与苎麻产量关联的ssr标记及其应用
【专利摘要】本发明公开了一种与苎麻产量关联的SSR标记，包括SSR标记RAM144和RAM123。本发明还公开了与苎麻产量关联的SSR标记在培育苎麻新品种中的用途和与苎麻产量关联的SSR标记在稳定或提高苎麻产量中的用途。本发明提供的SSR标记与苎麻的产量直接相关，本发明为今后筛选优良种质、基因定位和克隆以及分子标记辅助育种打下基础，本发明的SSR标记能够用于苎麻的分子育种及提高苎麻产量中。对于现阶段我国苎麻的育种和生产具有重要意义。同时，本发明也为分子标记育种提供了有益的借鉴。
【专利说明】
与兰麻产量关联的SSR标巧及其应用
技术领域
[0001] 本发明设及一种与巧麻产量关联的SSR标记及其应用。
【背景技术】
[0002] 巧麻(8〇6]111161'1曰]1；[￥6曰1^.6曰11(1)，又叫"中国草"，起源于中国，为等麻科巧麻属的多 年生宿根性草本植物，是具有中国特色的天然纺织原料。目前，巧麻是我国第二大纤维作 物。尽管巧麻产量相比W前已有了较大提高，但提高纤维产量仍是巧麻育种的重要目标。作 物的产量性状是极其复杂的数量性状，是作物整个生命周期内一系列生长发育过程和环境 互作的最终产物，通常由多基因控制。巧麻纤维产量构成要素包括株高、茎粗、皮厚、出麻率 和分株力等子性状。研究表明，运些性状是数量性状，其遗传受微效多基因控制，通过传统 育种技术进行遗传改良效率受限。
[0003] 寻找目标数量性状连锁分子标记，通过分子标记辅助选择，可W有效提高数量性 状的遗传改良进程。现代育种有必要利用植物遗传多样性平台，并结合最新的基因组技术 来发现新基因或等位基因，用于性状的改良。利用DNA分子标记技术和QTUquantitative 化ait loci)作图方法对巧麻产量相关性状的QTL报道较少，报道的连锁分子标记仅有33 个，限制了分子标记在育种上的利用。基于连锁不平衡化inkage disequil化;rium，LD)的关 联分析(Association analysis)是挖掘新等位基因的有效方法。关联分析W自然群体为研 究对象，W长期重组后保留下来的基因（位点）间连锁不平衡为基础，将目标性状表型的多 样性与基因（或标记位点）的多态性结合起来分析，可直接鉴定出与表型变异密切相关且具 有特定功能的基因位点或标记位点。
【发明内容】
[0004] 本发明的一个目的是解决至少上述问题和/或缺陷，并提供至少后面将说明的优 点。
[0005] 本发明还有一个目的是提供一种与巧麻产量关联的SS財示记，W解决巧麻分子育 种中连锁分子标记少的问题。
[0006] 本发明再有一个目的是提供与巧麻产量关联的SSR标记在培育巧麻新品种中的用 途。
[0007] 本发明另有一个目的是提供与巧麻产量关联的SSR标记在稳定或提高巧麻产量中 的用途。
[000引为此，本发明提供的技术方案为：
[0009] 一种与巧麻产量关联的SSR标记，包括SSR标记RAM144和RAM123。
[0010] 优选的是，所述的与巧麻产量关联的SSR标记中，还包括SSR标记RAM598、RAM156和 RAM130。
[0011] 优选的是，所述的与巧麻产量关联的SSR标记中，还包括SSR标记RAM39。
[0012] 优选的是，所述的与巧麻产量关联的SSR标记中，还包括SSR分子标记RAM147。
[001引优选的是，所述的与巧麻产量关联的SSR标记中，所述SSR分子标记RAM144和 RAM123与巧麻头季麻和二季麻的株高相关联，所述SSR标记RAM598、RAM156和RAM130与巧麻 二季麻和Ξ季麻的株高相关联。
[0014] 优选的是，所述的与巧麻产量关联的SSR标记中，所述SSR标记RAM39与巧麻头季麻 和二季麻的单覺分株数相关联。
[0015] 优选的是，所述的与巧麻产量关联的SSR标记中，所述SSR标记RAM147与巧麻的二 季麻和Ξ季麻的单覺分株数相关联。
