合并至于〇°C下冰水浴处理lh，待处理完成后，将其置于8800r/min下离心分离 lOmin，收集下层沉淀并对其真空冷冻干燥，即可制备得一种耐碱性木聚糖酶。
[0009]将本发明制得的耐碱性木聚糖酶添加至粘度为7%纸浆中，添加量为42g/T，控制温度为50°C，纸浆pH为7.5,在80r/min下搅拌均匀，静置50min，即可。该耐碱性木聚糖酶耐碱性和酶活性高，耐高温性好，使用后可有效提高纸浆的漂白率，减少化学漂白剂的用量，值得推广与使用。
[0010]实例2首先按重量份数计，分别称量65份去离子水、15份葡萄糖、8份纤维素和8份硫酸镁置于培养皿中，搅拌混合并置于l〇〇°C下高温灭菌处理13min，静置冷却制备得细菌培养基，再按接种量10%，将短小芽孢杆菌M-26接种至上述制备的细菌培养基中，将其置于37°C下，按 210r/min摇床振荡培养3天，培养得短小芽孢杆菌菌落，备用;然后收集碱蓬茎叶，对其洗净并碾磨成碱蓬浆液，随后按重量份数计，分别称量65份碱蓬浆液、8份磷酸钾和7份硫酸镁搅拌混合并置于培养皿中，在紫外灯下灭菌处理18min后，制备得空白碱蓬培养基;再按接种量10%，分别将培养的短小芽孢杆菌菌落接种至5份相同质量上述制备的空白碱蓬培养基上，控制培养温度为37°C，在210r/min下分别摇床振荡培养3天;待培养完成后，选取菌丝生长最茂盛的菌落，再按接种量10%，分别接种至5份相同质量、制备的空白碱蓬培养基上，保持培养条件不变，继续筛选得生长最茂盛的菌落，随后重复上述步骤，筛选4代，筛选得耐碱短小芽孢杆菌菌落;最后对上述制备的耐碱短小芽孢杆菌菌落过滤并收集滤液，将滤液置于7750r/min下离心分离13min，收集上层清液，再按固液比1:5,将硫酸铵添加至上层清液中，搅拌混合并至于3°C下冰水浴处理2h，待处理完成后，将其置于8900r/min下离心分离 13min，收集下层沉淀并对其真空冷冻干燥，即可制备得一种耐碱性木聚糖酶。
[0011]将本发明制得的耐碱性木聚糖酶添加至粘度为8%纸浆中，添加量为44g/T，控制温度为53°C，纸浆pH为8.0,在80r/min下搅拌均匀，静置55min，即可。该耐碱性木聚糖酶耐碱性和酶活性高，耐高温性好，使用后可有效提高纸浆的漂白率，减少化学漂白剂的用量，值得推广与使用。
[0012]实例3首先按重量份数计，分别称量75份去离子水、10份葡萄糖、5份纤维素和5份硫酸镁置于培养皿中，搅拌混合并置于l〇〇°C下高温灭菌处理15min，静置冷却制备得细菌培养基，再按接种量10%，将短小芽孢杆菌M-26接种至上述制备的细菌培养基中，将其置于37°C下，按220r/min摇床振荡培养3天，培养得短小芽孢杆菌菌落，备用;然后收集碱蓬茎叶，对其洗净并碾磨成碱蓬浆液，随后按重量份数计，分别称量75份碱蓬浆液、10份磷酸钾和10份硫酸镁搅拌混合并置于培养皿中，在紫外灯下灭菌处理20min后，制备得空白碱蓬培养基;再按接种量10%，分别将培养的短小芽孢杆菌菌落接种至5份相同质量上述制备的空白碱蓬培养基上，控制培养温度为37°C，在220r/min下分别摇床振荡培养3天;待培养完成后，选取菌丝生长最茂盛的菌落，再按接种量10%，分别接种至5份相同质量、制备的空白碱蓬培养基上，保持培养条件不变，继续筛选得生长最茂盛的菌落，随后重复上述步骤，筛选5代，筛选得耐碱短小芽孢杆菌菌落;最后对上述制备的耐碱短小芽孢杆菌菌落过滤并收集滤液，将滤液置于8000r/min下离心分离15min，收集上层清液，再按固液比1:5，将硫酸铵添加至上层清液中，搅拌混合并至于5°C下冰水浴处理2h，待处理完成后，将其置于lOOOOr/min下离心分离 15min，收集下层沉淀并对其真空冷冻干燥，即可制备得一种耐碱性木聚糖酶。[〇〇13]将本发明制得的耐碱性木聚糖酶添加至粘度为8%纸浆中，添加量为46g/T，控制温度为55°C，纸浆pH为8.5,在80r/min下搅拌均匀，静置60min，即可。该耐碱性木聚糖酶耐碱性和酶活性高，耐高温性好，使用后可有效提高纸浆的漂白率，减少化学漂白剂的用量，值得推广与使用。
【主权项】
1.一种碱蓬筛选制备耐碱性木聚糖酶的制备方法，其特征在于具体制备步骤为:(1)按重量份数计，分别称量55?75份去离子水、10?20份葡萄糖、5?10份纤维素和5 ?10份硫酸镁置于培养皿中，搅拌混合并置于l〇〇°C下高温灭菌处理10?15min，静置冷却 制备得细菌培养基，再按接种量10%，将短小芽孢杆菌M-26接种至上述制备的细菌培养基 中，将其置于37°C下，按200?220r/min摇床振荡培养2?3天，培养得短小芽孢杆菌菌落，备 用；(2)收集碱蓬茎叶，对其洗净并碾磨成碱蓬浆液，随后按重量份数计，分别称量55?75 份碱蓬浆液、5?10份磷酸钾和5?10份硫酸镁搅拌混合并置于培养皿中，在紫外灯下灭菌 处理15?20min后，制备得空白碱蓬培养基；(3)按接种量10%，分别将步骤(1)培养的短小芽孢杆菌菌落接种至5份相同质量上述制 备的空白碱蓬培养基上，控制培养温度为37°C，在200?220r/min下分别摇床振荡培养2?3 天；(4)待培养完成后，选取菌丝生长最茂盛的菌落，再按接种量10%，分别接种至5份相同 质量、步骤(2)制备的空白碱蓬培养基上，保持培养条件不变，继续筛选得生长最茂盛的菌 落，随后重复上述步骤，筛选3?5代，筛选得耐碱短小芽孢杆菌菌落；(5)对上述制备的耐碱短小芽孢杆菌菌落过滤并收集滤液，将滤液置于7500?8000r/ min下离心分离10?15min，收集上层清液，再按固液比1:5,将硫酸铵添加至上层清液中，搅 拌混合并至于0?5 °C下冰水浴处理1?2h，待处理完成后，将其置于8800?10000r/min下离 心分离10?15min，收集下层沉淀并对其真空冷冻干燥，即可制备得一种耐碱性木聚糖酶。
【文档编号】C12R1/08GK105969752SQ201610484353
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2016年6月28日
【发明人】郭迎庆, 盛海丰, 高玉刚
【申请人】郭迎庆