幽门螺杆菌感染个体化治疗基因芯片、制造方法及检测方法

幽门螺杆菌感染个体化治疗基因芯片、制造方法及检测方法
【专利摘要】本发明公开了一种幽门螺杆菌感染个体化治疗基因芯片、制造方法及检测方法，基因芯片包括：幽门螺杆菌23s rRNA基因上克拉霉素耐药突变位点A2142G和A2143G对应的野生型和突变型SNP分型寡合核苷酸探针；幽门螺杆菌gyrA基因上喹诺酮耐药突变位点N87K,D91G,D91N对应的野生型和突变型SNP分型寡合核苷酸探针：人细胞色素酶P450上质子泵抑制剂代谢相关的CYP2C19*2（G681A）和CYP2C19*3（G636A）两个位点对应的野生型和突变型SNP分型寡合核苷酸探针。本发明的基因芯片和检测方法能够同时检测CYP2C19基因多态性及HP对克拉霉素和喹诺酮的耐药性，其特异性和灵敏性好，重现性好，检测快速。
【专利说明】
幽门螺杆菌感染个体化治疗基因芯片、制造方法及检测方法
技术领域
[0001 ]本发明涉及幽门螺杆菌检测技术，尤其涉及一种幽门螺杆菌感染个体化治疗基因 芯片及检测方法。
【背景技术】
[0002] 全球半数以上人口感染幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，H.pylori，HP)，中国 是一个Η. pylori感染率较高的国家，达56.22 %，某些地区高达77.22 %。几乎所有感染幽门 螺杆菌的人均患有慢性胃炎，只有少数会发展成为消化性溃疡，而其中有约1%_2%发展成 为胃癌。幽门螺杆菌感染与临床消化道疾病发生发展密切相关，如慢性胃炎，消化性溃疡， 十二指肠溃疡，胃癌和淋巴细胞增生等。1994年WHO将HP列为I类致癌因子。研究表明，幽门 螺杆菌感染为胃癌发生的病因，对幽门螺杆菌的根除可明显降低人群胃癌的发生风险。因 此，HP感染的根除治疗一直是HP研究领域中的重点和热点，具有重要的临床意义。
[0003] HP耐药是全球性问题，是HP根治率下降的主要原因。以质子栗抑制剂(PPI)结合阿 莫西林和克拉霉素（或甲硝唑）的三联疗法，是国内外公认的一线抗HP感染治疗组合。喹诺 酮类药物是HP根治的二线药物。抗HP治疗的疗效主要受到以下两个因素影响：一是抗生素 耐药，由于近年来抗生素的滥用，克拉霉素、甲硝唑、喹诺酮耐药不断上升，使得三联疗法或 喹诺酮的有效率下降；另外一个重要因素是PPI的使用。PPI代谢与人细胞色素 P450 (CYP2C19)同工酶CYP2C19密切相关，CYP2C19的基因多态性(强代谢、中代谢和弱代谢)决定 了PPI在人体内的代谢速度。因此，在使用三联疗法之前，提供准确的抗生素耐药信息和 CYP2C19的类型，针对性地选择药物进行个体化用药，能够提高幽门螺杆菌根除率，同时减 少抗生素滥用带来的不良反应和资源浪费。
[0004] 人CYP2C19基因多态性及HP克拉霉素耐药主要是由于相关基因的单核苷酸多态性 (SNP)导致的。传统的培养和药敏试验方法，对实验室和操作人员的要求高，耗时长（1-2 周），工作量大，且不能提供人CYP2C19多态性信息。PCR等快速检测方法灵敏度高、特异性 强，但检测通量较低，一次试验仅能检测2-3个靶点，不能完全满足临床实际需要。目前还没 有可以同时检测CYP2C19基因多态性及HP耐药性的产品获批，因此，十分有必要开发能够同 时检测CYP2C19基因多态性及HP耐药性的产品，此类产品具有广阔的应用前景。

【发明内容】

[0005] 本发明目的是提供一种检测CYP2C19基因多态性及HP耐药性的产品及检测方法。
[0006] 本发明的技术方案为:一种幽门螺杆菌感染个体化治疗基因芯片，其特征在于，基 因芯片包括：
[0007] (1)幽门螺杆菌23s rRNA基因上克拉霉素耐药突变位点A2142G和A2143G对应的野 生型和突变型SNP分型寡合核苷酸探针:A2142G、A2143G野生型和突变型的核苷酸序列分别 为SEQ ID No:7、SEQ ID No:8、SEQ ID No:9和SEQ ID No:10;
[0008] (2)幽门螺杆菌gyrA基因上喹诺酮耐药突变位点N87K、D91G，D91N对应的野生型和 突变型SNP分型寡合核苷酸探针:N87K和D91G，D91N野生型和突变型的核苷酸序列分别为 SEQ ID No:ll、SEQ ID No:12、SEQ ID No:13、SEQ ID No:14、SEQ ID No:15、SEQ ID No: 16、SEQ ID No:17;
