多发性骨髓瘤生物标志物的制作方法
【专利摘要】本发明公开了CTSH作为多发性骨髓瘤的诊治标志物的用途。据此可将CTSH用于开发诊断多发性骨髓瘤的产品、开发治疗多发性骨髓瘤的药物。本发明的研究成果为临床医师制定个性化治疗方案提供理论基础、并且能够为多发性骨髓瘤药物的开发提供新的药物靶点。
【专利说明】
多发性骨髓瘤生物标志物
技术领域
[0001] 本发明涉及肿瘤诊断、治疗、预测预后领域，更具体地，本发明涉及以检测CTSH异 常为手段的肿瘤诊断、预测预后方法;及激活CTSH基因或蛋白质的肿瘤治疗剂。
【背景技术】
[0002] 多发性骨髓瘤(multiple myel〇ma，MM)是一种骨髓内浆细胞异常增生的血液系统 恶性肿瘤性疾病，约占血液恶性肿瘤10 %，好发于老年人，随着我国人口老龄化，MM发病人 数有所增加。其主要特征是克隆性浆细胞异常增生并侵犯骨髓，产生克隆性免疫球蛋白。临 床表现为骨髓瘤细胞增生、浸润和骨髓微环境破坏，导致贫血、出血、骨痛或骨折、高钙症、 肾功能不全及免疫功能低下等。K-MG是多发性骨髓瘤患者常用的临床指标，也是作为国际 分期标准（ISS)的指标之一，02-MG的水平与骨髓瘤患者瘤负荷、预后存在相关性。目前治疗 骨髓瘤主要应用激素、蛋白酶体抑制剂、免疫调节剂等，这些药物的治疗可以使MM缓解，但 最终难免复发，因此需要发现新的诊断和治疗策略。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的之一在于提供一种通过检测CTSH基因或蛋白表达差异来诊断多发 性骨髓瘤的方法。
[0004] 本发明的目的之二在于提供一种通过检测CTSH基因或蛋白表达差异来预测多发 性骨髓瘤预后的方法。
[0005] 本发明的目的之三在于提供一种通过激活CTSH基因或CTSH蛋白来治疗多发性骨 髓瘤的方法。
[0006] 本发明的目的之四在于提供一种用于筛选治疗多发性骨髓瘤的药物的方法。
[0007] 本发明的目的之五在于提供一种用于治疗多发性骨髓瘤的药物。
[0008] 为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
[0009] 本发明提供了检测CTSH基因或CTSH蛋白的产品在制备多发性骨髓瘤诊断工具中 的用途。
[0010] 本发明还提供了检测CTSH基因或CTSH蛋白的产品在制备预测多发性骨髓瘤预后 工具中的用途。
[0011] 进一步，所述检测CTSH基因或CTSH蛋白的产品包括检测CTSH基因或CTSH蛋白的表 达水平的产品。所述产品包括能够结合CTSH基因的核酸或者能够结合CTSH蛋白的物质（例 如抗体）。所述核酸能够检测CTSH基因的表达水平;所述物质能够检测CTSH蛋白的表达水 平。
[0012] 本发明的检测CTSH基因的产品可基于使用核酸分子的已知方法来发挥其功能：如 PCR、如Southern杂交、Northern杂交、点杂交、荧光原位杂交(FISH)、DNA微阵列、AS0法、高 通量测序平台等。使用该产品可以定性地、定量地、或半定量地实施分析。
[0013] 包含在上述产品中的核酸可以通过化学合成来获得，或通过从生物材料制备含有 期望核酸的基因，然后使用设计用于扩增期望核酸的引物扩增它来获得。
[0014] 进一步，所述PCR方法为已知方法，例如，ARMS (Ampl if i cat ion Refractory Mutation System，扩增不应突变系统)法、RT-PCR(逆转录酶-PCR)法、嵌套PCR法等等。扩增 的核酸可以通过使用点印迹杂交法、表面等离子共振法(SPR法）、PCR-RFLP法、原位RT-PCR 法、PCR-SS0 (序列特异性寡核苷酸）法、PCR-SSP法、AMPFLP (可扩增片段长度多态性）法、 MVR-PCR法、和PCR-SSCP (单链构象多态性)法来检测。
[0015] 上面所述的核酸包括扩增CTSH基因的引物，产品中包括的引物可以通过通过化学 合成来制备，通过使用本领域技术人员知道的方法参考已知信息来适当地设计，并通过化 学合成来制备。
[0016] 在本发明的具体实施方案中，所述核酸为QPCR实验中使用的扩增引物，所述引物 的序列如SEQ ID N0.1 (正向序列）和SEQ ID N0.2(反向序列）所示。