[0016] 优选的是，所述的与巧麻产量关联的SSR标记中，所述SSR标记RAM144还与巧麻的 二季麻和Ξ季麻的出麻率相关联，所述SSR分子标记RAM156还与巧麻头季麻和二季麻的株 局相关联。
[0017] 所述的与巧麻产量关联的SSR标记在培育巧麻新品种中的用途。
[0018] 所述的与巧麻产量关联的SSR标记在稳定或提高巧麻产量中的用途。
[0019] 本发明至少包括W下有益效果：
[0020] 与传统QTL定位方法相比，GWAS采用遗传背景丰富的自然群体为材料，不需要花多 年时间构建特定的分离群体，具有作图定位精度高、能同时扫描控制目标性状所有关联位 点的优点。
[0021] 本发明提供的SS财示记与巧麻的株高和单覺分株数相关，而株高和单覺分株数与 巧麻的产量直接相关，为今后筛选优良种质、基因定位和克隆W及分子标记辅助育种打下 基础，本发明的SS財示记能够用于巧麻的分子育种及提高巧麻产量中。对于现阶段我国巧麻 的育种和生产具有重要意义。同时，本发明也为分子标记辅助育种提供了有益的借鉴。
[0022] 本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本 发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
【附图说明】
[0023] 图1为本发明其中一个实施例中ΔΚ值随亚群个数变化的示意图。
[0024] 图2为本发明107份种质资源的进化树。
[0025] 注:图中每个分枝为一个样品。0.05表示在固定长度的样品间的遗传距离。
[00%]图3为本发明中SSR标记连锁强度r2统计图的一部分。
【具体实施方式】
[0027] 下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，W令本领域技术人员参照说明书文 字能够据W实施。
[0028] 应当理解，本文所使用的诸如"具有"、"包含"W及"包括"术语并不配出一个或多 个其它元件或其组合的存在或添加。
[0029] 本发明W107份巧麻自然群体为材料，利用具有多态性的95对SSR分子标记，分析 遗传多样性、群体结构等;并对其株高、分株力等性状进行一年3个环境重复鉴定W及皮厚、 出麻率等性状进行一年2个环境重复鉴定，并对其W上性状和分子标记进行关联分析，发掘 与其相关的SSR位点，为巧麻产量性状的QTL定位及其改良等研究提供科学依据。
[0030] 本发明提供一种与巧麻产量关联的SSR标记，包括SSR标记RAM144和RAM123。
[0031] 在本发明的其中一个实施例中，作为优选，所述的与巧麻产量关联的SS財示记，还 包括 SSR 标记 RAM598、RAM156 和 RAM130。
[0032] 在本发明的其中一个实施例中，作为优选，所述的与巧麻产量关联的SS財示记，还 包括SSR标记RAM39。
[0033] 在本发明的其中一个实施例中，作为优选，所述的与巧麻产量关联的SS財示记，还 包括SSR分子标记RAM147。
[0034] 在本发明的其中一个实施例中，作为优选，所述的与巧麻产量关联的SS財示记，所 述SSR分子标记RAM144和RAM123与巧麻头季麻和二季麻的株高相关联，所述SSR标记 RAM598、RAM156和RAM130与巧麻二季麻和Ξ季麻的株高相关联。
[0035] 在本发明的其中一个实施例中，作为优选，所述的与巧麻产量关联的SS財示记，所 述SSR标记RAM39与巧麻头季麻和二季麻的单覺分株数相关联。
[0036] 在本发明的其中一个实施例中，作为优选，所述的与巧麻产量关联的SS財示记，所 述SSR标记RAM147与巧麻的二季麻和Ξ季麻的单覺分株数相关联。
[0037] 在本发明的其中一个实施例中，作为优选，所述的与巧麻产量关联的SS財示记，所 述SSR标记RAM144还与巧麻的二季麻和Ξ季麻的出麻率相关联，所述SSR分子标记RAM156还 与巧麻头季麻和二季麻的株高相关联。
[0038] 本发明还提供所述的与巧麻产量关联的SSR标记在培育巧麻新品种中的用途。