[0009] (3)人细胞色素酶P450上质子栗抑制剂代谢相关的CYP2C19*2(G681A)和CYP2C19* 3(G636A)两个位点对应的野生型和突变型SNP分型寡合核苷酸探针:CYP2C19*2和CYP2C19* 3野生型和突变型的核苷酸序列分别为SEQ ID No:3、SEQ ID No:4、SEQ ID No:5、SEQ ID No:6〇
[0010] 基因芯片上的探针阵列为SEQ ID No:1-19的寡核苷酸探针，形成8X8的矩形阵列。
[0011] -种幽门螺杆菌感染个体化治疗基因芯片的制造方法，包括如下步骤：
[0012] (1)合成SEQ ID No :1-19寡核苷酸探针；
[0013] (2)将合成好的探针用无菌超纯水稀释溶解；
[0014] (3)在稀释的探针溶液中加入点样液，点样液的量与探针溶液等量的2倍；
[0015] ⑷用点样仪将加入点样液的探针溶液点至基因芯片的空白载体上；
[0016] (5)点制好探针的基因芯片置于室温下干燥至少18h。
[0017] 氨基修饰所有寡核苷酸探针的3'端，氨基与探针的连接由间隔臂完成。
[0018] -种幽门螺杆菌感染个体化治疗基因芯片的检测方法，包括如下步骤：
[0019] ⑴从胃粘膜中提取样品DNA;
[0020] (2)在多重PCR体系中对样品DNA进行PCR扩增获得PCR扩增产物;PCR反应条件为： 预变性:95 °C，15min;变性:94°C，20s;退火:65 °C，60s;延伸：72 °C，5min;
[0021] (3)将PCR扩增产物与杂交液等量混合后加至基因芯片反应区，覆盖探针阵列，45 °C水浴中反应lh;
[0022] (4)杂交后的芯片依次在洗液A(1 X SSC，0 · 2 % SDS)，洗液B(0 · 2 X SSC)和洗液C (0.1 X SSC)中于室温条件下各洗涤60s，置室温晾干；
[0023] (5)在基因芯片反应区加入的Streptavidin-Nanogold(Nanoprobes) (1 · 6μg/ml， 稀释液成分：1 x PBS+0.1 %BSA)，37 °C水浴放置30min;取出后用PBST洗液（1 x PBS+0.05 % TWeen20)清洗30s，重复3次，用去离子水冲洗，置室温晾干;将银染试剂A液(醋酸银的水溶 液，浓度为4mg/ml)和B液(氢醌的柠檬酸缓冲液溶液，浓度为10mg/ml)等体积混合，在芯片 反应区避光加入30yL的银染试剂A，B混合液，待芯片上出现明显可视化信号后停止显色，显 色2-5min，用去离子水清洗，晾干；
[0024] (6)芯片杂交信号使用可视化生物芯片扫描仪(Micro View)进行扫描；
[0025] (7)根据各探针的显色信号进行阳性判断，当一条探针的平均灰度值是对应的另 外探针的两倍及以上时，判断该条探针为阳性，对应位点为纯合子；当一条探针的平均灰度 值与对应的另外探针的平均灰度值比值小于2时，判断此位点判为杂合。
[0026] PCR扩增产物与杂交液混合前，在94°C条件下变性5min后，立即置于冰水浴中 5min〇
[0027]从胃粘膜中提取样品DNA的方法为：
[0028] (1)用DNA提取液与胃粘膜1:1等体积混合，经过100°C空气浴加热lOmin;
[0029] (2)冰浴或4°C冷却30min，13000rpm/min离心5min，上清液转移到新离心管中-20 °C冻存获得样品DNA。
[0030] 有益效果：
[0031] 本发明的基因芯片和检测方法能够同时检测CYP2C19基因多态性及HP对克拉霉素 和喹诺酮的耐药性，其特异性和灵敏性好，重现性好，检测快速。能够通过一步检测就能得 到CYP2C19基因多态性的信息和HP对克拉霉素和喹诺酮的耐药性的信息，时间只需要6-7h， 而传统的药敏实验需要2个星期，大大缩短了诊断的时间，有利于医生对病人进行快速且正 确的治疗，并且真正体现了个体化治疗的意义。
[0032] 整个方法中所用到可视化检测技术大大地降低了检测的成本，不再需要昂贵的检 测仪器，有利于在基层医院的开展，有利于更好地普及这项工作，对于地区抗生素耐药的监 测也是非常有利的。
