冬凌草甲素荧光探针、制备及其在靶细胞定位中的用图
【专利摘要】本发明涉及一类新型的冬凌草甲素荧光衍生物，具体涉及将荧光发色团连接到冬凌草甲素骨架上获得的冬凌草甲素荧光探针。本发明还公开了这些冬凌草甲素荧光衍生物的制备方法以及用于抗肿瘤机制研究及其对癌症治疗的潜在用途，特别涉及这类荧光探针在检测冬凌草甲素作用靶细胞定位中的应用。
【专利说明】
冬凌草甲素荧光探针、制备及其在靶细胞定位中的用途
技术领域
[0001] 本发明涉及抗肿瘤活性天然产物冬凌草甲素荧光探针衍生物的制备，特别涉及这 类荧光探针用于检测冬凌草甲素在靶细胞定位中的应用。
【背景技术】
[0002] 预防和治疗肿瘤疾病是全人类的梦想，科学家们为此正艰苦而不懈地努力。而随 着生命科学研究的快速发展，人们对肿瘤机制的研究正在不断深入，许多抗肿瘤药物随之 被研发出来，其中天然药物占有相当大的比例。虽然天然产物具有较好的抗肿瘤作用，但是 许多天然产物的抗肿瘤机制尚不明确，这一缺点使得这些天然产物的临床应用受到限制， 因此，探索天然产物抗肿瘤作用机制迫在眉睫。
[0003] 我国对映-贝壳杉烷型二萜化合物资源丰富，其中冬凌草甲素作为天然活性产 物，在抗肿瘤、抗菌等方面有着很好的应用前景，其临床疗效确切、毒副作用较小。大量的研 究表明，冬凌草甲素对白血病、淋巴瘤、宫颈癌、乳腺癌、胃癌、食管癌、肝癌、肺癌等二十多 种肿瘤细胞都具有较好的抑制或杀伤作用。
[0004] 然而，冬凌草甲素的抗肿瘤分子机制尚未完全阐明，细胞内的作用靶点与作用模 式也不明确，相关分子作用机制有待探索。故通过一定的技术手段，探明冬凌草甲素在靶细 胞作用中的亚细胞定位，将有助于阐明其作用靶点和作用机制。
[0005] 自从1967年Wieland第一个将鬼臼环肽用异硫氰酸荧光素进行标记，合成荧光标 记的天然产物以来，合成天然产物荧光探针分子，进而研究其生物学性质已成为研究天然 产物作用模式、结合位点等生物学相关性质的有力工具，特别是近年来小分子荧光探针在 天然产物的细胞内定位、靶点寻找等相关领域研究得到了广泛的应用。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供一种冬凌草甲素荧光探针及其在细胞内定位中的应用。
[0007] 本发明公开了一种冬凌草甲素荧光探针，其含有荧光发色基团和冬凌草甲素骨架 结构，如通式（I)所示：
[0008]
[0009] 其中n值为1-5, m值为1-8。
[0010] 进一步地，n优选2-3, m优选3-5。
[0011] 本发明中所述的冬凌草甲素荧光探针，最优选n为3, m为4。
[0012] 所述荧光探针含有冬凌草甲素骨架，保留了冬凌草甲素的抗肿瘤活性，能够发挥 癌症治疗作用。进一步的肿瘤细胞实验证明，所述探针能够抑制肿瘤细胞的生长，对癌症治 疗具有潜在功效。
[0013] 上述的冬凌草甲素荧光探针的制备方法概述如下：
[0014] (1)在室温下，将香豆素荧光化合物与二醇混合，加入缩合剂反应得到相应的醇产 物；（2)将得到的醇产物与酸酐在DMAP作用下得到酸衍生物；（3)将步骤（2)中得到的酸衍 生物与冬凌草甲素在缩合剂存在下反应得到冬凌草甲素荧光探针衍生物。
[0015] 其合成路线如下：
[0017] 作为本发明制备方法的一个优选方案，步骤（1)中的溶剂为二氯甲烷，反应温度 为室温，使用丁二醇的当量为10个当量。
[0018] 步骤（1)中使用10个当量丁二醇可以减少二聚体副产物产生，提高目标产物收 率。
[0019] 作为本发明的另一个优选方案，步骤（2)中的反应条件为室温反应36个小时。因 为二醇的反应活性不强，反应时间对产率较重要，36个小时反应可以保证得到较高产率的 酸衍生物。
[0020] 作为本发明的另一个优选方案，步骤（3)中的反应时间为0. 5小时。鉴于冬凌草 甲素上的羟基较多，反应时间长容易产生较多副产物。
