一种检测猪繁殖障碍病毒的多重GeXP-PCR方法
【专利摘要】本发明公开了一种检测猪繁殖障碍病毒的多重GeXP?PCR方法，采用含7种猪繁殖障碍病毒靶基因的PRV,ASFV,PPV，PRRSV，CSFV,PCV2,JEV嵌合引物和通用引物以适当配比参加PCR反应，PRV,ASFV,PPV上下游特异性嵌合引物的浓度均为1.5μM，PRRSV,CSFV,PCV2,JEV上下游特异性嵌合引物的浓度均为1μM，特异性嵌合引物的最佳退火温度为60℃，通用引物最佳退火温度为50℃。本发明改善了多重PCR过程中不同靶基因的扩增偏好性，从而提高目的基因的检测效率，提高了检测的特异性，大大提高了分辨率和灵敏度，从而实现猪繁殖障碍病毒的快速检测。
【专利说明】
一种检测猪繁殖障碍病毒的多重GeXP-PCR方法
技术领域
[0001] 本发明属于繁殖障碍病毒检测技术领域，尤其涉及一种检测猪繁殖障碍病毒的多 重GeXP-PCR方法。
【背景技术】
[0002] 重GeXP-PCR技术是一种基于多重PCR技术、毛细管电泳分离技术与高灵敏激光诱 导荧光技术而开发出来的一种检测分析系统。它将荧光标记的通用引物与特异嵌合引物按 一定比例同时加入一个PCR反应体系，利用反应中占主导地位的通用引物引发扩增来避免 扩增中所产生的偏爱性问题，并用毛细管电泳对多重PCR产物进行检测，根据片段大小分离 不同基因，根据荧光信号强度不同显示模板含量的差别，在很大程度上提高了检测的灵敏 度和速度，并且仅用极少量总RNA(20ng)即可在同一个体系里对多达40个目的基因进行有 效分析。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的在于提供一种检测猪繁殖障碍病毒的多重GeXP-PCR方法，旨在改善 多重PCR过程中不同靶基因的扩增偏好性，提高目的基因的检测效率，实现猪繁殖障碍病毒 的快速检测。
[0004] 本发明是这样实现的，一种检测猪繁殖障碍病毒的多重GeXP-PCR方法，所述检测 猪繁殖障碍病毒的多重GeXP-PCR方法采用含7种猪繁殖障碍病毒靶基因的PRV，ASFV，PPV， PRRSV，CSFV，PCV2，JEV嵌合引物和通用引物以适当配比参加 PCR反应，PRV，ASFV，PPV上下 游特异性嵌合引物的浓度均为1.5μΜ，PRRSV，CSFV，PCV2，JEV上下游特异性嵌合引物的浓度 均为ΙμΜ，特异性嵌合引物的最佳退火温度为60°C，通用引物的最佳退火温度为50°C。
[0005] 进一步，所述检测猪繁殖障碍病毒的多重GeXP-PCR方法包括以下步骤：
[0006] 待测样品制备，按照商品化DNA/RNA提取试剂盒使用说明书提取患病动物的组织 或病毒的细胞增殖液的全基因组，若为RNA病毒则进行反转录制备用于检测的cDNA;
[0007] PCR扩增：25yL PCR反应液包含:ExTaq酶 12.5yL、引物Mix 9yL、待测样品DNA lyL、 无核酸酶灭菌水2.5μΜ其中，所述引物Mix含有:PRV，ASFV，PPV上下游特异性嵌合引物各 1.5μΜ; PRRSV，CSFV，PCV2，JEV上下游特异性嵌合引物各ΙμΜ;上下游通用引物各20μΜ，共9μ L；
[0008] 按如下步骤进行扩增：95 °C 30s，60 °C 30s，72 °C 25s，12个循环；95 °C 30s，50 °C 30s， 72°〇258,20个循环；721€511^11;
[0009] 毛细管电泳:取ΙμL 10倍稀释了的PCR产物加入到预先配置好的39μ1上样缓冲液 中（38.75μ1 SLS+0.25μ1 DSS-400)，混匀过后再每孔上方滴一滴矿物油以防止液体政法所 带来的交叉污染，最后再在上样缓冲板对应的孔中加入大约250μ1的分离缓冲液，准备完成 后放入GenomeLabTM GeXP System选择Frag-3分离方法进行多重基因表达系统毛细管电泳 分析；
[0010]使用自定义GeXP片段分析参数对分离后的片段分析，判定结果。
[0011] 进一步，所述7种猪繁殖障碍病毒靶基因的PRV，ASFV，PPV，PRRSV，CSFV，PCV2，JEV 嵌合引物的序列如下：
[0026] 进一步，所述7种猪繁殖障碍病毒靶基因的PRV，ASFV，PPV，PRRSV，CSFV，PCV2，JEV 嵌合引物的各条带大小如下：PRV:156-160bp，CSFV:195-196bp，ASFV:227-288bp，PRRSV: 258-261bp,PPV:284-285bp,PCV2:337-341bp and JEV:36〇-361bp〇