【附图说明】：
[0033] 图1是基因芯片上寡合核苷酸探针的矩阵排列图
[0034] (1:野生;1:突变;1^:突变为六 ;1?；:突变为6;?〇(：:阳性质控;觸(： ：阴性质控;阶(：:空 白对照）
[0035] 图2是PCR体系优化部分反应和阴性对照结果图
[0036] 图3是PCR体系优化中筛选退火温度的结果图
[0037] 图4是PCR体系优化中筛选退火延伸时间的结果图
[0038] 图5是PCR体系优化中筛选循环数的结果图 [0039]图6是基因芯片杂交液优化结果图 [0040]图7是基因芯片灵敏度评价结果图，其中：
[0041 ] A:1X102CFU/ml；B:1X103CFU/ml；C:1X104CFU/ml；D:1X10 5CFU/ml；E:blank control；F:lOng/μΙ.；G:5ng/yl；H:2ng/yl；I:lng/μL)
[0042]图8是芯片重复性评价结果图，其中：
[0043] A，B，C为同一芯片的三次结果;D，E为不同于A，B，C的另两张芯片结果;F为空白对 照
[0044] 图9是部分临床样本基因芯片杂交结果图
[0045] 图10是图9中的E结果的测序峰图
【具体实施方式】
[0046] 实施例
[0047] 本发明的技术方案为:一种幽门螺杆菌感染个体化治疗基因芯片，其特征在于，基 因芯片包括：
[0048] (1)幽门螺杆菌23s rRNA基因上克拉霉素耐药突变位点A2142G和A2143G对应的野 生型和突变型SNP分型寡合核苷酸探针:A2142G、A2143G野生型和突变型的核苷酸序列分别 为SEQ ID No:7、SEQ ID No:8、SEQ ID No:9和SEQ ID No:10;
[0049] (2)幽门螺杆菌gyrA基因上喹诺酮耐药突变位点N87K、D91G，D91N对应的野生型和 突变型SNP分型寡合核苷酸探针:N87K和D91G，D91N野生型和突变型的核苷酸序列分别为 SEQ ID No:ll、SEQ ID No:12、SEQ ID No:13、SEQ ID No:14、SEQ ID No:15、SEQ ID No: 16、SEQ ID No:17;
[0050] (3)人细胞色素酶P450上质子栗抑制剂代谢相关的CYP2C19*2(G681A)和CYP2C19* 3(G636A)两个位点对应的野生型和突变型SNP分型寡合核苷酸探针:CYP2C19*2和CYP2C19* 3野生型和突变型的核苷酸序列分别为SEQ ID No:3、SEQ ID No:4、SEQ ID No:5、SEQ ID No:6〇
[0051 ]基因芯片上的探针阵列为SEQ ID N〇:l-19的寡核苷酸探针，形成8X8的矩形阵列， 如图1所示。
[0052] 一种幽门螺杆菌感染个体化治疗基因芯片的制造方法，包括如下步骤：
[0053] (1)合成SEQ ID No :1-19寡核苷酸探针；
[0054] (2)将合成好的探针用无菌超纯水稀释溶解；
[0055] (3)在稀释的探针溶液中加入点样液，点样液的量与探针溶液等量的2倍；
[0056] (4)用点样仪将加入点样液的探针溶液点至基因芯片的空白载体上；
[0057] (5)点制好探针的基因芯片置于室温下干燥至少18h。
[0058] 氨基修饰所有寡核苷酸探针的3'端，氨基与探针的连接由间隔臂完成。
[0059] -种幽门螺杆菌感染个体化治疗基因芯片的检测方法，包括如下步骤：
[0060] (1)从胃粘膜中提取样品DNA;
[0061] (2)在多重PCR体系中对样品DNA进行PCR扩增获得PCR扩增产物;PCR反应条件为： 预变性:95 °C，15min;变性:94°C，20s;退火:65 °C，60s;延伸：72 °C，5min;
[0062] (3)将PCR扩增产物与杂交液等量混合后加至基因芯片反应区，覆盖探针阵列，45 °C水浴中反应lh;
[0063] (4)杂交后的芯片依次在洗液A(1 X SSC，0 · 2 % SDS)，洗液B(0 · 2 X SSC)和洗液C (0.1 X SSC)中于室温条件下各洗涤60s，置室温晾干；
