一种提高原核包涵体表达复性率的复性液及其制备方法和应用
【专利摘要】本发明属于生物技术领域，具体为一种提高原核包涵体表达复性率的复性液及其制备方法和应用。本发明提供了一种优化后的复性液，该复性液可以使粗制品半抑制率比原来提高近一倍，显著提升了科研单位及生产企业的重组蛋白制品的制备效率与利润收益，该复性液的制备方法简单，适合规模化工业生产的需要。通过对HER2阳性乳腺癌靶向药物使用本发明的复性液及变复性方法进行生产，有效解决了TP25包涵体表达中复性效率低下问题，提高了复性液中活性蛋白的回收率。
【专利说明】
一种提高原核包涵体表达复性率的复性液及其制备方法和 应用
技术领域
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体为一种提高原核包涵体表达复性率的复性液及其 制备方法和应用。
【背景技术】
[0002] 原核表达是一种常用的异源表达方式，利用此表达系统能实现快速、大量、高效获 得重组蛋白的目的，而且拥有耗时短、可控性强等优势，所以很多企业都选用此表达系统， 但这种表达方式在表达过程中极易形成包涵体，虽然包涵体预示着较大的表达量，但经变 复性后的活性回收率大大降低，影响了生产效率与收益，加大了产品的生产成本。
[0003] 我国每年乳腺癌新增病例超二十万，30%为HER2阳性，TP25是针对HER2阳性乳腺 癌的新型靶向抗肿瘤药物，它是利用现代基因工程技术手段，通过原核表达方式获得的一 类蛋白药物，然而由于其表达过程中极易形成包涵体，活性回收率大大降低，影响了生产效 率与收益，加大了产品的生产成本，因此，寻找一种有效的制备HER2阳性乳腺癌靶向药物 TP25包涵体的复性液及复性方法，使其既能提高蛋白复性率又能有效降低复性成本，具有 非常重要的生产实践意义。
【发明内容】
[0004] 为解决上述问题，本发明的目的之一是提供了一种提高原核包涵体表达复性率的 复性液。
[0005] 为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
[0006] 一种制备HER2阳性乳腺癌靶向药物TP25包涵体的复性液，包括以下组份：100mM Na2HP04 ;l·4mMGSH;lmMEDTA;0·5M精氨酸;0·5M尿素，所述复性液的pH值为8·5。
[0007] 本发明的目的之二是提供了上述提高原核包涵体表达复性率的复性液的制备方 法。本发明采用如下技术方案：
[0008] 如上所述的一种提高原核包涵体表达复性率的复性液的制备方法，包括以下步 骤:精确称取精氨酸、Na2HP0 4和EDTA，加入到15 °C~30 °C的注射用水中搅拌溶解，用冰醋酸 调ph至8.5，然后加入尿素搅拌溶解，用15 °C~30°C注射用水补足余量，常温下继续搅拌30 分钟，然后预冷至7~12°C，使用前一小时在搅拌条件下加入GSH，一直搅拌至使用。
[0009] 本发明的目的之三是提供了如上所述的一种提高原核包涵体表达复性率的复性 液在HER2阳性乳腺癌靶向药物TP25包涵体变复性中的应用。
[0010] 作为优选，上述应用的具体方法步骤为：
[0011] (1)菌种活化和发酵培养:进行菌种活化培养，然后进行放大诱导发酵培养，收集 发酵液中的菌体细胞，利用超生破碎法获得表达出的包涵体；
[0012] (2)包涵体变复性:使用lys i s buffer对包涵体进行清洗，以10~14ml/mg的比 例向收集到的洁净包涵体中加入预冷至2~8°C的变性液进行变性，充分搅拌后离心收集变 性完全的蛋白溶液，在250~300rpm搅拌速度下，以1:70~1:120倍体积比将变性液逐滴加 入7~12 °C的上述复性液中，将复性液在7~12 °C条件下复性14~18小时；
[0013] ⑶蛋白精制:根据工艺要求，进行纯化工艺，最终获得目的蛋白制品。
[0014]作为优选，步骤(2)中所述变性液与复性液的体积比为1:120。
[0015] 作为优选，步骤（2)中所述变性液包括以下组份:6M Guani dine-Cl，100mM磷缓 (pH=8.0),2mM EDTA,6mM DTT〇