[0027]进一步，所述检测猪繁殖障碍病毒的多重GeXP-PCR方法：
[0028] 对PRV的最低检测量为103copiesAU ;
[0029] 对CSFV的最低检测量为102copiesAU ;
[0030] 对ASFV的最低检测量为103copiesAU ;
[0031] 对PRRSV的最低检测量为102copiesAU ;
[0032] 对PPV的最低检测量为103copiesAU ;
[0033] PCV2的为 102copiesAU，JEV的为 103copiesAU ;
[0034] 当7种病毒同时存在时，最低检测限度为lOOOcopies/μΙ。
[0035]本发明提供的检测猪繁殖障碍病毒的多重GeXP-PCR方法，能在一个反应中方便快 速地同时检测7种相关病毒，为猪繁殖障碍病毒的快速鉴别诊断提供了技术支持，对疾病的 预防控制提供了理论依据。本方法采用含7种猪繁殖障碍病毒靶基因的嵌合引物和通用引 物以适当配比参加 PCR反应(通用引物在PCR扩增过程中起主导作用），改善了多重PCR过程 中不同靶基因的扩增偏好性，从而提高目的基因的检测效率;根据荧光标记的PCR产物片段 长度来确定目的片段，提高了检测的特异性;采用毛细管电泳对荧光标记的PCR产物进行分 离和检测，大大提高了分辨率和灵敏度，从而实现猪繁殖障碍病毒的快速检测。本发明具有 良好的方法学特征:建立了 一种特异性好、灵敏度高、稳定性强和节时省力的GeXP-PCR检测 方法;为混合感染疾病的同步检测和鉴别诊断提供快速、高效的手段，为今后出入境动物检 疫和相应疫病控制提供了技术保障;对满足进出境动物检疫工作的需要，控制繁殖障碍病 病毒的传播，保障我国的畜牧业安全、健康发展具有十分重要的意义。
【附图说明】
[0036]图1是本发明实施例提供的检测猪繁殖障碍病毒的操作流程图。
[0037]图2是本发明实施例提供的检测猪繁殖障碍病毒的单重GeXP-PCR引物特异性验证 结果图；
[0038] 图中：&、卩1^:156-16(^口；13、〇5卩￥:195-196匕口；。、八5卩￥:227-288匕口 ；(1、？1?1?￥:258-261 bp; e、PPV: 284-285bp; f、PCV2:337-341 bp; g、JEV: 360-361 bp ;h、阴性对照。
[0039] 图3是本发明实施例提供的在多引物体系中每个反应无交叉反应性示意图；
[0040] 图中：a、模板为 PRV+CSFV+PRRSV+PCV2+JEV; b、模板为 CSFV+ASFV+PRRSV+PCV2; c、 模板为 CSFV+PRRSV+PCV2; d、模板为 CSFV+ASFV。
【具体实施方式】
[0041] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明 进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于 限定本发明。
[0042] 下面结合附图对本发明的应用原理作详细的描述。
[0043]如图1所示，本发明实施例的检测猪繁殖障碍病毒的多重GeXP-PCR方法包括以下 步骤：
[0044] S101:待测样品制备，按照商品化DNA/RNA提取试剂盒使用说明书提取患病动物的 组织或病毒的细胞增殖液的全基因组，若为RNA病毒则进行反转录制备用于检测的cDNA;
[0045] S102:PCR扩增：25yL PCR反应液包含，ExTaq酶 12.5yL、引物Mix 9yL、待测样品DNA lyL、无核酸酶灭菌水2.5yL;其中，所述引物Mix含有:PRV，ASFV，PPV上下游特异性嵌合引物 各1.5μΜ; PRRSV，CSFV，PCV2，JEV上下游特异性嵌合引物各ΙμΜ;上下游通用引物各20μΜ，共9 yL；
[0046] 5103:按如下步骤进行扩增：951€308,601€308,72 1€258，12个循环；951€308,501€ 30s，72 °C 25s，20 个循环；72 °C 5min;
[0047] S104:毛细管电泳：取ΙμL 10倍稀释了的PCR产物加入到预先配置好的39μ1上样 缓冲液中（38.75μ1 SLS+0.25yl DSS-400)，混匀过后再每孔上方滴一滴矿物油以防止液体 政法所带来的交叉污染，最后再在上样缓冲板对应的孔中加入大约250μ1的分离缓冲液，准 备完成后放入GenomeLabTM GeXP System选择Frag-3分离方法进行多重基因表达系统毛细 管电泳分析；