[0039] 本发明还提供所述的与巧麻产量关联的SS财示记在稳定或提高巧麻产量中的用 途。
[0040] 1材料与方法 [oow 1.1供试材料
[0042] W107份巧麻核屯、种质资源为研究材料(见表1)。
[0043] 1.2田间试验和性状调查
[0044] 2014年4月下旬在湖南长沙望城实验基地种植107份巧麻种质资源的杆插苗。行距 Im，株距60cm，单行区，每行4株(兜）。随机区组设计，两次重复。2015年6月、8月、10月分别调 查头季麻、二季麻、Ξ季麻的株高、分株力等性状。其中每个小区调查15株的株高；调查4兜 麻的分株力。调查方法参照《巧麻种质资源描述规范和数据标准》。
[0045] 1.3SSR分子标记分析
[0046] 利用CTAB植物基因组DNA快速提取试剂盒提取DNA。用1 %琼脂糖凝胶电泳检测纯 度与浓度。参照化en等W的方法进行SSR-PCR"PCR产物締酷氨凝胶垂直电泳进行检测，银染 检测多态性，拍照记录条带。
[0047] 表1 107份巧麻种质资源
[004引
[0049] 1.4统计方法
[(K)加]利用SPSS软件统计表型性状的正态分布情况和相关分析;利用软件Popgenel. 32 (version 1. 31)计算化annon多样性指数、观测等位基因数(化）、有效等位基因数(Ne)、观 测杂合度化0)和期望杂合度化e);基于各个样品在各SSR位点的基因型，利用K-means聚类 算法，获得各种质间的进化树;利用STRUCTURES. 2软件，按照数学模型划分物种的类群，并 计算材料对应的Q值（即第i个材料其基因组变异源于第k个群体的概率）（王艳敏等，2008; 王西成等，2010)，作为协方差消除关联分析的假阳性，W保证物种群体结构的分析结果准 确有效。利用化pgene软件计算LD的方差组分;运用TASS化软件的MLM程序，W得到的K矩阵 和群体Q值矩阵作为协方差，在显著性水平P<〇.05下，将分子数据分别跟多个环境数量性 状数据进行Q+K+MLM混合线性模型的逻辑回归率检验。
[0051] 2结果与分析
[0化2] 2.1表型性状正态分布检验和相关分析
[0053]由表1可W看出，株高头季麻最高，Ξ季麻最低;头季麻和二季麻均符合正态分布， Ξ季麻不符合正态分布。分株数头季麻最低，Ξ季麻最高;头季麻、二季麻均不符合正态分 布，而Ξ季麻符合正态分布。
[0化4] 表1正态分布检测表
[0化5]
[0化6]
[0化7]
[005引由表2可W看出，株数在头季麻、二季麻均表现极显著负相关。
[0化9] 2.2遗传多样性分析
[0060]利用95对SSR多态性引物对107份巧麻核屯、种质进行扩增，共扩增出255个多态性 条带。每个位点等位基因数平均为2.6559,分布在2~5之间；基因多样性平均为0.5211，分 布在0.2276~0.7258之间；期望杂合度最低0，最高0.90;观察杂合度最低0.05，最高1.00。 [0061 ] 表3 95对SSR引物信息
[0062]
[0063]
[0064]
[00化]2.3群体结构分析
[0066] 利用STRUCTURE 2.2软件分析供试材料的群体结构。分析107个样品的群体结构。 分别假设107个样品的分群数化值)为2-17,进行聚类，根据ΔΚ峰值的位置来确定分群数， 结果表明，当Κ = 2时，ΔΚ最大（图1)，表明供试材料存在一定程度的群体结构，可W分为2个 亚群。
[0067] 2.4亲缘聚类分析
[0068] 进化树用来表示物种之间的进化关系，根据各类生物间的亲缘关系的远近，把各 类生物安置在有分枝的树状的图表上，简明地表示生物的进化历程和亲缘关系。基于各个 样品在各SSR位点的基因型，利用K-means聚类算法，获得各样品间的进化树。从样品间的进 化树上可W看出，各样品主要分为两大类（图2)。其中第一类包含87个品种，第二类包含20 个品种。
[0069] 2.5连锁不平衡分析