[0016] 作为优选，所述步骤(2)中，12000~15000rpm、6~10°C条件下离心15~20分钟收 集变性完全的蛋白溶液。
[0017] 作为优选，所述步骤(2)中，复性结束后将复性液在10000~12000rpm、2°C~8°C条 件下离心30~45分钟，收集上清液，再进行超滤浓缩后便得到复性后的蛋白溶液。
[0018] 作为优选，所述步骤(1)中进行放大诱导发酵培养时IPTG使用浓度为O.lmM。
[0019] 本发明的有益效果为：
[0020] (1)本发明提供了一种优化后的复性液，该复性液可以使粗制品半抑制率比原实 验步骤提高近一倍，显著提升了科研单位及生产企业的重组蛋白制品的制备效率与利润收 益。该复性液的制备方法简单，适合规模化工业生产的需要。
[0021] (2)通过对HER2阳性乳腺癌靶向药物使用一种优选的包涵体复性液及变复性方法 进行生产，有效解决了 TP25包涵体表达中复性效率低下问题，提高了复性液中活性蛋白的 回收率。
[0022] (3)通过实验对比分析，复性方法选用滴加稀释法，使蛋白回收率由74%提高至 89% 〇
[0023] (4)通过大量实验研究得到，制备HER2阳性乳腺癌靶向药物TP25包涵体的复性方 法中，在相同表达时间前提下，IPTG用量为0.1 mM时诱导表达的包涵体量比1.0M时要大，所 以选定IPTG使用浓度为0.1 mM，这使IPTG使用量缩减为原来的10%，表达量比1.0M诱导量提 升21%，缩减成本的前提下带来了蛋白表达量的提高，另外用量的减少也降低了最终产品 IPTG残留，利于产品质量。
【附图说明】
[0024] 图1:不同处理所得样品SDS-PAGE图。
【具体实施方式】
[0025]下面结合实施例，对本发明的技术方案做进一步具体说明。
[0026] 实施例1
[0027] 一种提高原核包涵体表达复性率的复性液，包括以下组份：100mM Na2HP〇4; 1.4mM GSH; ImM EDTA; 0.5M精氨酸;0.5M尿素，所述复性液的pH值为8.5。
[0028]所述的提高原核包涵体表达复性率的复性液是由以下方法制得的：
[0029]精确称取87.1 克L-精氨酸；35.814克Na2HP〇4; 0.29224克EDTA，用700ml、15°C注射 用水中进行搅拌溶解，冰醋酸调pH至8.5,加入30.03克尿素溶解后用15°C注射用水补至 1000ml，常温下继续搅拌30分钟，然后预冷至12°C，使用前一小时在搅拌条件下加入430毫 克GSH(还原性谷胱甘肽），一直搅拌至使用。
[0030] 实施例2:使用不同复性液所得粗制品的半抑制浓度对比
[0031] 设置不同配方复性液组，其缓冲体系都为PH = 9.5的100mM磷酸盐缓冲液，并测定 使用对应复性液所得粗制品半抑制浓度(IC50)，复性液组成如下所示，所测IC50结果如表1 所示。
[0032] Buffer l:lmM GSH&0.4mM GSSG;2%(v/v)甘油；0.1M尿素；0.1M NaCl;0.1M精氨 酸；ImM EDTA。
[0033] Buffer2:lmM GSH&0.4mM GSSG;2%(v/v)甘油；0.1M尿素；0.1M NaCl;0.3M精氨 酸；ImM EDTA。
[0034] Buffer3:lmM GSH&0.4mM GSSG;2%(v/v)甘油；0.1M尿素；0.1M NaCl;0.5M精氨 酸；ImM EDTA。
[0035] Buffer4:1.4mM GSH;2%(v/v)甘油；0.1M尿素；0.1M NaCl;0.1M精氨酸；ImM EDTA。
[0036] Buffer5:1.4mM GSH;2%(v/v)甘油；0.1M尿素；0.1M NaCl;0.3M精氨酸；ImM EDTA。
[0037] Buffer6:1.4mM GSH;2%(v/v)甘油；0.1M尿素；0.1M NaCl;0.5M精氨酸；ImM EDTA。
[0038] Buffer7:1.4mM GSH;0.5M尿素；0.5M精氨酸；ImM EDTA。
[0039] Buffer8:1.4mM GSH;0.5M精氨酸；ImM EDTA。
[0040] 表2.使用不同复性液所得粗制品半抑制浓度
[0041]