[0017] 上面所述的核酸还可包括探针，所述探针可以通过化学合成来制备，通过使用本 领域技术人员知道的方法参考已知信息来恰当设计，并通过化学合成来制备，或者可以通 过从生物材料制备含有期望核酸序列的基因，并使用设计用于扩增期望核酸序列的引物扩 增它来制备。
[0018] 本发明的检测CTSH蛋白的产品可基于使用抗体的已知方法来发挥其功能：例如， 可以包括ELI SA、放射免疫测定法、免疫组织化学法、Wes tern印迹等。
[0019] 本发明的检测CTSH蛋白的产品包括特异性结合CTSH蛋白的抗体或其片段。可以使 用任何结构、尺寸、免疫球蛋白类别、起源等的抗体或其片段，只要它结合靶蛋白质即可。本 发明的检测产品中包括的抗体或其片段可以是单克隆的或多克隆的。抗体片段指保留抗体 对抗原的结合活性的抗体一部分(部分片段)或含有抗体一部分的肽。抗体片段可以包括F (at/ )2、Fat/、Fab、单链Fv(scFv)、二硫化物键合的Fv(dsFv)或其聚合物、二聚化V区（双抗 体）、或含有CDR的肽。本发明的检测CTSH蛋白的产品可以包括编码抗体或编码抗体片段的 氨基酸序列的分离的核酸，包含该核酸的载体，和携带该载体的细胞。
[0020] 抗体可以通过本领域技术人员公知的方法来获得。例如，制备保留整个或部分靶 蛋白质的多肽或整合编码它们的多核苷酸的哺乳动物细胞表达载体作为抗原。使用抗原免 疫动物后，从经过免疫的动物获得免疫细胞并融合骨髓瘤细胞以获得杂交瘤。然后从杂交 瘤培养物收集抗体。最后可以通过使用被用作抗原的CTSH蛋白或其部分对获得的抗体实施 抗原特异性纯化来获得针对CTSH蛋白的单克隆抗体。可以如下制备多克隆抗体：用与上文 相同的抗原免疫动物，从经过免疫的动物收集血液样品，从血液中分离出血清，然后使用上 述抗原对血清实施抗原特异性纯化。可以通过用酶处理获得的抗体或通过使用获得的抗体 的序列信息来获得抗体片段。
[0021] 标记物与抗体或其片段的结合可以通过本领域普遍知道的方法来实施。例如，可 以如下荧光标记蛋白质或肽：用磷酸盐缓冲液清洗蛋白质或肽，添加用DMS0、缓冲剂、等准 备的染料，然后混合溶液，再于室温放置10分钟。另外，标记可使用商品化的标记试剂盒，诸 如生物素标记试剂盒，如生物素标记试剂盒-NH2、生物素标记试剂盒-SH (DojindoLaboratories);碱性磷酸酶标记试剂盒诸如碱性磷酸酶标记试剂盒-NH2、碱性磷 酸酶标记试剂盒-SH(Dojindo Laboratories);过氧化物酶标记试剂盒诸如过氧化物酶标 记试剂盒-NH2、过氧化物酶标记试剂盒-NH2(Dojindo Laboratories);藻胆蛋白标记试剂 盒诸如藻胆蛋白标记试剂盒-NH2、藻胆蛋白标记试剂盒-SH、B-藻红蛋白标记试剂盒-NH2， B-藻红蛋白标记试剂盒-SH、R-藻红蛋白标记试剂盒-NH2、R-藻红蛋白标记试剂盒SH (DojindoLaboratories);焚光标记试剂盒诸如焚光素标记试剂盒-NH2、HiLyte Fluor(TM) 555标记试剂盒_NH2、HiLyte Fluor(TM)647标记试剂盒_NH2(Dojindo Laboratories);及 DyLight 547和DyLight647(Techno Chemical Corp.)、Zenon(TM)、Alexa Fluor(TM)抗体 标记试剂盒、Qdot(TM)抗体标记试剂盒（Invitrogen Corporation)和EZ-标记物蛋白质标 记试剂盒(Funakoshi Corporation)。为了正确标记，可以使用适宜的仪器来检测经过标记 的抗体或其片段。
[0022] 作为依照本发明的检测产品的样品，可以使用例如自活检受试者获得的组织样品 或流体。样品不受特别限制，只要它适于本发明的测定;例如，它可以包括组织、血液、血浆、 血清、淋巴液、尿液、浆膜腔液、脊髓液、滑液、房水、泪液、唾液、或其级分或经过处理的材 料。
[0023] 在本发明的具体实施方案中，所述样品来自受试者的组织。
[0024]在本发明中，"预后"是指肿瘤患者在通过手术处理等抑制或缓解肿瘤生长后的过 程或结果。在本说明书中，预后可以是通过手术处理抑制或缓解肿瘤生长后1、2、3、4、5、6、 7、8、9、10、15、20年或更久时的生机状态。预后可以通过检查生物标志物即CTSH蛋白或编码 CTSH蛋白的基因来预测。预后预测可以这样进行:根据生物标志物的有或无，或者升高或降 低，确定患者的预后是良好还是不良，或者确定良好预后或不良预后的概率。