[0070] 在某一群体中，不同座位上某两个位点同时遗传的频率明显高于预期的随机频率 的现象，称连锁不平衡（1 inkage disequi 1化rium)。进行连锁不平衡分析，可W获得物种的 最小的遗传单元。本研究USSR位点为对象，利用TASS化软件对95个多态性位点进行群体连 锁不平衡分析，得到基因组内连锁不平衡的分布情况(图3)。试验得到总共95个标记的4465 个组合，当P<〇. 05时，210个位点组合处于LD，占总位点组合数的4.70%;当P<0.01时，41个 位点组合处于LD，占总位点组合数的0.92% ;按R2的范围，R2〉0.01的位点组合有2795个，占 总位点组合数的62.6% ;R2〉0.05的位点组合有1206个，占总位点组合数的27% ;R2〉0.1的位 点组合有491个，占总位点组合数的11%。总之，本研究所使用的107个材料连锁不平衡水平 很低，适合于全基因组关联分析策略进行初定位。
[0071] 2.6SSR位点与巧麻产量性状的关联分析
[0072] 为避免群体结构和亲缘关系的存在影响关联分析的准确性，应用Tassel 3.0软 件，将核屯、种质各个体的Q值和Kinship值作为协变量，基于MLM模型进行株高表型变异对标 记变异的回归分析，探求产量相关性状QTL的关联标记，并统计各位点的表型变异解释率。
[0073] 结果表明，头季麻、二季麻、Ξ季麻分别检测到7个、13个、5个株高关联分子标记(P <0.05)。其中在两个环境中同时检测到的有6个。在头季麻和二季麻中可W被同时检测到的 标记有RAM144、RAM123;在头季麻和二季麻无标记被同时检测到。在二季麻和二季麻中可W 被同时检测到的标记有RAM598，RAM156，RAM130dRAM144、RAM130在两个环境中表型变异解 释率均超过10 %。
[0074] 头季麻、二季麻、Ξ季麻分别检测到6个、3个、9个分株数关联分子标记(p<0.05). 其中在两个环境中可W被同时检测到的标记有2个。RAM147在二季麻和Ξ季麻中被同时检 巧慢1]，而RAM39在头季麻和二季麻中被同时检测到。RAM147在两个环境中表型变异解释率均 超过15%。
[0075] 在检测到的多个稳定产量相关性状SS財示记中，其中3个分子标记同时与2个性状 相关。其中RAM144与株高、出麻率相关;RAM156与株高、茎粗相关;RAM39与分株数和茎粗相 关。
[0076] 表4 8个稳定产量相关性状关联SSR标记 Γ00771
[0079] 讨论
[0080] 利用传统QTL作图方法进行巧麻性状QTL定位有很多不足。首先，由于分离群体仅 设及两个特定的亲本材料，因此只设及同一基因座的两个等位基因（巧麻是杂合体，最多可 设及4个等位基因），定位的QTL可能不是优异等位基因 (Magnus et al.2008);其次，构建群 体费时费力。巧麻构建一个群体从开始杂交到群体可WQTL定位，一切顺利的话需要3年。另 夕h由于巧麻杂交授粉技术的限制，构建过程外源花粉污染严重，获得巧麻的真实杂交后代 困难。对真伪杂交种的鉴别就是一个很费时费力的工作，且构建的群体偏分离比较严重(邹 自征，2012)。因此，本发明利用自然群体作为分析群体，不仅可充分利用种质资源的遗传多 样性和优异等位基因，而且避免了构建群体的不足。
[0081] 群体结构是影响关联分析结果的重要因素，亚群的混合使整个群体的LD强度增 强，容易造成伪关联。不同作物的遗传结构不同。例如，桃可分为7个亚群;青裸则被划分为4 个亚群。同一作物不同的自然群体有时也会表现不同的群体结构。在大豆上的研究证实了 运一点。前人关于巧麻的群体遗传结构报道不多，刘晨晨认为104份巧麻种质资源可划分为 2大类群。本研究也得到相同的结论。因此，把巧麻种质资源划分为2大类群为降低巧麻的伪 关联奠定了基础。
[0082] 连锁不平衡是关联分析的前提。自花授粉作物LD水平较高，而异花授粉作物LD水 平较低。巧麻作为异花授粉作物，也表现出了较低的LD水平，与前人的结论相同。由于LD水 平较低，进行全基因组关联分析需要较多的分子标记。而本研究所用的分子标记仅有95个， 因此，本研究只是进行了粗略意义上的全基因组关联分析，只是一定意义上的粗定位。因 此，为了得到更加可靠地结果，需要进一步扩大标记数目。