[0021] 本发明还提供了所述冬凌草甲素荧光探针用于冬凌草甲素抗肿瘤机制研究的用 途，其检测方法简单，包括以下步骤：
[0022] a.将靶细胞用浓度为0. 5-10 y mol的冬凌草甲素荧光探针处理1-24小时，得到荧 光探针处理的靶细胞；
[0023] b.将步骤a中得到的靶细胞加入细胞器专属染料探针，得到细胞器探针标记的靶 细胞；
[0024] c.将步骤b中所得到的靶细胞在激光共聚焦显微镜下观察冬凌草甲素荧光探针 与靶细胞器探针的荧光位置，根据荧光的重叠情况确定冬凌草甲素在靶细胞中的定位。
[0025] 作为本文明的一个优选方案，所述步骤a是在靶细胞中加入浓度为1 y mol的冬凌 草甲素荧光探针，在细胞培养箱中培养至少1个小时。
[0026] 本发明中的方法可以用于检测哺乳动物的任何细胞，优选的靶细胞为肿瘤细胞。
[0027] 本发明中的细胞器探针可以根据检测的细胞器的不同，选择细胞生物学上可以接 受的任何探针，所优选的细胞器探针为细胞膜荧光探针、线粒体荧光探针或者是细胞核荧 光探针。更为优选的是线粒体红色荧光探针（MitoTracker?De印Red FM)。
[0028] 试验结果证实，该发明所述的冬凌草甲素荧光探针能快速地进入到细胞中，并高 选择性地标记线粒体，有望开发成一种线粒体专属染料。
[0029] 本发明具有以下有益效果：提供了一种具有香豆素荧光发色基团与冬凌草甲素结 构骨架的荧光探针，该探针具有较好的抗肿瘤作用，兼有治疗与作用靶点研究的用途；本发 明提供了这类荧光探针的制备方法，条件温和，工艺简单；本发明同时也公开了运用激光共 聚焦显微镜来检测不同靶细胞中冬凌草甲素荧光探针细胞分布的情况，为进一步研究冬凌 草甲素细胞内作用靶点和作用机制奠定了基础。
【附图说明】：
[0030] 图1 :冬凌草甲素荧光标记探针d对肿瘤细胞的杀伤作用。
[0031] 图2 :冬凌草甲素荧光探针与IfepG2细胞孵育后不同时间点细胞内的染色情况：
[0032] a图为染色0分钟；b图为染色5分钟；c图为染色10分钟；d图为染色15分钟；e 图为染色30分钟；f图为染色60分钟。
[0033] 图3 :冬凌草甲素荧光探针与线粒体专属荧光染料探针在A549细胞内的共定位染 色图：
[0034] a图为冬凌草甲素荧光探针的染色图，b图为两部分的叠加图，c图为线粒体专属 荧光染料探针的染色图。
【具体实施方式】 [0035] 实施例1
[0036] 冬凌草甲素荧光探针的合成
[0037] 将化合物a(lg，3. 83mmol，lequiv.)与 1，4_丁二醇（3. 45g，38. 27mmol，lOequiv.) 溶于二氯甲烷中（20.0 mL)，室温搅拌18h，浓缩后加入水，乙酸乙酯提取（30mLX3)，合并有 机层，水洗，饱和食盐水洗，无水Na2S0 4干燥，浓缩后柱层析（MeOH/CH2Cl2l : 100, v/v)得 到目标化合物 b(1.06g，83% )。虫 NMR(300MHz，CDC13) : S (ppm) 1.23 (t，J = 6.0Hz，6H)， 1. 26(m，2H)，1. 89(m，2H)，2. 08(br，1H)，3. 44(q，J = 6. 0Hz，4H)，3. 73(t，J = 6. 0Hz，2H)， 4.35(t，J = 6.0Hz，2H)，6.46 (d，J = 2. 4Hz，lH)，6.61 (dd，J = 9.0, 2. 4Hz，lH)，7.36 (d， J = 9. 0Hz，lH)，8.44 (s，lH) ;13C NMR(CDC13,75MHz) (ppm) 164.0,158.0,152. 5,149.0， 130. 6,109. 1，107. 2,96. 2,64. 7,61. 5,44. 6,29. 0,24. 5,12. 0 ;MS(ESI)m/z :334. 3[M+H] +。