[0064] (5)在基因芯片反应区加入的Streptavidin-Nanogold(Nanoprobes) (1 · 6μg/ml， 稀释液成分：1 xPBS+0.1 %BSA)，37°C水浴放置30min;取出后用PBST洗液（1 X PBS+0.05% TWeen20)清洗30s，重复3次，用去离子水冲洗，置室温晾干;将银染试剂A液(醋酸银的水溶 液，浓度为4mg/ml)和B液(氢醌的柠檬酸缓冲液溶液，浓度为10mg/ml)等体积混合，在芯片 反应区避光加入30yL的银染试剂A，B混合液，待芯片上出现明显可视化信号后停止显色，显 色2-5min，用去离子水清洗，晾干；
[0065] (6)芯片杂交信号使用可视化生物芯片扫描仪(Micro View)进行扫描；
[0066] (7)根据各探针的显色信号进行阳性判断，当一条探针的平均灰度值是对应的另 外探针的两倍及以上时，判断该条探针为阳性，对应位点为纯合子；当一条探针的平均灰度 值与对应的另外探针的平均灰度值比值小于2时，判断此位点判为杂合。
[0067] PCR扩增产物与杂交液混合前，在94°C条件下变性5min后，立即置于冰水浴中 5min〇
[0068]从胃粘膜中提取样品DNA的方法为：
[0069] (1)用DNA提取液与胃粘膜1:1等体积混合，经过100°C空气浴加热10min;
[0070] (2)冰浴或4°〇冷却3〇111；[11，13000印111/111；[11离心5111；[11，上清液转移到新离心管中-20 。(:冻存获得样品DNA。
[0071 ]基因芯片上的寡合核苷酸探针序列表如表1所示：
[0072]表1寡合核苷酸探针序列表
[0074]上述幽门螺杆菌感染个体化治疗基因芯片的制造完成后，使用该基因芯片进行检 测的过程如下：
[0075] 1、提取样品DNA(样品预处理）
[0076]样品（模板)DNA需要从胃粘膜、质粒及菌株(后面对基因芯片进行质量控制研究是 所需要的参照品）中提取而得。我们在实验中发现不同的提取方法对PCR的影响很大，本实 验研究比较了三种DNA提取方法:一步法、两步法和改良盐析法。选取等份的质粒、菌株及胃 粘膜样本分别采用下述3种提取方法提取，取5μ1 DNA模板加入多重PCR体系中，产物杂交后 比较信号强度。
[0077]基因组DNA模板的提取：
[0078] 1.-步法：
[0079] (1)用配制的DNA提取液分别与质粒菌、菌株、或胃粘膜及其培养液1:1等体积混 合，经过l〇〇°C空气浴加热lOmin;
[0080] (2)冰浴或4°〇冷却3〇111；[11，13000印111/111；[11离心5111；[11，上清液转移到新离心管中-20 °C冻存。
[0081] 2.两步法：
[0082] (1)用配制的DNA提取液分别与质粒菌、菌株或胃粘膜及其培养液1:1等体积混合， 100°(：空气浴1〇111丨11，4°(：放置3〇11^11;
[0083] (2)室温下 13000rpm/min，离心 5min;
[0084] (3)上清放入新EP管中，-20°C冻存备用。（幽门螺杆菌DNA);
[0085] (4)在沉淀中加入5ul蛋白酶K，55 °C水浴30min;
[0086] (5)13000rpm/min,5min；
[0087] (6)上清-20 °C冻存备用（人基因组DNA)
[0088] 3.改良盐析法：
[0089] (1)将胃粘膜吸入干净0 · 5ulEP管中，加入50ulDNA提取液，100Γ煮沸lOmin，4Γ放 置30min;
[0090] (2)室温下离心，13000rpm/min，2min;
[0091] (3)上清放入新EP管中，-20°C冻存备用。（幽门螺杆菌DNA);
[0092] (4)在沉淀中加入196u 1TKM，混匀后，加15ul，10 % SDS，3u 1蛋白酶K，55 °C，水浴 30min；
[0093] (5)取出后加入75ul饱和NaCl溶液，充分摇匀，13000rpm/min，5min;
[0094] (6)将上清转移到新的干净EP管中，加入290ul异丙醇，充分摇匀；
[0095] (7)离心，13000rpm/min，lmin，尽可能去除上清；
[0096] (8)室温干燥后，用50ulTE缓冲液溶解，-20 °C冻存备用（人基因组DNA)。