[0025] 在本发明中，"预后良好"是指在通过手术处理等为患者抑制或缓解肿瘤生长之 后，患者长时期(例如3、5、6、7、8、9、10、15、20年或更长)没有危急状况。或者，预后好可以意 指在这样长时间内存活、无转移、无复发、或无再发。例如，预后良好可以意指至少3年或尤 其是至少5年存活，优选没有转移或复发。预后良好最优选的状态是长期无疾病的存活。如 本文中所使用的，"预后良好"还可以包括任何这样的状态，其中可以发现疾病如转移，但是 恶性低且不严重地影响生存能力。
[0026] 在本发明中，"预后不良"是指患者在通过手术处理等抑制或缓解肿瘤生长后的短 时期（例如1、2、3、4、5年或更短）内发生致命状况。或者，预后差是指在这样的短时期里死 亡、转移、复发、或再发。例如，预后差可以意指至少3年或尤其至少5年内复发、转移、或死 亡。
[0027] 预测预后是指预测患者状况的过程或结果，并不意味着能以100%的准确度预测 患者状况的过程或结果。预测预后是指确定某些过程或结果的可能性是否增加，而并不意 味着通过与某些过程或结果不发生的情况比较来确定发生某些过程或结果的可能性。如本 发明而言，本发明中CTSH基因或CTSH蛋白的水平降低的患者中，与不显示该特征的患者相 比，更有可能观察到特定过程或结果。
[0028] 进一步，所述检测CTSH基因或CTSH蛋白的产品可以是检测CTSH基因或CTSH蛋白的 试剂、也可以是包含所述试剂的试剂盒、芯片、试纸等，也可以是使用所述试剂的高通量测 序平台。
[0029]本发明还提供了一种诊断多发性骨髓瘤的工具，所述工具能够检测CTSH基因或 CTSH蛋白的表达水平。所述工具包括能够结合CTSH基因的核酸或者能够结合CTSH蛋白的物 质（例如抗体）。所述核酸能够检测CTSH基因的表达水平;所述物质能够检测CTSH蛋白的表 达水平。
[0030] 进一步，所述核酸和所述物质的性质同前面所述。
[0031] 进一步，所述诊断多发性骨髓瘤的工具包括但不限于芯片、试剂盒、试纸、或高通 量测序平台；高通量测序平台是一种特殊的诊断多发性骨髓瘤的工具，随着高通量测序技 术的发展，对一个人的基因表达谱的构建将成为十分便捷的工作。通过对比疾病患者和正 常人群的基因表达谱，容易分析出哪个基因的异常与疾病相关。因此，在高通量测序中获知 CTSH基因的异常与多发性骨髓瘤相关也属于CTSH基因的用途，同样在本发明的保护范围之 内。
[0032] 本发明还提供了一种预测多发性骨髓瘤预后的工具，所述预测多发性骨髓瘤预后 工具包括能够结合CTSH基因的核酸或者能够结合CTSH蛋白的物质(例如抗体）。所述核酸能 够检测CTSH基因的mRNA水平;所述物质能够检测CTSH蛋白的表达水平。
[0033]进一步，所述核酸和所述物质的性质同前面所述。
[0034] 进一步，所述预测多发性骨髓瘤预后的工具包括但不限于芯片、试剂盒、试纸、或 高通量测序平台；高通量测序平台是一种特殊的诊断多发性骨髓瘤的工具，随着高通量测 序技术的发展，对一个人的基因表达谱的构建将成为十分便捷的工作。通过对比疾病患者 和正常人群的基因表达谱，容易分析出哪个基因的异常与疾病相关。因此，在高通量测序中 获知CTSH基因的异常与多发性骨髓瘤相关也属于CTSH基因的用途，同样在本发明的保护范 围之内。
[0035] 本发明的检测产品、诊断工具中使用的抗CTSH抗体或其片段所识别的氨基酸的数 目没有特别限制，只要抗体能够结合CTSH即可。
[0036] 本发明还提供了一种诊断多发性骨髓瘤或预测多发性骨髓瘤预后的方法，所述方 法包括如下步骤：
[0037] (1)获取受试者的样品；
[0038] (2)检测受试者样品中CTSH基因或蛋白的表达水平；
[0039] (3)将测得的CTSH基因或蛋白的表达水平与受试者的患病与否关联起来。
[0040] (4)与对照相比，CTSH基因或蛋白的表达水平降低，则该受试者被诊断为多发性骨 髓瘤，或该受试者被确定为预后不良。
[0041] 本发明还提供了一种多发性骨髓瘤的治疗方法，所述方法包括激活CTSH基因或 CTSH蛋白。
[0042] 进一步，所述方法包括促进CTSH基因的表达，或促进CTSH蛋白的表达或增强CTSH 蛋白的活性。