[0048] S105:使用自定义GeXP片段分析参数对分离后的片段分析，判定结果。
[0049] 下面结合实验对本发明的应用效果作进一步的说明。
[0050] 1.材料和方法
[0051 ] 1.1.病毒
[0052] ASFV是由人工合成的质粒，其他阳性样本和阴性样本见表1，所有的疫苗都来自于 商业资源。
[0053] 表1.样本来源和GeXP实验结果
[0056] PRV:Pseudorabies；CSFV:Classical Swine Fever Virus；ASFV:African Swine Fever Virus；PRRSV:Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus；PPV: Porcine Parvovirus；PCV2:Porcine Circovirus type 2；JEV:Japanese Encephalitis Virus.SAU:Sichuan Agricultural University；MVRI:Military Veterinary Research Institute；NAFU:Northwest A&F University.
[0057] 1.2.主要试剂及仪器
[0058] 1.3.主要试剂:克隆宿主菌E.coli DH5a由四川农业大学动物检疫实验室提供;蛋 白酶K购于Sigma公司；Premix Taq、DL2000 DNAMarker、pMD19_T载体、反转录试剂盒均购自 TaKaRa公司；胶回收试剂盒和质粒提取试剂盒购自OMEGA公司；琼脂糖购自Biowest; GenomeLab? Separation Gel、GenomeLab? GeXP Start Kit、 GenomeLab? Separation Buffer、GenomeLab Sample Loading Solution、DNA Size Standard_400and Mineral Oil 购自美国Beckman公司，其余试剂均为国产分析纯。
[0059]主要仪器:凝胶成像系统和梯度PCR扩增仪，美国BI0-RAD有限公司；GenomeLab? GeXP遗传分析系统，美国Beckman公司；高速冷冻离心机，Heraens有限公司；DYY-7C电泳仪 和电泳槽，北京市六一仪器厂等。
[0060] 1.3核酸的提取及反转录
[0061] 按照商品化DNA/RNA提取试剂盒使用说明书提取患病动物的组织或病毒的细胞增 殖液的全基因组，若为RNA病毒则进行反转录制备用于检测的cDNA。
[0062] 反转录按照反转录试剂盒说明书在10μ1体系中进行：2μ1 5 X PrimeScript buffer(包括dNTP Mixture和Mg+)，0.5yl PrimeScript RT Enzyme Mix I，25pmol Oligo dT Primer，200pmol Random 6mers，3yl模板，2μ1 RNase Free dH2〇。在PCR仪上37°C反应 15min，然后再 85°C 反应 5seC(3cDNA 保存在-20°C〇
[0063] 1.4临床样本，临床病料来自四川齐全等猪场送检的流产胎儿，共58份，包括肝脏、 脾脏、肺脏、肾脏等均由四川农业大学动物检疫实验室保存(表1)。
[0064] 1.5.GeXP_PCR 引物的设计
[0065] 参照GenBank中PRV gB(JF797219)、CSFV E2(KC533781)、ASFV P72(AY578708)、 PRRSV(AY262352)、PPVNS1(AY583318)、PCV20RF1(AY678532)和JEVE(M55506)基因组序 列，选取保守序列，借助DNAStar和Oligo 6.0软件，设计7对引物特异性引物，再将一段通用 (非同源性序列）引物标签（TagF : 5 ' -AGGTGACACTATAGAATA-3 ' · TagR : 5 ' -GTACGACTCACTATAGGGA-3 '）分别加在各病毒特异性引物的5 '，构成特异性嵌合引物。上游通 用引物的5 '用Cy5进行标记，引物由上海生工合成(表2)。
[0066] 表2.GeXP引物信息
[0068] 注:下划线表示的是通用引物.