[0083] Liu通过连锁分析的方法报道了巧麻的产量性状QTL定位，共检测到9个稳定的 QTL。本研究一共发现了8个与产量性状相关的稳定分子标记。其中，株高6个，分株数2个。对 比了 Liu的结果，未发现与其任何一个分子标记重合。
[0084] 在检测到的多个稳定分子标记中，都是头季麻和二季麻或者二季麻和Ξ季麻同时 检测到。未检测到头季麻和Ξ季麻同时存在的分子标记。原因可能是巧麻是多年生作物，头 季麻和二季麻W及二季麻和Ξ季麻生理年龄相近，因此更容易挖掘到共有的分子标记。也 暗示巧麻产量性状的基因表达与生理年龄有关，相对于一年生作物，其产量性状QTL定位更 复杂。
[0085] 本发明中，表型性状的相关分析结果和关联分析结果表明，RAM144与株高、出麻率 相关;RAM156与株高、茎粗相关;RAM39与分株数和茎粗相关。多种作物的QTL定位结果表明， Q化成簇分布和一因多效十分常见。本发明表型和分子结果均暗示运些标记附近可能存在 着与2个性状相关的不同基因，或者可能存在同时控制2个性状的一个基因。W上研究为进 行分子育种提供了便利。
[0086] 运里说明的模块数量和处理规模是用来简化本发明的说明的。对本发明的分子标 记的应用、修改和变化对本领域的技术人员来说是显而易见的。
[0087] 如上所述，根据本发明，由于发现了与巧麻产量相关联的SS财示记，因此具有在分 子水平上进行巧麻育种的指导，也对提高或稳定巧麻的产量提出了技术上的指导。
[0088] 尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列 运用，它完全可W被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地 实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限 于特定的细节和运里示出与描述的图例。
【主权项】
1. 一种与苎麻产量关联的SSR标记，包括SSR标记RAM144和RAM123。2. 如权利要求1所述的与苎麻产量关联的SSR标记，其特征在于，还包括SSR标记 RAM598、RAM156 和 RAM130。3. 如权利要求1所述的与苎麻产量关联的SSR标记，其特征在于，还包括SSR标记RAM39。4. 如权利要求3所述的与苎麻产量关联的SSR标记，其特征在于，还包括SSR分子标记 RAM147〇5. 如权利要求2所述的与苎麻产量关联的SSR标记，其特征在于，所述SSR分子标记 RAM144和RAM123与苎麻头季麻和二季麻的株高相关联，所述SSR标记RAM598、RAM156和 RAM130与苎麻二季麻和三季麻的株高相关联。6. 如权利要求3所述的与苎麻产量关联的SSR标记，其特征在于，所述SSR标记RAM39与 苎麻头季麻和二季麻的单蔸分株数相关联。7. 如权利要求4所述的与苎麻产量关联的SSR标记，其特征在于，所述SSR标记RAM147与 苎麻的二季麻和三季麻的单蔸分株数相关联。8. 如权利要求2所述的与苎麻产量关联的SSR标记，其特征在于，所述SSR标记RAM144还 与苎麻的二季麻和三季麻的出麻率相关联，所述SSR分子标记RAM156还与苎麻头季麻和二 季麻的株尚相关联。9. 权利要求1所述的与苎麻产量关联的SSR标记在培育苎麻新品种中的用途。10. 如权利要求1所述的与苎麻产量关联的SSR标记在稳定或提高苎麻产量中的用途。
【文档编号】C12Q1/68GK106011136SQ201610493136
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年6月29日
【发明人】陈建华, 栾明宝, 王晓飞, 许英, 孙志民
【申请人】中国农业科学院麻类研究所