[0043] 本发明还提供了一种肿瘤药物的筛选方法，可以通过在对癌细胞添加测试药物后 或在对肿瘤模型动物施用测试药物后的某个时期测量CTSH基因或者CTSH蛋白的表达水平 来测定肿瘤药物改善肿瘤预后的效果。更具体地说，当CTSH基因或者CTSH蛋白的表达水平 在添加或施用测试药物后升高时或者恢复正常水平时，可选择该药物作为改善肿瘤预后的 治疗药物。
[0044] 本发明还提供了一种含有CTSH基因或CTSH蛋白的激活剂的药物。
[0045] 本发明还提供了上述激活剂在制备治疗多发性骨髓瘤的药物中的应用。
[0046]本发明的CTSH基因或CTSH蛋白的激活剂不受限制，只要是可以促进或者增强CTSH 或涉及CTSH上游或下游途径的物质的表达或活性，且对于治疗肿瘤有效的药物即可。
[0047] 进一步，所述激活剂包括CTSH基因、CTSH蛋白、促进型miRNA、促进型转录调控因 子、或促进型靶向小分子化合物。
[0048] 所述激活剂还包括包含携带CTSH基因的载体或者宿主细胞。
[0049] 本发明的激活剂一方面可以用于补充内源性的CTSH蛋白的缺失或不足，通过提高 CTSH蛋白的表达，从而治疗因 CTSH蛋白缺乏导致的多发性骨髓瘤。另一方面可以用于增强 CTSH蛋白的活性，从而治疗多发性骨髓瘤。
[0050] 本发明的药物可以作为医药单独施用或与其它药物一起施用。可以与本发明的药 物一起施用的其它药物不受限制，只要它不损害本发明的治疗性或预防性药物的效果即 可，优选的是，用于治疗或预防肿瘤的药物可以包括例如烷化剂，诸如异环磷酰胺、环磷酰 胺、达卡巴嗪、替莫唑胺、尼莫司汀、白消安、丙卡巴肼、美法仑、和雷莫司汀;抗代谢物，诸如 依诺他滨、卡培他滨、卡莫氟、克拉屈滨、吉西他滨、阿糖胞苷、阿糖胞苷十八烷基磷酸盐 (cytarabine ocfosfate)、替加氟、替加氟-尿啼啶、替加氟吉美啼啶奥替拉西钾、去氧氟尿 苷、羟基脲、氟尿嘧啶、氟达拉滨、培美曲塞、喷司他丁、巯嘌呤、和甲氨蝶呤;植物生物碱，诸 如伊立替康、依托泊苷、索布佐生、多西他赛、nogitecan、帕利他赛、长春瑞滨、长春地辛、和 长春碱;抗癌抗生素，诸如放线菌素 D、阿柔比星、氨柔比星、伊达比星、表柔比星、净司他丁 stimalamer、柔红霉素、多柔比星、啦柔比星、博来霉素、培洛霉素、丝裂霉素 C、和米托蒽醌； 基于铂的药物，诸如奥沙利铂、卡铂、顺铂、和奈达铂;激素药物，诸如阿那曲唑、依西美坦、 雌莫司汀、炔雌醇、氯地孕酮、戈舍瑞林、他莫昔芬、地塞米松、托瑞米芬、比卡鲁胺、氟他胺、 泼尼松龙、磷雌酚、米托坦、甲睾酮、甲羟孕酮、美雄烷、亮丙瑞林、和来曲唑；生物反应修饰 剂，诸如干扰素 α、干扰素 β、干扰素 γ、白介素、乌苯美司、干BCG、和香菇多糖;和分子靶向药 物，诸如伊马替尼（imatinib)、吉非替尼(gefitinib)、吉姆单抗、奥佐米星、他米巴罗汀、曲 妥单抗、维A酸、硼替佐米(bortezomib)、和利妥昔单抗等。
[0051] 本发明的药物可根据需要制备成各种剂型。包括但不限于，经皮、粘膜、鼻、口颊、 舌下或经口使用的片剂、溶液剂、颗粒剂、贴剂、膏剂、胶囊剂、气雾剂或栓剂。
[0052] 本发明的药物的施用途径不受限制，只要它能发挥期望的治疗效果或预防效果即 可，包括但不限于静脉内，腹膜内，眼内，动脉内，肺内，口服，小泡内，肌肉内，气管内，皮下 的，通过皮肤，通过胸膜，局部的，吸入，通过粘膜，皮肤，肠胃，关节内，心室内，直肠，阴道， 颅骨内，尿道内，肝内，瘤内。在某些情况下，可以系统地给药。在某些情况下是局部地给药。 [0053]本发明的药物的剂量不受限制，只要获得期望的治疗效果或者预防效果即可，可 以依据症状、性别、年龄等来恰当的确定。本发明的治疗药物或预防药物的剂量可以使用例 如对疾病的治疗效果或者预防效果作为指标来确定。
[0054]在本发明的上下文中，"诊断多发性骨髓瘤"既包括判断受试者是否已经患有多发 性骨髓瘤、也包括判断受试者是否存在患有多发性骨髓瘤的风险。
[0055] 本文所用的"治疗"涵盖患有相关疾病或病症的哺乳动物例如人类中治疗相关的 疾病或疾病状态，并且包括：
[0056] (1)预防疾病或疾病状态在哺乳动物中发生，尤其是当该哺乳动物易感于所述疾 病状态，但尚未被诊断出患有这种疾病状态时；
[0057] (2)抑制疾病或疾病状态，即阻止其发生;或者