[0097]为考察不同提取方法对PCR扩增结果的影响，同时采用上述三种方法提取同种基 因组DNA，然后分别取等量模板，平行扩增。然后用提取时间、信号强弱等指标评价提取方法 的优劣。最终采用一步法进行样品DNA的提取。
[0098] 2、多重PCR体系的建立及优化
[0099] 样品DNA提取后需要进行PCR扩增，而不同的多种PCR体系对基因芯片检测灵敏度 有影响，因此，需要对PCR体系进行研究。
[0100]本
【申请人】采用正交试验设计的方法，从引物、模板DNA、Mg2+、Taq DNA聚合酶7个因 素4个水平进行多角度筛选优化PCR反应体系。
[01 01 ]按照正交实验表的编号和条件对四重PCR体系进行优化，引物1、2、3、4标示的浓度 分别为23s冰熟47^、0￥?2(：19*2、0￥?2(：19*3的上下游引物浓度。选择的依据为:首先是尽 可能不出现非特异性信号；其次，不同组合信号的灰度值达到最高。经统计分析，引物最佳 反应浓度为13号，见图2。
[0102] (1)优化退火温度
[0103] 将四重双温扩增法的退火温度分别设定为63°C，65°C，67°C，经实验验证得出最佳 退火温度为65 °C，实验结果见图3，63 °C、65 °C、67 °C阴性。
[0104] (2)优化退火延伸时间
[0105] 将四重双温扩增法的退火延伸时间分别设定为65°(：:9〇8,75 8,6〇8。经实验验证得 出最佳延伸时间为60s，实验结果见图4。
[0106] (3)优化循环数
[0107]将四重双温扩增法的条件设为65°C，60s，循环数分别设定为44，46，48，50。
[0108] 经实验验证得出最佳循环数确定为44个，实验结果见图5。
[0109]综合上述结果，幽门螺杆菌感染个体化治疗基因芯片的四重PCR体系的组份见表 4〇
[011 0]表4幽门螺杆菌感染个体化治疗基因芯片检测试剂盒的四重PCR体系组成 [0111]
[0113] 注:buf f er 在 25μ 1 的终浓度为 1 ΟΟμπιο 1 /L。
[0114] 最终确定的幽门螺杆菌感染个体化治疗基因芯片检测试剂盒的四重PCR反应条 件:95°C，变性15min;然后95°C，30s;65°C，lmin;运行44个循环;最后在72°C，延伸5min。
[0115] 3、基因芯片的杂交、洗涤和可视化检测
[0116] (1)在同一体系中，按优化好的PCR反应条件扩增目的片段；
[0117] (2)将样品DNA扩增产物在94°C条件下变性5min后，立即置于冰水浴中5min，以形 成单链便于杂交反应。
[0118] (3)用0.2 % SDS漂洗新点制好的芯片，持续lmin，然后用无菌水漂洗芯片lmin，室 温自然晾干后备用；
[0119] (4)杂交：扩增产物与杂交液（2 X SSC，1 · 2 % SDS，10 % 甲酰胺，10 % 50 X Denhard ' s)各取5yL混匀，将10yL混合液加至芯片反应区，覆盖探针阵列，芯片放入杂交盒内，45°C水 浴中反应lh;
[0120] (5)清洗:杂交后的芯片依次在洗液A(1 X SSC，0.2 % SDS)，洗液B(0.2 X SSC)和洗 液C(0.1 X SSC)中于室温条件下各洗涤60s，置室温晾干。
[0121 ] (6)可视化检测：在芯片反应区加入10yL 的Streptavidin-Nanogold(Nanoprobes) (1.6μg/ml，稀释液成分：1 X roS+0.1 %BSA)，37°C水浴放置30min;取出后用TOST洗液（1 X roS+0.05%Tween20)清洗30s，重复3次，用去离子水冲洗，置室温晾干。将银染试剂A液(醋 酸银的水溶液，浓度为4mg/ml)和B液(氢醌的梓檬酸缓冲液溶液，浓度为10mg/ml)等体积混 合，每个芯片反应区立即避光加入30yL的A，B混合液，待芯片上出现明显可视化信号后停止 显色，显色2-5min，用去离子水清洗，晾干。
[0122] (7)芯片杂交信号使用可视化生物芯片扫描仪(Micro View)进行扫描，并分析结 果。