[0042]由表1中数据可知，使用Buffer 7复性液所得粗制品的IC50最低，因此选定其为最 终使用复性液。选定复性液组成成分后，进行了复性液PH的确定，选择8.5与9.5两组，复性 液组成如下所示，IC50结果如表2所示。
[0043] Buffer l(PH=9.5):1.4mM GSH;lmM EDTA;0.5M精氨酸；0.5M尿素。
[0044] Buffer 2(PH=9.5):1.8mM GSH;lmM EDTA;0.5M精氨酸。
[0045] Buffer 3(PH=8.5):1.4mM GSH;lmM EDTA;0.5M精氨酸；0.5M尿素。
[0046] 表3.使用不同pH的复性液所得粗制品半抑制浓度
[0047]
[0048] 由半抑制浓度可知，当复性液pH为8.5时，复性效果更优，因此最终确定复性液配 方为:pH=8.5;100mM Na2HP04;1.4mM GSH;lmM EDTA;0.5M精氨酸；0.5M尿素。
[0049] 优化后的复性液使粗制品半抑制率比原实验步骤提高40%以上，显著提升了科研 单位及生产企业的重组蛋白制品的制备效率与利润收益。
[0050]实施例3:变复性方法的确定
[0051 ]分别用透析和稀释两种方法进行复性实验对比，透析复性选择盐酸胍浓度分别为 4M; 3M; 2M; 1M; 0M五个浓度，进行逐步去除胍盐透析复性，结果如表1所示：
[0052] 表1.不同复性方法对比
[0053]
[0054]由表中结果可知，透析法的蛋白回收率比稀释法低，且在中间过程用肉眼可发现 大量蛋白沉淀，透析操作过程人为因素影响较大，透析换液繁琐，对产业化有较多不便因 素，因此选用滴加稀释法复性，有效提高蛋白回收率至89 %以上。
[0055] 实施例4
[0056] 一种提高原核包涵体表达复性率的复性液在HER2阳性乳腺癌靶向药物TP25包涵 体变复性中的应用，具体方法步骤如下：
[0057] 1.菌种活化。将带有质粒的工程菌株(E.col i BL21)划线接种与含50ug/ml卡那 霉素选择性LB平板，恒温37°C培养至出现单菌落，挑取单菌落与含抗生素液体LB培养基中 进行过夜培养。
[0058] 2.发酵培养。将培养好的种子以1:80的比例转接，进行放大发酵培养，2.5小时对 发酵液进行0D600检测，当0D值达到0.6~0.7时加入IPTG至终浓度0.1 mM，诱导表达8小时。
[0059] 3.包涵体制备。将发酵液转入离心管，10000rpm、2°C ;离心15分钟收集菌体，并记 录湿菌体量。以 12ml/mg的比例加入Lys i s buffer I(50mM Tr i s pH8.0,20mM EDTA, lOOmM NaCl，5%tr i ton-X 100)进行菌体重悬，然后加入溶菌酶至终浓度180ug/ml，室温 静置20分钟后冰浴超生破碎。将破碎菌体以12000rpm、10°C离心25分钟收集包涵体并记录 包涵体湿重，以 12ml/mg的比例分别用Lys i s buffer I与Lys i s buffer I I(50mM Tr i s pH8.0,20mM EDTA，100mM NaCl)清洗包涵体四次，最后 10°C、12000rpm离心 15min收集 包涵体。以 12ml/mg的比例加入2M Guani dine-HCl buffer(50mM NaCl，100mM Tr i s_Cl (pH8.0)，6mM DTT)清洗包涵体两次，最后用Lys i s buffer I I清洗两次，得到洁净的 TP25包涵体。
[0060] 4.包涵体变复性。将收集到的洁净TP25包涵体以14ml/mg的比例加入预冷至2°C的 Denature buffer(6M Guani di ne-Cl，100mM磷缓（pH=8.0)，2mM EDTA，6mM DTT)进行包 涵体变性，待全部包涵体溶解后，15000rpm、10 °C离心20分钟，收集上清即为所得变性液。在 搅拌条件下，将变性液逐滴缓慢加入已准备好12°C的复性液中，全部加完后继续搅拌30分 钟，放置12°C条件下静置14小时。然后将复性液在12000rpm、8°C条件下离心30分钟，收集上 清液，再进行超滤浓缩后便得到复性后TP25蛋白溶液。