[0058] (3)缓解疾病或疾病状态，即使疾病或疾病状态消退。
[0059] 术语"治疗"通常涉及治疗人类或动物(例如，被兽医所应用），其中可达到某些预 期的治疗效果，例如，抑制病症的发展(包括降低发展速度、使发展停止）、改善病症和治愈 病症。还包括作为预防措施(例如预防）的治疗。对还没有发展为病症但有发展为该病症危 险的患者的用途，也包括在术语"治疗"中。
[0060] 本发明的优点和有益效果：
[0061] 本发明的发现了一种诊断多发性骨髓瘤的分子标志物，使用该分子标志物可以在 多发性骨髓瘤发生的早期即可作为判断，提供了患者的生存率。
[0062] 另外，通过预测患者的预后，本发明能够提供有意义的信息来为患者决定治疗方 案策略。
[0063] 本发明的包括CTSH基因或蛋白的激活剂的治疗药物可用作新的多发性骨髓瘤的 治疗药物。
【附图说明】
[0064]图1显示CTSH基因过表达对多发性骨髓瘤细胞增殖的影响；
[0065]图2显示CTSH基因过表达对多发性骨髓瘤细胞侵袭的影响；
[0066]图3显示CTSH基因过表达对多发性骨髓瘤细胞迀移的影响。
[0067]具体的实施方式
[0068] 下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本 发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条 件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:ColdSpring HarborLaboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0069] 实施例1基因芯片筛选差异表达基因
[0070] 1、取材：
[0071] 多发性骨髓瘤组织:收集确诊的MM患者骨髓活检标本共10例，MM诊断标准参阅《中 国多发性骨髓瘤诊治指南2011修订版》。患者中男5例，女5例，中位年龄59岁。
[0072]正常骨髓组织:收集同时期营养不良性贫血患者骨髓活检组织标本10例作为对照 组，其中男5例，女5例，中位年龄53岁。
[0073] 2、组织RNA的获取
[0074] 使用Tr i zo 1-步法提取组织总RNA。
[0075] 3、RNA纯度及浓度的测定
[0076] 取RNA溶液ΙμL，仪器测定0D260、0D280，RNA浓度为0D260值X稀释倍数X 40/1000， 计算0D260/0D280，比值在1.7-2.0代表RNA溶液纯度高，含蛋白质等杂质少，-20°C保存。 [0077] 4、RNA完整性检测
[0078] (1)取2μ1 RNA样品行1.5%琼脂糖凝胶电泳(80v，15min);
[0079] (2)分出区带后，genefinder染色，蓝光下观察电泳区带；
[0080] (3)当28s/18s约2:1时，说明RNA稳定无降解。
[0081] 5、基因芯片杂交及扫描
[0082] 总RNA经线性化扩增后，cy3-UTP标记，荧光标记后的cRNAs采用RNEASY Mini Kit 纯化，用Amhion的RNA Fragmentation Reagents对标记好的cRNAs进行片段化处理。采用美 国Agilent公司的人全基因表达谱芯片(4x 44K基因），在芯片杂交炉中65°C杂交17h，然后 洗脱、染色，最后用Agilent DNA MicroarrayScanner扫描仪扫描。
[0083] 6、芯片数据处理与分析
[0084]杂交后的芯片经芯片扫描仪读取数据点后，将数据导入分析软件，对于两组比值 的自然对数绝对值大于2.0或小于0.5的基因作为差异表达基因。
[0085] 7、统计学处理
[0086]采用SPSS 13.0统计软件进行数据分析，组间差异比较采用单因素方差分析法，P〈 0.05差异有显著性意义。
[0087] 8、结果
[0088] 芯片结果显示，多发性骨髓瘤组织与正常骨髓组织之间共筛选出489个差异表达 基因，其中表达水平上调的基因215个，表达水平下调的基因274个。
[0089]实施例2大样本验证筛选出的差异表达基因
[0090] 考虑现有技术中还未见关于该基因与多发性骨髓瘤相关性进行研究的基因作为 候选基因，同时考虑基因测序的结果，选择CTSH基因（其表达在多发性骨髓瘤组织中下调） 进行验证。