[0069] 1.5.测序
[0070]用不含有通用序列的特异性引物分别扩增7种阳性样本的DNA/cDNA，ddH20为阴性 对照，进行扩增单重PCR扩增。用E.Z.N.A.TM胶回收试剂盒(0MEGA)，按照说明书的操作步骤 回收扩增片段，纯化回收的目的片段与PMD19-T载体连接后转化于DH5a受体菌中。阳性克隆 产物扩大培养后送交宝生物工程（大连）有限公司进行序列测定。测序结果用DNASTAR software进行分析，并GenBank登录的各病毒的基因序列进行比对。其结果显示各病毒基因 序列与NCBI中登录的各病毒基因序列的核苷酸同源性均高达99%。
[0071] 2.1.单重 GeXP-PCR 实验
[0072]以DNA/cDNA为模板进行单重GeXP-PCR反应，确定各靶基因的实际检测大小。在整 个实验中都以无核酸酶的水为空白对照，将特异性嵌合引物稀释至lyM，Cy5_Tag F和Tag R 稀释至ΙΟμΜ，采用25μ1 PCR反应体系在Thermo PCR扩增仪上进行扩增(表3)。
[0073] 取ΙμL 10倍稀释了的PCR产物加入到预先配置好的39μ1上样缓冲液中（38.75μ1 SLS+0.25yl DSS-400)，混匀过后再每孔上方滴一滴矿物油以防止液体政法所带来的交叉 污染，最后再在上样缓冲板对应的孔中加入大约250μ1的分离缓冲液，准备完成后放入 GenomeLab? GeXP System选择Frag-3分离方法进行多重基因表达系统毛细管电泳分析。毛 细管电泳结束后，使用自定义GeXP片段分析参数对分离后的片段分析，以确定各靶基因对 应的实际检测长度(信号值超过2000A.U.即为阳性）。
[0074]表3. PCR反应体系及条件
[0076] 2 · 2 ·多重GeXP-PCR检测体系的建立及优化
[0077]用已经确定的病毒核酸作为模板，无核酸酶的水为空白对照。等量混合各特异性 嵌合引物，使其工作浓度为ΙμΜ，其余反应条件同单重GeXP-PCR，建立多重GeXP-PCR检测反 应体系。
[0078] 调节各重组质粒的浓度，以7种病毒的重组质粒混合物(各病毒质粒浓度一致)为 模板，以改变某一参数固定其它参数的方式分别对多重GeXP-PCR检测反应进行优化。反应 条件中退火温度最为重要，本实验以57°C、58°C、59°C、60°C、61°C、62°C为退火温度，做梯 度PCR以确定最佳退火温度。多重GeXP-PCR反应体系中各特异性嵌合引物的浓度与比例至 关重要，本实验涉及两种引物，预实验中发现通用引物的浓度变化对实验结果影响不大，故 将其固定为20μΜ，针对各病毒嵌合引物设计一个正交实验，用以确定各病毒特异性嵌合引 物的最佳浓度比。
[0079] 取ΙμL 10倍稀释了的PCR产物进行多重基因表达系统毛细管电泳分析。毛细管电 泳结束后，使用自定义GeXP片段分析参数对分离后的片段分析，以确定各靶基因对应的实 际检测长度(信号值超过2000A. U.即为阳性）。
[0080] 2.3GeXP多重PCR反应特异性及灵敏度
[0081] 根据多重反应体系优化结果，配制多重混合引物工作液，用建立的GeXP多重检测 体系分别对表1中的各阳性样本进行PCR反应，产物用毛细管电泳进行检测，验证GeXP多重 PCR检测体系的特异性；以随机混合的带目的片段的重组质粒为模板进行PCR反应，测其交 叉反应性。
[0082] 将含有各病毒目的片段的克隆质粒进行10倍连续梯度稀释至：105拷贝/μ1，104拷 贝/μL，1〇 3拷贝/μL，1〇2拷贝/μL，101拷贝/μL，先进行GeXP单重PCR扩增，观察其最低检测限， 再以各梯度等比混合液为模板，用最优的GeXP多重PCR进行扩增，观察其最低检测限。
[0083] 2.4临床样本的检测