[0123] 由于芯片的分析结果取决于标记的单链靶基因和探针分子的结合程度，这种分子 间互补作用成为影响芯片质量的关键。杂交效率和强度则受到探针及靶基因的序列组成、 长度、二级结构、同源性等问题，以及杂交反应中的pH值、盐离子浓度等因素的影响。表7试 分析杂交反应中这些影响因素的干扰作用。概括起来主要有三方面:第一为靶基因，涉及基 因的标记效率，序列组成问题；第二是探针问题，关乎探针序列组成及长度等问题；最后是 有关杂交液成分，包括PH值和盐离子浓度等，以及温度等杂交环境问题。决定杂交反应成败 的首要问题是探针，所以本
【申请人】对杂交环境进行了优化。
[0124] 本基因芯片的杂交液由SDS、SSC和Denhardt组成。SDS对杂交混合物的均匀分布发 挥促进作用，同时可以对杂交背景的降低，杂交严谨性的提高有一定效应;SSC的浓度过高 会降低杂交反应的严谨性，但是会提高信号强度，同时SSC还能提供杂交所需的盐离子。因 此，本实验也对杂交液中SDS和SSC浓度进行了优化。
[0125] (l)SDS浓度的优化
[0126] 在其他组分浓度不变的前提下，用10 %的SDS分别配制了 SDS含量为0.8%、1.0 %、 1.2 %的杂交液，选择标准菌株参考品基因组DNA为模板扩增的非对称PCR产物，比较使用不 同配比杂交液杂交后探针的信号值。
[0127] (2)SSC浓度的优化
[0128] 在其他组分浓度不变的前提下，用20 X SSC分别配置了 SSC浓度为0.5 X SSC、1 X SSC、2 X SSC的杂交液，选择标准菌株参考品基因组DNA为模板扩增的非对称PCR产物，比较 使用不同配比杂交液杂交后探针的信号值。
[0129] 优化配比见表7,杂交结果见图6。经筛选确定9号为最终杂交液配比。
[0130] 表7杂交液成分优化表
[0133] 4、结果判读
[0134] 在杂交反应中，完全匹配和非完全匹配的寡核苷酸区分的特异性受到了一定的限 制，当许多不同的寡核苷酸在同一条件下进行杂交反应时，这种特异性问题将变得更加突 出。故本实验通过多次重复检测构建质粒和确定基因型的标本，确立判读标准。由于所有结 果判读以软件计算的信号值为准，所以在芯片上可能会出现一些肉眼可辨的假阳性信号， 这些信号并不影响结果判读的准确性，信号值反映的是探针的灰度值。芯片中片基质控点、 阴性质控点及人基因组和HP各耐药位点探针的阳性值判读标准根据统计学方法得到。对于 CYP2C19*2的两条探针（2C19*2W和2C19*2M)，当某一条探针的平均灰度值为另一条的两倍 及以上时，则判断此条探针为阳性，对应位点为纯合子;当两者平均灰度值比值小于2时，则 判断此位点为杂合;CYP2C19*3的判读方法等同于CYP2C19*2。对于克拉霉素耐药位点的4条 探针(42W43W、42M43W、42W43M和42M43M)，当某一条探针的平均灰度值为另外三条的两倍及 以上时，则判断此条探针为阳性。对于喹诺酮耐药位点的探针，判读方法亦是如此。
[0135] 6、基因芯片的性能检测
[0136] (1)特异性考察：为考察本方法检测5个耐药位点野生及突变类型的特异性，选取 包含14种(其中42M-43M突变类型在此实验中没有筛选到)不同野生及突变类型的质粒和菌 株标准品进行检测进行四重PCR扩增，扩增产物与筛选确定的检测探针杂交，通过软件判读 结果评价各个探针的特异性。
[0137] 基因芯片杂交结果和测序结果由统计结果得出，标准品的可视化信号灰度值远大 于相应探针的判读标准，空白对照没有污染，说明这14种探针的特异性都较好。每一组探针 对野生型和突变型标准品的区分都很明显，并且探针间没有交叉干扰。
[0138] (2)灵敏性考察:通过筛选后的DNA提取方法，分别从构建的人基因组质粒和细菌 质粒中提取DNA，通过紫外分光光度计确定浓度，以42W43M，gyrA87WT，gyrA91MA探针组合及 CYP2C192W、CYP2C193W 组合为例，分别以 1 X 105，1 X 104，1 X 103，1 X 102CFU/ml 的质粒 DNA 重 组菌和10,5,2，lngAU的人基因组DNA和无菌水为模板，按前述的四重PCR体系及条件进行 扩增，与筛选后的检测探针杂交后，评价其灵敏度。
[0139] 灵敏性检测结果如图7所示，当细菌模板浓度降至1 X 103CFU/ml时，人基因组模板 降至2ngAU时，目的信号的检测结果仍为阳性，能满足常规的临床检测，采取同样的方法， 在其它探针的检测中也得到了基本相同的结果。