[0091] 1、样本收集
[0092] 按照实施例1的方法收集多发性骨髓瘤组织50例，正常骨髓组织60例。
[0093] 2、在mRNA水平上进行验证
[0094] 2.1提取组织RNA
[0095] 步骤同实施例1。
[0096] 2.2逆转录
[0097] 逆转录体系共20yL，包括细胞总RNA 2yg/2yL，50UAxL Rnasin lyL，5X逆转录反 应缓冲液4以1^，10111]\1(1犯132以1，5(^8/1^随机引物2以以口1〇11^^3)，2001] /4^]\1-]\11^逆转录酶 lyL,DEPC 8yL〇
[0098] 37 °C反应60分钟，95 °C 5分钟终止反应。cDNA在-80 °C保存或进行PCR扩增。
[0099] 2.3PCR
[0100] 反应体系按照Real Master Mix(SYBR Green)试剂盒（购自天根生化科技（北京） 有限公司）配置，SYBR反应体系共25yL，2.5 XReal Master Mix 10yL，20XSYBR solution 1.25yL，上游引物0.5yL，下游引物0.5yL，去离子水10.75yL，cDNA 2yL。反应条件为94°C 5min，94°C 45s，60 °C lmin，30 个循环，设空白对照。
[0101] PCR反应前10个循环的荧光信号作为荧光本底信号，调苄基线至适宜处，各荧光曲 线与基线交叉点的循环数即为ct值。根据Δ c(t) = C(t)ge_-C(t)fs-ac；tin，Δ Δ c(t) = 2 ^(t)，计算目的基因与β-actin相对表达量。
[0102] PCR引物序列如下：
[0103] CTSH基因引物序列如下所示：
[0104] 上游引物：5'-TCCTTCTTAACAGACTCA-3'（SEQ ID N0.1);
[0105] 下游引物：5'-ATTGAACAGCGAATACAG-3'（SEQ ID N0.2)。
[0106] β-actin基因引物序列如下所示：
[0107] 上游引物：5'-CTGGCACCACACCTTCTACAAT-3'（SEQ ID N0.3);
[0108] 下游引物：5'-AATGTCACGCACGATTTCCCGC_3'（SEQ ID N0.4)
[0109] 2.4结果
[0110] 结果显示，与正常骨髓组织相比，多发性骨髓瘤组织中CTSH基因的mRNA水平明显 下调，相对表达量为0.31 ±0.05，差异具有统计学意义(P〈0.05)。
[0111] 3、在蛋白水平上进行验证
[0112] 3.1提取组织总蛋白
[0113]按照EpiQuik组织/细胞总蛋白提取试剂盒的说明书进行蛋白提取的操作。
[0114] 3.2Western blot检测
[0115] 将提取的蛋白定量进行SDS-PAGE电泳，之后进行转膜、封闭、一抗孵育、二抗孵育、 显色。
[0116] 3.3统计学处理
[0117]将蛋白条带的灰度值使用Image J软件进行分析，以β-actin为内参，将CTSH蛋白 条带的灰度值进行归一化处理。结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用 SPSS13.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用t检验，认为当P〈0.05时具有统 计学意义。
[0118] 3.4 结果
[0119] 结果显示，与正常骨髓组织相比，多发性骨髓瘤组织中CTSH蛋白水平显著降低，相 对表达量为0.42 ± 0.07，差异具有统计学意义(P〈0.05)。
[0120] 实施例3CTSH基因过表达
[0121] 1、质粒构建
[0122] 根据CTSH基因的编码序列设计扩增引物，引物的设计为本领域技术人员所熟知。 从成人胎脑的cDNA文库(clontech公司，货号:638831)中扩增全长的CTSH基因的编码序列， 上述cDNA序列插入到真核细胞表达载体pcDNA3.1中，连接获得的重组载体pcDNA3.1-CTSH 用于后续实验。
[0123] 2、多发性骨髓瘤细胞的培养与转染
[0124] 2.1细胞培养
[0125] RPMI8226细胞采用含有15%胎牛血清(FBS)、青霉素100U/ml、链霉素100μg/ml的 RPMI 1640培养基置于37°C，5%C02,饱和湿度环境下培养。