[0038] 将化合物 b(lg，3. Ommol, lequiv.)与戊二酸酐（480mg，4. 5mmol, 1. 5equiv.) 溶于二氯甲烷中（20.0 mL)，加入催化量DMAP，室温搅拌36h，浓缩后加入水，乙酸乙酯 提取（30mLX3)，合并有机层，水洗，饱和食盐水洗，无水Na 2S04干燥，浓缩后柱层析 (MeOH/CH2Cl2l : 80, v/v)得到目标化合物 c(1.02g，78 % )。虫 NMR(300MHz，CDC13): S(ppm)1.23(t，J = 6.0Hz，6H)，1.79(m，4H)，2.02(m，2H)，2.46(m，4H)，3.45(q，J = 6.0Hz，4H)，4.17(t，J = 6.0Hz，2H)，4.35 (t，J = 6.0Hz，2H)，6.46 (d，J = 2. 4Hz，lH)， 6.61(dd，J = 9.0,2.4Hz，lH)，7.36(d，J = 9.0Hz，lH)，8.43(s，lH) ;13C NMR(CDC13,75MHz): 8 (ppm) 152. 5,148. 8,130. 6,109. 1,96. 2,64. 1,63. 6,44. 6,32. 7,32. 3,29. 2,24. 9,24. 8, 19. 4,11. 9 ;MS(ESI)m/z :448. 2[M+H] +。
[0039] 将化合物 c (lg，2. 65mmol，lequiv.)与冬凌草甲素（1. 01g，2. 78mmol， 1. 05equiv.)溶于二氯甲烷中（20.0 mL)，加入催化量DMAP，缩合剂EDCI，室温搅拌0? 5h，浓 缩后加入水，二氯甲烧提取（30mLX 3)，合并有机层，水洗，饱和食盐水洗，无水Na2S04干燥， 浓缩后柱层析（MeOH/CH 2Cl2l : 80，v/v)得到目标化合物 d(l. 54g，80% )。4 NMR(300MHz， CDC13) : S (ppm) 1. 11(S，6H)，1. 28(t，J = 7. 2Hz,6H,N(CH,CH,)J，1. 52 (m，6H)，1. 85 (m，5H)， 1.90(m，4H)，2.24(m，lH)，2.34(m，4H)，2.61(m，lH)，3. 18(d，J = 9.9Hz，lH)，3.47(q，J = 7. 2Hz,4H, N(CH2CH3)2) ,3. 77(m, 1H) ,4. 29,4. 05(dd, JA= J B= 10. 8Hz, each 1H, 20-CH 2), 4. 11 (m，2H)，4.33 (m，2H)，5.50 (s，lH)，5.87 (s，lH)，6.04 (d，J= 10.5Hz，1H)，6. 15 (s，lH)， 6.46(d，J = 2.4Hz，lH，Ar-H)，6.61(dd，J = 9.0,2.4Hz，lH，Ar-H)，7.37(d，J = 9.0Hz， lH，Ar-H)，8.42(lH，s，Ar-H) ;13C NMR(CDC13,75MHz) (ppm)206.1，172.3，170.9，163.7， 158. 0,152. 5,149. 4,148. 7,130. 6, 125. 0,119. 6,109. 1，107. 2,96. 2,95. 6,75. 8,73. 6， 72. 9,64. 1，63. 6, 62. 9,61. 4, 59. 2,54. 1，44. 6,40. 8,38. 2,33. 2,33. 0,32. 5,32. 1，30. 0， 29. 8,29. 4,29. 1，24. 9,24. 8,21. 2,19. 3,11. 9 ;MS(ESI)m/z :792. 4[M-H]，754. 6[M+H]+; HR-MS(ESI, M+H)m/z ：calcd for C43H56N013：794. 3746, found 794. 3765.
