用于防治青枯病的泛菌及其应用
【专利摘要】本发明公开了一株用于防治青枯病的泛菌及其应用。该菌株的名称为泛菌(Pantoea coffeiphila)GZ?33，保藏编号为CCTCC M 2016352，于2016年6月27日保藏于位于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心。该泛菌菌株在LB培养基中生长良好，菌株细胞杆状，在LB琼脂平板上培养时菌落表面光滑半透明，边缘整齐；该泛菌菌株对青枯菌具有明显的拮抗作用，又为防治青枯病提供了一种途径。CCTCC NO: M 201635220160627
【专利说明】
用于防治青枯病的泛菌及其应用
技术领域
[0001] 本发明设及农业生物技术领域，具体设及一株用于防治青枯病的泛菌及其应用。
【背景技术】
[0002] 植物细菌性青枯病是由青枯劳尔氏菌Ralstonia solanacearum引起的一种维管 束毁灭性±传细菌性病害，在亚热带、热带和溫带地区发生普遍系统侵染的毁灭性±传病 害，俗称"植物攝病"。青枯劳尔氏菌寄主广泛，可侵染54个科的450余种植物。目前，细菌性 青枯病的防治是世界公认的一大难题，它广泛分布于世界各地，在我国南方省市发生严重， 尤其在浙江，近年来不但茄科、瓜类受害，大面积发生的桑青枯病更对蚕业生产造成严重损 失。
[0003] 青枯菌有很多小种，根据青枯菌的寄主范围分为5个生理小种，小种1主要危害多 数茄科植物，包括番茄、马铃馨、茄子和烟草等，还危害其他科植物;小种2能侵染香蕉、海里 康化eliconais)和大蕉等植物;小种3主要危害马铃馨，也可弱侵染烟草和番茄;小种4侵染 姜W及弱侵染马铃馨等其他植物。另有研究人员将从我国南方桑树上分离到的青枯病菌株 命名为小种5。侵染马铃馨的青枯病菌主要是小种1和小种3。
[0004] 目前，青枯病的防治方法主要有加强田间管理、培育抗病品种、使用化学药剂和施 用生防菌剂等，但实践证明，田间管理难W有效控制青枯病发生，抗性材料的选育耗时长， 而化学防治污染环境、破坏生态平衡，且化学药剂的长期使用易使病原菌产生抗药性。因 此，利用生防菌株及其活性产物防治生姜青枯病越来越受到人们的重视。大量研究表明，部 分细菌、放线菌是较理想的青枯病括抗菌。
【发明内容】
[0005] 本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一株用于防治青枯病的 泛菌。
[0006] 本发明的另一目的在于提供所述的用于防治青枯病的泛菌的应用。
[0007] 本发明的目的通过下述技术方案实现:一株用于防治青枯病的泛菌，名称为泛菌 (Pantoea coffei地ila)GZ-33,保藏编号为CCTCC Μ 2016352,于2016年6月27日保藏于位 于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中屯、。
[0008] 所述用于防治青枯病的泛菌在防治青枯病中的应用。
[0009] 所述用于防治青枯病的泛菌在防治青枯病中的应用，是将泛菌菌液施加于培养农 作物的±壤中或是喷洒在农作物的表面。
[0010] 所述的农作物为易于被青枯菌感染的农作物;优选为茄科作物;更优先为茄子。
[0011] 所述的农作物可为已被青枯菌感染的农作物，或是未被青枯菌感染的农作物。
[0012] -种青枯病生物防治菌剂，含有上述用于防治青枯病的泛菌。
[0013] 本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果:本发明提供了一株对青枯劳尔氏 菌具有括抗作用的泛菌，为青枯病的防治又提供了一种途径。
【附图说明】
[0014] 图1是本发明中青枯病括抗菌生防试验效果图。
[0015] 图2是本发明中菌株GZ-33单菌落的照片图。
【具体实施方式】
[0016] 下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限 于此。
[0017] 实施例1:细菌进行分离纯化：
[001引 1、培养基
[0019] LB琼脂培养基仙固体培养基）：蛋白腺lOg，酵母提取物5g，化C1 1 Og，琼脂15g，用 出0定容至 1000ml，PH 7.0-7.2。121°C灭菌20分钟。
[0020] 2、实验步骤
[0021] (1)样品采集:选择具代表性的地点（青枯病发病田地中健康植株根系±壤，地点 广东省），伊去表层±，用采±工具采取距离地表下5~10厘米深度的±层中的±壤，每个地 点采5个样本，装入袋中并作好记录。