[0126] 2.2细胞转染
[0127] (1)转染前一天将0.5_2*105个肿瘤细胞悬浮于500μ1不含抗生素的培养基，接种 至24孔培养板。
[0128] (2)转染当天细胞密度应达80%-90%，准备以下复合物Α:将lyg质粒DNA稀释于无 血清培养基中，轻轻混勾；复合物B:取4μ1 Lipofectamine2000稀释于无血清培养基中，混 匀。
[0129] (3)将复合物A和B混合，轻轻混匀，室温孵育。
[0130] (4)将100μΙ脂质体复合体加入肿瘤细胞中，上下左右轻轻混匀，将细胞放入37°C 含5 % C02培养箱孵育5-7小时。
[0131] (5)加 lml含有2倍正常血清和抗生素浓度的生长培养基，继续培养细胞18-24小 时。
[0132] 3、利用QPCR实验检测pcDNA3.1-CTSH的过表达情况
[0133] 3.1提取细胞总RNA利用常规方法进行操作。
[0134] 3.2逆转录
[0135] 步骤同实施例2。
[0136] 3.3QPCR
[0137] 步骤同实施例2。
[0138] 3.4 结果
[0139] 结果显示，pcDNA3.1-CTSH能够成功过表达，相对表达量为7.13 ± 0.35，差异具有 统计学意义(P〈〇.〇5)。
[0140] 3、Western blot实验检测pcDNA3.1-CTSH过表达情况
[0141] 步骤同实施例2。
[0142] 结果显示，与转染pcDNA3.1组相比，转染pcDNA3.1-CTSH的细胞中CTSH蛋白的含量 明显增加，相对表达量为4.21 ±0.52，差异具有统计学意义(P〈0.05)。
[0143] 实施例4CTSH基因的表达对多发性骨髓瘤细胞增殖能力的测定
[0144] 1、步骤：
[0145] (1)将细胞接种于96孔板中，每个浓度做3复孔；
[0146] (2)加入MTT工作浓度的溶液，与细胞37 °C共同孵育4h;
[0147] (3)除去培养基，加入200μ1二甲基亚砜来溶解甲瓒晶体；
[0148] (4)连续5d测0D570,所有实验均重复三次以上，求取平均值；
[0149] 2、结果：
[0150] 结果如图1所示，与转染pcDNA3.1组相比，转染pcDNA3.1-CTSH组细胞增殖速度明 显减慢，差异具有统计学意义(P〈〇.05)。上述实验结果表明，CTSH基因表达抑制了多发性骨 髓瘤细胞的增殖。
[0151 ] 实施例7检测CTSH基因表达对细胞迀移、侵袭的影响
[0152] 1、侵袭实验
[0153] 1.1实验步骤：
[0154] (1)上室用Matrigel(人工基底膜)预涂；
[0155] (2)在上室中种入转染后的细胞，接种浓度为5*104/100μ1细胞，在无血清培养基 中培养18h;
[0156] (3)将细胞加入到0.1%的FBS的RPMI-1640培养基中培养18h;
[0157] (4)在冰上吸取 50μ1 Matrigel;
[0158] (5)加入预冷的150μ1无血清RPMI-1640培养基中充分混匀；
[0159] (6)分别取（5)中混合的Matrigel 50μ1，加入到transwell上室，覆盖整个膜；
[0160] (7)37°C至过夜，使Matrigel聚合成胶；
[0161] (8)细胞用无血清RPMI-1640培养基洗2遍，再加入无血清的RPMI-1640培养基中， 至总体积?〇〇μ1;
[0162] (9)将(8)均匀加入Transwe 11上室中，下层培养液和小室间，避免气泡；
[0163] (10)向下室加入500-600μ1 含 5%FBS 的 RPMI-1640培养，37°C，5%C〇2;
[0164] (11)48h后吸尽液体，擦去未穿透的细胞，迀移到膜的下表面的细胞用100 %甲醇 固定30min，PBS洗2遍；
[0165] (12)0.2%结晶紫染色上室3〇11^11，？85洗去多余结晶紫；
[0166] (13)倒置显微镜下计数。
[0167] 1.2 结果：
[0168] 实验结果如图2显示，与转染pcDNA3.1组相比，转染pcDNA3.1-CTSH组细胞侵袭数 明显减少，差异具有统计学意义(P〈〇. 05)。
[0169] 2、迀移实验
[0170] 2.1实验步骤