[0061] 5.蛋白精制。利用阴离子交换层析技术进行初步纯化，最终获得纯度为92%的 TP25蛋白，蛋白回收率达85%以上。
[0062]实施例5: IPTG诱导浓度的优化
[0063] 分别选取IPTG终浓度为0.1;0.4;0.7;1.011^，以及发酵时间为1 ;2;3;4;5;6;7小时 做正交处理试验，破壁后收集包涵体，将各不同处理样品等量上样进行SDS-PAGE，检测表达 量。1到4号分别为IPTG 0.1;0.4;0.7;1.OmM诱导一小时的电泳结果，随后四个为两小时，以 次类推，结果如图1所示。
[0064]
[0065]
[0066]结果显示前三小时蛋白整体表达水平较低，从四小时后开始积累，且各不同浓度 差异不明显，因此直接选用〇. 1与1. OmM进行重复实验，表达情况如表4所示：
[0067] 表4.不同IPTG用量所得包涵体量
[0068]
[0069]注:上表中数据为每400ml发酵液收集包涵体变性后总蛋白量。
[0070]由上表可知，在相同表达时间前提下，IPTG(诱导剂）用量为O.lmM时诱导表达的包 涵体量比1.0M时要大，所以选定IPTG使用浓度为O.lmM，这使IPTG使用量缩减为原来的 10%，表达量比1.0M诱导量提升21%，缩减成本的前提下带来了蛋白表达量的提高，另外用 量的减少也降低了最终产品IPTG残留，利于产品质量。
【主权项】
1. 一种提高原核包涵体表达复性率的复性液，其特征在于包括以下组份：l〇〇mM Na2HP04;1.4mMGSH ;lmMEDTA;0.5M精氨酸;0.5M尿素，所述复性液的pH值为8.5。2. 如权利要求1所述的一种提高原核包涵体表达复性率的复性液的制备方法，其特征 在于包括以下步骤:精确称取精氨酸、Na2HP〇4和EDTA，加入到15 °〇30 °C的注射用水中搅拌 溶解，用冰醋酸调ph至8.5,然后加入尿素搅拌溶解，用15t>3(TC注射用水补足余量，常温 下继续搅拌30分钟，然后预冷至7~12°C，使用前一小时在搅拌条件下加入GSH，一直搅拌至 使用。3. 如权利要求1所述的一种提高原核包涵体表达复性率的复性液在HER2阳性乳腺癌靶 向药物TP25包涵体变复性中的应用。4. 如权利要求3所述的应用，具体方法步骤为： 菌种活化和发酵培养:进行菌种活化培养，然后进行放大诱导发酵培养，收集发酵液中 的菌体细胞，利用超生破碎法获得表达出的包涵体； 包涵体变复性:使用lysis buffer对包涵体进行清洗，以10~14ml/mg的比例向收集到 的洁净包涵体中加入预冷至2~8°C的变性液进行变性，充分搅拌后离心收集变性完全的蛋 白溶液，在250~300rpm搅拌速度下，以1:70~1:120倍体积比将变性液逐滴加入7~12°C的上 述复性液中，将复性液在7~12°C条件下复性14~18小时； 蛋白精制:根据工艺要求，进行纯化工艺，最终获得目的蛋白制品。5. 如权利要求4所述的应用，其特征在于步骤(2)中所述变性液与复性液的体积比为1: 120〇6. 如权利要求4所述的应用，其特征在于所述步骤(2)中所述变性液包括以下组份:6M Guanidine-Cl, 100 mM 磷缓（pH= 8.0)，2mM EDTA, 6mM DTT〇7. 如权利要求4所述的应用，其特征在于所述步骤(2)中，12000~15000rpm、6~10°C条件 下离心15~20分钟收集变性完全的蛋白溶液。8. 如权利要求4所述的应用，其特征在于所述步骤(2)中，复性结束后将复性液在10000 ~12000rpm、2°08°C条件下离心30~45分钟，收集上清液，再进行超滤浓缩后便得到复性后 的蛋白溶液。9. 如权利要求4所述的应用，其特征在于所述步骤（1)中进行放大诱导发酵培养时IPTG 使用浓度为O.lmM。
【文档编号】C12P21/02GK106008668SQ201610498793
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年6月29日
【发明人】曹强庚, 庞广礼, 彭延杰, 林童俊, 李锋, 梁邦领
【申请人】山东省生物制品研究所