[0022] (2)±壤稀释液的制备:称取10曰±壤，放入装有90mL无菌水的Ξ角瓶中充分振荡， 制成1:10浓度的上壤稀释液。待上粒沉淀后，吸取1ml上清液，移入盛有9ml灭菌水的试管 中，制成1:100浓度的±壤悬浮液，依次类推，制成1:1000和1:10000的±壤悬浮液，制成10 -2、1 〇-3、1 〇-4、1 〇-5和1 〇-6倍的±壤溶液备用。
[002；3] (3)细菌分离:选择ιοΛιοΛιο-哺10-6四个浓度各0.11111，将稀释的±壤悬浮液分 别倒入LB培养基培养皿中，将涂布棒在酒精灯火焰充分灼烧灭菌，待冷却后涂布平板。将接 种完的培养皿倒置，30摄氏度恒溫培养，设置Ξ个重复。
[0024] (4)结果:分离得到细菌384株。
[0025] 实施例2:分离得到的细菌对青枯菌的平板括抗试验
[0026] 1、培养基
[0027] TTC固体培养基：①蛋白腺lOg，酸水解酪蛋白（Casein Acid Hy化olysateHg，葡 萄糖5g，琼脂15g，用出0定容至1000ml，P册.8-7.2; 121°C灭菌20分钟，得到溶液I;②TTC(2， 3,5 -氯化Ξ苯四氮挫）用蒸馈水配成质量百分比1%的溶液，用0.22WI1滤膜过滤除菌，得到 溶液II;③在溶液I冷却至约45°C时，每lOOmL溶液I加入0.5mL溶液II，即可倒平板。
[00巧]TTC液体培养基：不加琼脂和TTC即可。
[0029] 2、实验步骤
[0030] 2.1平板括抗试验--初筛
[0031] 2.1.1菌种活化
[0032] 青枯菌和细菌进行菌种活化:青枯菌GMI1000 (ATCC)和实施例1分离得到的384株 细菌分别转接至TTC固体培养基平板和LB固体培养基平板，分别于28Γ培养2天W及于3(TC 培养1天，备用。
[0033] 2.1.2青枯菌平板的制备
[0034] 活化的青枯菌接入TTC液体培养基中进行摇瓶培养，28°C，200rpm培养2天，得到青 枯菌发酵液。隔天WTTC固体培养基倒平板，等培养基凝固后每个平板中加入O.lmKODsoo约 2.0) 青枯菌发酵液，涂布均匀，吹干备用，得到青枯菌平板。
[00巧]2.1.3平板括抗试验初筛
[0036] 用灭菌的牙签挑取活化的384株细菌单菌落，点接在青枯菌平板上，每个平板接30 株不同的括抗菌，3个重复，28 °C培养，24h、3化和4她分别观察实验结果，主要观察抑菌圈的 有无。
[0037] 2.2平板括抗试验--复筛 [003引 2.2.1菌种活化
[0039] 同2.1.1，活化选择初筛有抑菌圈的分离细菌。
[0040] 2.1.2青枯菌平板的制备
[0041 ]活化的青枯菌接入TTC液体培养基中进行摇瓶培养，28°C，200rpm发酵2天，得到青 枯菌发酵液。隔天WTTC固体培养基倒平板，等培养基凝固后每个平板中加入O.lmKODsoo约 2.0) 青枯菌发酵液，涂布均匀，吹干后打孔器（〇5mm)打孔，每个平板打一个孔备用。
[0042] 2.2.3分离细菌液体发酵
[0043] 在青枯菌液体摇瓶培养的第二天，活化的分离细菌转入LB液体培养基中进行摇瓶 培养，30°C，200巧m培养24小时（0〇6日日约2.0)。
[0044] 2.2.4平板括抗试验复筛
[0045] 用移液枪吸取10μ1分离细菌发酵液放入青枯菌平板的孔中，吹干，3个重复，28°C 培养。24h、3化和4她分别观察实验结果，主要观察抑菌圈的有无和大小。
[0046] 3、结果
[0047] 通过初筛试验得到有括抗效果的细菌53株，通过平板括抗试验打孔复筛，抑菌圈 越明显，说明括抗作用越好。复筛得到括抗效果较好的细菌6株，菌株GZ-33就是其中一株， 其对青枯菌的抑菌圈明显。
[004引实施例3:菌株GZ-33的生物防治效果试验
[0049]为了检验菌株GZ-33的生防效果，将菌株GZ-33发酵液在盆栽上对青枯病进行生防 效果试验。
[(K)加]实验步骤：
[00引]1.1买茄子苗
[0052] 买在大棚中育好的茄子苗。
[0053] 1.2苗移栽
[0054] 在花盆(规格170mm*160mm)装满基质±，略压紧，然后每盆移入1株茄子苗，诱水后 两指在根部略压紧，在大棚中培养。花盆中培养4周左右。
[0055] 1.3青枯菌和括抗菌活化和发酵液制备
[0056] 青枯菌GMI1000和括抗菌GZ-33分别活化，然后挑单菌落分别接入TTC液体培养基 和LB液体培养基摇瓶培养，分别于28°C和30°C，200巧m，培养约两天(到0〇6日日都约2.5)。