[0084] 对58份已通过国标验证为阳性的临床样品进行多重GeXP-PCR检测（表1 )，并对两 者的检测结果进行比较。
[0085] 3 结果
[0086] 3 · 1单重 GeXP-PCR 实验
[0087] 在单重GeXP-PCR实验中，每对特异性引物都能扩增出相应地目的片段，阴性样本 扩增结果均为阴性，各条带大小如下:PRV:156-160bp，CSFV:195-196bp，ASFV:227-288bp, PRRSV:258-261bp,PPV:284-285bp,PCV2:337-341bp and JEV:360-361bp(图 2)
[0088] 3 · 2多重GeXP-PCR检测体系的建立及优化
[0089] 正交实验的结果显示:PRV，ASFV，PPV上下游特异性嵌合引物的最适浓度均为1.5μ Μ，PRRSV，CSFV，PCV2，JEV上下游特异性嵌合引物的最适浓度均为ΙμΜ，上下游通用引物为20 μΜ。特异性嵌合引物的最佳退火温度为60°C，通用引物的最佳退火温度为50°C。
[0090] 3.3GeXP多重PCR反应特异性及灵敏度
[0091] 在多引物体系中，每个反应只出现特异性信号，并且无交叉反应性(图3)
[0092] GeXP单重PCR灵敏度结果显示，对PRV的最低检测量为103copiesAU，对CSFV的最 低检测量为102copiesAU，对ASFV的最低检测量为103copiesAU，对PRRSV的最低检测量为 102copiesAU，对PPV的最低检测量为 103copiesAU，PCV2的为 102copiesAU，JEV的为 103copiesAU。当7种病毒同时存在时，GeXP多重PCR的最低检测限度为lOOOcopies/μΙ。 [0093] 3.3临床样本的检测
[0094]通过对已验证为阳性的58份临床样品的检测，发现其结果与国标检测结果一致 (表1 )，本发明可同时检测出7种病原体，在节约人力、物力的同时能够快速对临床样本作出 诊断。
[0095]以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精 神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种检测猪繁殖障碍病毒的多重GeXP-PCR方法，其特征在于，所述检测猪繁殖障碍 病毒的多重GeXP-PCR方法采用含7种猪繁殖障碍病毒靶基因的PRV，ASFV，PPV，PRRSV，CSFV， PCV2，JEV嵌合引物和通用引物以适当配比参加 PCR反应，PRV，ASFV，PPV上下游特异性嵌合 弓丨物的浓度均为1.5μΜ，PRRSV，CSFV，PCV2，JEV上下游特异性嵌合引物的浓度均为ΙμΜ，特异 性嵌合引物的最佳退火温度为60°C，通用引物的最佳退火温度为50°C。2. 如权利要求1所述的检测猪繁殖障碍病毒的多重GeXP-PCR方法，其特征在于，所述检 测猪繁殖障碍病毒的多重GeXP-PCR方法包括以下步骤： 待测样品制备，按照商品化DNA/RNA提取试剂盒使用说明书提取患病动物的组织或病 毒的细胞增殖液的全基因组，若为RNA病毒则进行反转录制备用于检测的cDNA; PCR扩增：25yL PCR反应液包含:ExTaq酶12.5yL、引物Mix 9yL、待测样品DNA lyL、无核 酸酶灭菌水2.5yL;其中，所述引物Mix含有:PRV，ASFV，PPV上下游特异性嵌合引物各1.5μΜ; PRRSV，CSFV，PCV2，JEV上下游特异性嵌合引物各ΙμΜ;上下游通用引物各20μΜ，共9yL; 按如下步骤进行扩增：951€3〇8,6〇1€3〇8,721€258，12个循环 ；951€3〇8,5〇1€3〇8,721€ 258,20个循环；721€511^11; 毛细管电泳：取ΙμL 10倍稀释了的PCR产物加入到预先配置好的39μ1上样缓冲液中 (38.75μ1 SLS+0.25yl DSS-400)，混匀过后再每孔上方滴一滴矿物油以防止液体政法所带 来的交叉污染，最后再在上样缓冲板对应的孔中加入大约250μ1的分离缓冲液，准备完成后 放入GenomeLabTM GeXP System选择Frag-3分离方法进行多重基因表达系统毛细管电泳分 析； 使用自定义GeXP片段分析参数对分离后的片段分析，判定结果。