[0140] (3)重复性考察:选取同一模板在同一体系中的扩增产物，选择同一批次生产的空 白基因芯片，分不同批次点制，在不同点样芯片中随机选取三批与标准品进行杂交反应，再 从不同批次生产的芯片中随机抽取三批芯片。以CYP2C192杂合，CYP2C193W，42W43M， gyrA87WT，gyrA91MA探针组合为例对芯片重复性进行评价，取1 X 103CFU/mL的质粒重组菌 和2ng/ul的DNA为模板PCR扩增后进行芯片检测，同时设立无模板的阴性对照。实验重复3 次，计算片内和片间重复性，从而对本方法检测的重复性进行考核。
[0141] 重复性:实验结果见图8,表8。结果表明，对于这一探针组合，同一芯片上不同点的 重复性变异系数CV值小于11%，而不同批次点制的芯片杂交重复性结果的变异系数CV值也 小于11 %，说明本方法检测的重复性较好。
[0142] 表8芯片重复性统计结果
[0143]
[0144] 7、临床样本验证
[0145] 394例临床样本用本试剂盒进行检测，同时进行测序验证，测序结果经在线BLAST 分析，并进行统计分析得出试剂盒检测结果与测序结果一致性在90%以上，部分样本因洗 涤不完全、污染等因素出现非特异信号，导致无法准确判读结果。
[0146] 394例胃黏膜标本用本试剂盒进行检测，其中男性病例194例(49.24% )，女性病例 200例(50.76% )，年龄分布为14-82岁。
[0147] 本试剂盒共检测到2C19*2野生型161例，突变型37例，杂合子196例，测序检测到 2C19*2野生型181例，突变型40例，杂合子173例，两种方法的符合率为94.16%，经Kappa- 致性检验分析，结果显示:Kappa = 0.900，p〈0.0001，说明本试剂盒和测序结果一致性有统 计学意义，诊断一致性极好。
[0148] 本试剂盒共检测到2C19*3野生型364例，突变型4例，杂合子26例，测序检测到 2C19*3野生型359例，突变型4例，杂合子31例，两种方法的符合率为98.73 %，经Kappa-致 性检验分析，结果显示:Kappa = 0.917，p〈0.0001，说明本试剂盒和测序结果一致性有统计 学意义，诊断一致性极好。
[0149] 本试剂盒共检测到23s rRNA 2143位点野生型233例，突变34例，测序检测到2143 位点野生型232例，突变35例，两种方法的符合率为96.63%，经Kappa-致性检验分析，结果 显示:Kappa = 0.868，p〈0.0001，说明本试剂盒和测序结果一致性有统计学意义，诊断一致 性极好。
[0150] 本试剂盒共检测到gyrA 87和91位点野生型201例，突变66例，测序检测到gyrA 87 和91位点野生型199例，突变68例，两种方法的符合率为97.51 %，经Kappa-致性检验分析， 结果显示:Kappa = 0.92，p〈0.0001，说明本试剂盒和测序结果一致性有统计学意义，诊断一 致性极好。
[0151] 临床部分样本芯片检测结果及测序检测结果举例，如图9、10。对图进行判读此样 本为位CYP2C19*2杂合型、CYP2C19*3野生型、克拉霉素及喹诺酮相关耐药位点均为野生型， 可以得出，可以得出，该样本对质子栗抑制剂的代谢能力为中等强度，对克拉霉素和喹诺酮 均不发生耐药。
[0152] 以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所做的进一步详细说明，便于该技 术领域的技术人员能理解和应用本发明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。 对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下还可以做出 若干简单推演或替换，而不必经过创造性的劳动。