[0057] 1.4青枯菌和括抗菌接种
[0化引本实验设置2个对照组，即CK1和CK2，CK1:不加任何菌，只加入5ml TTC液体培养 基;CK2:只加5ml青枯菌发酵液，不加括抗菌发酵液。菌株GZ-33处理:按照体积比青枯菌:括 抗菌为1:1、1:2.5和1:5，做3个处理，每个处理5盆，每株根部先诱5ml青枯菌发酵液，然后再 诱5ml、12.5ml、25ml括抗菌发酵液。
[0059] 1.5 记录
[0060] 隔一天记录发病植株数和发病严重程度。
[0061] 2、结果
[0062] 如图1所示，人工接种后，只接TTC液体培养基的对照组CK1不发病，死亡率0,直接 青枯菌GMI1000发酵液的对照组CK2全部发病，死亡率100%，接种青枯菌GMI1000发酵液和 括抗菌GZ-33发酵液的处理组1:1、1:2.5、1:5死亡率分别为20%、0、0，由此可见，括抗菌GZ- 33发酵液处理能使茄子植株青枯病的发生得到有效控制。
[0063] 实施例4:对分离得到的细菌进行鉴定
[0064] 经广东省微生物分析检测中屯、检测，其检测依据为《常见细菌系统鉴定手册》（东 秀珠主编科学出版社)《伯杰细菌鉴定手册》第九版W及《分子克隆实验指南》第二版黄培堂 译2002科学出版社），鉴定结果为：菌种GZ-33的16S rDNA序列与化ntoea coffei地ila(泛 菌）的同源性达98.06%，其形态特征及生理生化特性与化ntoeacoffei地ila(泛菌)最相 似。具体检测结果如下：
[0065] (1)该保藏菌株的形态、培养、生理、生化等特征如下：
[0066] Pantoea coffeiphila GZ-33:属泛菌（Pantoea coffeiphila);在LB培养基中生 长良好，菌株细胞杆状，在LB琼脂平板上培养时菌落表面光滑半透明，边缘整齐（如图2所 示)。
[0067] (2)菌株GZ-33的理化实验结果，如表1所示。
[0068] 表1菌株GZ-33理化实验结果
[0069]
[0071] 注：'V'表示阳性，表示阴性。
[0072] (3)菌株GZ-33 16S rRNA基因序列测定结果如下：
[0073]
[0074] 将16S rRNA基因序列进行Blast结果分析，得到与化ntoea coffeiphila相似度达 98.06%，其形态特征及生理生化特性与化ntoea coffeiphila最相似，因此根据16S rRNA 基因序列测定和形态特征、生理生化特性结果来看，该菌株可W归为泛菌（Pantoea coffeiphila)。
[00巧]将GZ-33命名为泛菌(Pantoea coffei地ila)GZ-33,保藏编号为CCTCC M2016352， 于2016年6月27日保藏于位于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中屯、。
[0076]上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的 限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化， 均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一株用于防治青枯病的泛菌，其特征在于：名称为泛菌(Pantoea coffeiphila)GZ-33,保藏编号为CCTCC Μ 2016352,于2016年6月27日保藏于位于中国武汉武汉大学的中国 典型培养物保藏中心。2. 权利要求1所述用于防治青枯病的泛菌在防治青枯病中的应用。3. 根据权利要求2所述用于防治青枯病的泛菌在防治青枯病中的应用，其特征在于:是 将泛菌菌液施加于培养农作物的土壤中或是喷洒在农作物的表面。4. 根据权利要求3所述的用于防治青枯病的泛菌在防治青枯病中的应用，其特征在于： 所述的农作物为易于被青枯菌感染的农作物。5. 根据权利要求4所述的用于防治青枯病的泛菌在防治青枯病中的应用，其特征在于： 所述的农作物为茄科作物。6. -种青枯病生物防治菌剂，其特征在于：含有权利要求1所述用于防治青枯病的泛 菌。
【文档编号】C12N1/20GK106011032SQ201610614076
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年7月29日
【发明人】邓音乐, 宋施豪, 尹文芳, 张春燕, 杨春喜, 崔朝宇
【申请人】华南农业大学