[0171] (1)上室中不需要预涂Matrigel人工基底膜。在上室中种入转染后的细胞，接种浓 度为（?*?〇5)Λ〇〇μ1个细胞，在无血清培养基中培养I8h;
[0172] (2)将细胞加入到0.1%的FBS的无血清RPMI-1640培养基中培养18h;
[0173] (3)在冰上用预冷的枪头吸取50μ1 Matrigel;
[0174] (4)加入预冷的150μ1无血清RPMI-1640培养基中充分混匀；
[0175] (5)分别取(4)中混合的Matrigel 50μ1加入到Transwell上室，覆盖整个膜；
[0176] (6)37°C至过夜，使Matrigel聚合成胶；
[0177] (7)细胞用无血清RPMI-1640培养基洗2次，再加入无血清的RPMI-1640培养基中， 至总体积?〇〇μ1;
[0178] (8)将(7)均匀加入Transwell上室中，下层培养液和小室间，避免气泡，向下室加 入500-600μ1 含 10%FBS的RPMI-1640培养，37°C，5%C〇2;
[0179] (9)48h后吸尽液体，擦去未穿透的细胞，迀移到膜的下表面的细胞用100%甲醇固 定 30min，PBS洗2遍；
[0180] (10)0.2%结晶紫染色上室3〇11^11，？85洗去多余结晶紫；
[0181] (11)倒置显微镜下计数。
[0182] 2.2 结果
[0183] 实验结果如图3显示，与转染pcDNA3.1组相比，转染pcDNA3.1-CTSH组细胞迀移数 明显减少，差异具有统计学意义(P〈〇. 05)。
[0184] 上述结果表明，CTSH基因表达不利于骨髓瘤细胞的迀移和侵袭。
[0185] 上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本 领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进 和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。
【主权项】
1. 检测CTSH基因或CTSH蛋白的产品在制备诊断多发性骨髓瘤或预测多发性骨髓瘤预 后的工具中的应用。2. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述检测CTSH基因或CTSH蛋白的产品包括 检测CTSH基因或CTSH蛋白的表达水平的产品。3. 根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述产品包括能够结合CTSH基因的核 酸或者能够结合CTSH蛋白的物质;所述核酸能够检测CTSH基因的表达水平;所述物质能够 检测CTSH蛋白的表达水平。4. 根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述核酸是实时定量PCR中使用的特异扩 增CTSH基因的引物如SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO.2所示。5. -种诊断多发性骨髓瘤或预测多发性骨髓瘤预后的工具，其特征在于，所述工具包 括能够检测CTSH基因或CTSH蛋白的表达水平的工具。6. 根据权利要求5所述的工具，其特征在于，所述工具包括能够结合CTSH基因的核酸或 者能够结合CTSH蛋白的物质;所述核酸能够检测CTSH基因的表达水平;所述物质能够检测 CTSH蛋白的表达水平。7. 根据权利要求6所述的工具，其特征在于，所述核酸是实时定量PCR中使用的特异扩 增CTSH基因的引物如SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO.2所示。8. -种治疗多发性骨髓瘤的药物，其特征在于，所述药物包含CTSH基因或CTSH蛋白的 激活剂。9. 根据权利要求8所述的药物，其特征在于，所述激活剂能够促进或增强CTSH或涉及 CTSH上游或下游途径的物质的表达或活性。10. 权利要求8或9所述的激活剂在制备治疗多发性骨髓瘤的药物中的应用。
【文档编号】G01N33/574GK105969904SQ201610601437
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2016年7月27日
【发明人】杨承刚, 李婷
【申请人】北京泱深生物信息技术有限公司