3. 如权利要求1所述的检测猪繁殖障碍病毒的多重GeXP-PCR方法，其特征在于，所述7 种猪繁殖障碍病毒靶基因的PRV，ASFV，PPV，PRRSV，CSFV，PCV2，JEV嵌合引物的序列如下： PRV F:AGGTGACACTATAGAATAAGGGGTTGGACAGGAAGGA R:GTACGACTCACTATAGGGAGCATCGCCAACTTCTTCCA CSFV F:AGGTGACACTATAGAATAAGGCCTCACCACTACGTGGA R:GTACGACTCACTATAGGGAAGGTGGGTAGAGCCCTCTTA ASFV F:AGGTGACACTATAGAATATGGCCCTCTCCTATGCAA R:GTACGACTCACTATAGGGATGCGTCCGTAATAGGAGT PRRSV F:AGGTGACACTATAGAATAACCTCCAGATGCCGTTTGT R:GTACGACTCACTATAGGGAACAAGGTTTACCACTCCCT PPV F:AGGTGACACTATAGAATAACCTAAGTCCAAGTGACTGCT R:GTACGACTCACTATAGGGATAGGTTAGTAGCGATACCCA PCV2F:AGGTGACACTATAGAATATGCAGAAGCGTGATTGGAAGA R:GTACGACTCACTATAGGGAACGGGGTCTGATTGCTGGTA JEV F:AGGTGACACTATAGAATAAGGAGCCATCGTGGTGGAGT R:GTACGACTCACTATAGGGATCCATCTCGACCAGCACCT 〇4. 如权利要求1所述的检测猪繁殖障碍病毒的多重GeXP-PCR方法，其特征在于，所述7 种猪繁殖障碍病毒靶基因的PRV，ASFV，PPV，PRRSV，CSFV，PCV2，JEV嵌合引物的各条带大小 如下：PRV: 156-160bp，CSFV: 195-196bp，ASFV: 227-288bp，PRRSV: 258-26lbp，PPV: 284- 285bp,PCV2:337-341bp and JEV:36〇-361bp〇5.如权利要求1所述的检测猪繁殖障碍病毒的多重GeXP-PCR方法，其特征在于，所述检 测猪繁殖障碍病毒的多重GeXP-PCR方法： 对PRV的最低检测量为103copiesAU ; 对CSFV的最低检测量为102copiesAU ; 对ASFV的最低检测量为103copiesAU ; 对PRRSV的最低检测量为102copiesAU ; 对PPV的最低检测量为103copiesAU ; PCV2的为 102copiesAU，JEV的为 103copiesAU ; 当7种病毒同时存在时，最低检测限度为lOOOcopies/μΙ。
【文档编号】C12Q1/70GK105969910SQ201510996088
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2015年12月25日
【发明人】王印, 胡凌, 杨泽晓, 姚学萍, 林星宇, 邬旭龙, 李桂黎, 任梅渗, 肖璐, 张鹏飞, 曾相杰, 冷伊依
【申请人】四川农业大学