[0040] 实施例2
[0041 ] 冬凌草甲素荧光探针的抗肿瘤增殖活性
[0042] 将处于对数生长期的肿瘤细胞消化、计数、制成浓度为5X 104个/mL的细胞悬液， 96孔板中每孔加入100 y 1细胞悬液（每孔5X 103个细胞）。96孔板置于37°C，5% C0 2培 养箱中培养24小时后用完全培养基稀释药物至所需浓度，每孔加入100 y L相应的含药培 养基。96孔板置于37°C，5% C02培养箱中培养72小时后将96孔板进行MTT染色；每孔加 入20 y LMTT (5mg/mL)，在培养箱继续培养4小时；弃去培养基，每孔加入150 y LDMS0溶解， 摇床10分钟轻轻混勾；A = 490nm，酶标仪读出每孔的0D值，计算抑制率。实验结果（见 图1)表明，本发明中的冬凌草甲素荧光探针具有较好的抗肿瘤增殖效果，兼具肿瘤治疗作 用。
[0043] 实施例3冬凌草甲素荧光探针染色IfepG2细胞
[0044] 选取对数生长期的IfepG2细胞接种到放置在6孔板中的玻璃盖玻片上，每孔 5X10 5个细胞，贴壁24小时后加入化合物d(lyM in DMS0)在完全培养基中孵育不同的时 间点（0, 5,10,15, 30,60分钟）。在孵育相应的时间后，细胞用4%的多聚甲醛（in 1XPBS) 固定10分钟，用PBS洗涤后就可以将玻璃盖玻片取出用于荧光成像。在荧光显微镜下观察 细胞着色部位，荧光分布及亮度变化等，其结果见图2。由图可知，冬凌草甲素荧光探针能够 快速进入细胞中。
[0045] 实施例4
[0046] 冬凌草甲素荧光探针和线粒体红复染实验
[0047] 选取对数生长期的A549细胞接种共聚焦培养皿中，每皿IX 104个细胞，贴壁24 小时后加入化合物d(l yM in DMS0)在完全培养基中孵育1个小时，成像结果由Zeiss LSM 710共聚焦显微镜（Zeiss，Germany)获得。冬凌草甲素荧光探针的激发波长采用 405nm，发射波长采用460±20nm，线粒体专属染色体的激发波长采用579nm，发射波长采用 600 ± 10nm。先用明镜显微镜寻找到细胞视野，然后切换到激光共聚焦视野，进行断层扫描 寻找最佳切片图像，其结果如图3所示。由图可知，冬凌草甲素荧光探针与线粒体专属荧光 探针有着很好的重叠，说明冬凌草甲素荧光探针主要定位在线粒体。
【主权项】
1. 通式（I)的冬凌草甲素巧光探针衍生物或其药学上可接受的盐：其中：n = 1-5, m = 1-8。2. 权利要求1的冬凌草甲素巧光探针衍生物或其药学上可接受的盐，其中n = 2-3, m =3-5 O3. 权利要求2的冬凌草甲素巧光探针衍生物或其药学上可接受的盐，其中n = 3，m = 4。4. 权利要求1所述的冬凌草甲素巧光探针衍生物的制备方法，其中具体步骤如下： (1) 在室溫下，将香豆素巧光探针与二醇混合，加入缩合剂反应得到相应的醇产物； (2) 将得到的醇产物与酸酢在DMAP作用下得到酸衍生物； (3) 将步骤（2)中得到的酸衍生物与冬凌草甲素在缩合剂存在下得到冬凌草甲素巧光 探针。5. 根据权利要求4所述巧光探针衍生物的制备方法，其特征在于：步骤（1)中的二醇 的反应当量为10个当量。6. 权利要求1中的巧光探针化合物用作肿瘤治疗的用途。7. 权利要求1中的巧光探针化合物在祀细胞定位中的方法，其特征在于包括W下步 骤： (a)将祀细胞用浓度为0. 5-10 y mol的冬凌草甲素巧光探针处理1-24小时，得到巧光 探针处理的祀细胞； 化）将步骤a中得到的祀细胞加入细胞器专属染料探针，得到细胞器探针标记的祀细 胞； (C)将步骤b中所得到的祀细胞在激光共聚焦显微镜下观察冬凌草甲素巧光探针与祀 细胞器探针的巧光位置，根据巧光的重叠情况确定冬凌草甲素在祀细胞中的定位。8. 根据权利要求7所述的祀细胞定化其特征在于：步骤（a)中加入浓度为1 y mol的 冬凌草甲素巧光探针，在细胞培养箱中培养1个小时。9. 根据权利要求7所述的祀细胞定位，其特征在于：步骤化）中所述的细胞器专属染 料探针为线粒体红色巧光探针。10. 权利要求1中所述的巧光探针在生物技术领域用于癌细胞成像、分子祀点确定或 线粒体定位的用途。
【文档编号】C07D493/08GK105985352SQ201510066677
【公开日】2016年10月5日
【申请日】2015年2月4日
【发明人】徐进宜, 徐盛涛, 姚鸿, 罗姗姗, 王诚倩, 张晨曦, 李达翃, 裴玲玲, 王光雨, 胡梅
【申请人】中国药科大学