因此，本领域技术人员根据本发明的揭 示，对本发明做出的简单改进都应该在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种幽门螺杆菌感染个体化治疗基因芯片，其特征在于，基因芯片包括： (1)幽门螺杆菌23s rRNA基因上克拉霉素耐药突变位点A2142G和A2143G对应的野生型 和突变型SNP分型寡合核苷酸探针:A2142G、A2143G野生型和突变型的核苷酸序列分别为 SEQ ID No:7、 SEQ ID No:8、 SEQ ID No:9和SEQ ID No:10; (2 )幽门螺杆菌gyrA基因上喹诺酮耐药突变位点N87K、D91G，D91N对应的野生型和突 变型SNP分型寡合核苷酸探针:N87K和D91G，D91N野生型和突变型的核苷酸序列分别为 SEQ ID No:ll、SEQ ID No:12、SEQ ID No:13、SEQ ID No:14、SEQ ID No:15、SEQ ID No: 16、SEQ ID No:17; (3) 人细胞色素酶P450上质子栗抑制剂代谢相关的CYP2C19*2(G681A)和CYP2C19*3 (G636A)两个位点对应的野生型和突变型SNP分型寡合核苷酸探针:CYP2C19*2和CYP2C19* 3野生型和突变型的核苷酸序列分别为SEQ ID No:3、SEQ ID No:4、SEQ ID No:5、SEQ ID No:6〇2. 根据权利要求1所述的基因芯片，其特征在于，基因芯片上的探针阵列为SEQ ID No: 1-19的寡核苷酸探针，形成8X8的矩形阵列。3. -种幽门螺杆菌感染个体化治疗基因芯片的制造方法，包括如下步骤： (1) 合成SEQ ID No :1-19寡核苷酸探针； (2) 将合成好的探针用无菌超纯水稀释溶解； (3 )在稀释的探针溶液中加入点样液，点样液的量与探针溶液等量的2倍； (4) 用点样仪将加入点样液的探针溶液点至基因芯片的空白载体上； (5) 点制好探针的基因芯片置于室温下干燥至少18 h。4. 根据权利要求3所述的制造方法，其特征在于，氨基修饰所有寡核苷酸探针的3 '端， 氨基与探针的连接由间隔臂完成。5. -种使用权利要求1-2所述的幽门螺杆菌感染个体化治疗基因芯片的检测方法，包 括如下步骤： (1) 从胃粘膜中提取样品DNA; (2) 在多重PCR体系中对样品DNA进行PCR扩增获得PCR扩增产物;PCR反应条件为:预变 性:95 °C，15 min;变性:94 °C，20 s;退火:65 °C，60 s;延伸：72 °C，5 min; (3) 将PCR扩增产物与杂交液等量混合后加至基因芯片反应区，覆盖探针阵列，45 °C 水浴中反应1 h; (4) 杂交后的芯片依次在洗液A(1XSSC，0.2 % SDS)，洗液B(0.2XSSC)和洗液C(0.1 XSSC)中于室温条件下各洗涤60 s，置室温晾干； (5) 在基因芯片反应区加入的Streptavidin-Nanogold (Nanoprobes)(1.6 μg/ml，稀 释液成分：1XPBS+0.1% BSA)，37 °C水浴放置30 min;取出后用PBST洗液（1XPBS+0.05% TWeen20)清洗30s，重复3次，用去离子水冲洗，置室温晾干;将银染试剂A液(醋酸银的水溶 液，浓度为4 mg/ml)和B液(氢醌的梓檬酸缓冲液溶液，浓度为10 mg/ml)等体积混合，在芯 片反应区避光加入30 yL的银染试剂A，B混合液，待芯片上出现明显可视化信号后停止显 色，显色2-5 min，用去离子水清洗，晾干； (6) 芯片杂交信号使用可视化生物芯片扫描仪(MicroView)进行扫描； (7) 根据各探针的显色信号进行阳性判断，当一条探针的平均灰度值是对应的另外探 针的两倍及以上时，判断该条探针为阳性，对应位点为纯合子;当一条探针的平均灰度值与 对应的另外探针的平均灰度值比值小于2时，判断此位点判为杂合。6. 如权利要求5所述的检测方法，其特征在于，PCR扩增产物与杂交液混合前，在94 °C条 件下变性5 min后，立即置于冰水浴中5 min。7. 如权利要求5所述的检测方法，其特征在于，从胃粘膜中提取样品DNA的方法为： (1) 用DNA提取液与胃粘膜1:1等体积混合，经过100 °C空气浴加热10 min; (2) 冰浴或4 °C冷却30 min，13000 rpm/min离心5 min，上清液转移到新离心管中-20 °C冻存获得样品DNA。
【文档编号】C40B50/06GK105969864SQ201610330457
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2016年5月18日
【发明人】钟婧, 黄惠莲, 戴利成
【申请人】湖州市中心医院