表达抑制麦长管蚜几丁质合成酶1基因的发卡rna的dna分子及其应用
【专利摘要】本发明公开了表达抑制麦长管蚜几丁质合成酶1基因的发卡RNA的DNA分子及其应用。本发明公开的表达抑制麦长管蚜几丁质合成酶1基因的发卡RNA的DNA分子结构如式(I)所示：SEQ正向?X?SEQ反向(I)；SEQ正向的序列为序列1第31?637位；SEQ反向的序列与SEQ正向的序列反向互补；X是SEQ正向与SEQ反向之间的间隔序列，在序列上X与SEQ正向与SEQ反向均不互补；X的序列为含有FAD2 Intron1的序列，FAD2 Intron1的序列为序列1的第664?1793位。实验证明，将本发明的DNA分子转化小麦得到的转基因株系可以抑制麦长管蚜的繁殖和蜕皮，可以用于农业生产上害虫的防治。
【专利说明】
表达抑制麦长管财几 Τ质合成酶1基因的发卡RNA的DNA分子 及其应用
技术领域
[0001] 本发明设及生物技术领域中表达抑制麦长管晒几下质合成酶1基因的发卡RNA的 DNA分子及其应用。
【背景技术】
[0002] 晒虫是小麦生产中的主要害虫，主要有麦无网长管晒（Metopolophium dirhodum)，麦二叉晒（Schizaphis graminum)，禾谷鎌管晒（lihopalosiphum padi)和麦长 管晒(Sitobion avenae)，分布极广，几乎遍及世界各产麦国。小麦晒虫对小麦的危害情况 几乎贯穿小麦的整个生育期，晒虫W成虫、若虫吸取小麦汁液危害小麦，排到叶片上的蜜露 降低光合作用，并传播多种病毒病，包括大麦黄矮病毒，运些不仅会导致小麦产量的严重降 低，而且在面粉的营养品质和加工品质都有严重影响。麦长管晒是小麦晒虫的优势种，每年 对小麦的产量和品质造成严重影响。
[0003] 目前防治小麦晒虫或者其他害虫主要还是依靠化学杀虫剂，虽然在一定程度上能 够减少虫害所带来的产量下降，但是长期的使用化学杀虫剂不但费用较高而且容易使晒虫 产生相应的抗性，同时导致晒虫天敌杀伤严重，环境污染加剧。近年来，随着晒虫抗药性的 增强，化学杀虫剂的使用浓度和药用量也呈现增长的趋势。
【发明内容】
[0004] 本发明所要解决的技术问题是如何抑制麦长管晒几下质合成酶1基因的表达和防 治麦长管晒。
[0005] 为解决上述技术问题，本发明首先提供了表达抑制麦长管晒几下质合成酶1 (C服1)的发卡RNA的DNA分子。
[0006] 本发明所提供的DNA分子为如式（I)所示的DNA片段：
[0007] 沈 Q疏J-X-SEQ麻（I)
[000引所述SEQ疏]的序列为麦长管晒几下质合成酶1编码基因的序列或其任意片段；
[0009]所述SEQ麻的序列与所述SEQ碰的序列反向互补；
[0010]所述X是所述沈Q施与所述沈Q麻之间的间隔序列，在序列上，所述X与所述沈Q碰与 所述SEQ麻均不互补。
[0011] 所述SEQ碰的序列可为如下al)至曰4)中的任一种：
[0012] al)序列表中序列1的第31-637位；
[0013] a2)在al)的5/端和/或y端添加一个或几个核巧酸得到的序列；
[0014] a3)与al)或曰2)限定的单链DNA具有85%W上的同一性的序列；
[0015] a4)在严格条件下与al)或曰2)限定的单链DNA杂交的序列。
[0016] a2)所述在al)的5/端和/或3/端添加一个或几个核巧酸得到的序列为在序列1的 第31-637位的5/端和/或y端添加一至十个核巧酸得到的序列。
[0017] 运里使用的术语"同一性"指与天然核酸序列的序列相似性。"同一性"包括与本发 明的序列1的第31-637位的核巧酸序列具有85 %或更高，或90 %或更高，或95 %或更高同一 性的核巧酸序列。同一性可W用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个 序列之间的同一性可W用百分比（％)表示，其可W用来评价相关序列之间的同一性。
[0018] 所述严格条件是在2 X SSC，0.1 % SDS的溶液中，在68°C下杂交并洗膜2次，每次 5min，又于0.5 X SSC，0.1 % SDS的溶液中，在68 °C下杂交并洗膜2次，每次15min;或，0.1 X SSPE(或0.1 X SSC)、0.1 % SDS的溶液中，65°C条件下杂交并洗膜。
[0019] 上述85% W上同一性，可为85%、90%或95% W上的同一性。
[0020] 所述X的序列可为含有FAD2Intronl的序列，所述FAD2Intronl的序列为序列1的第 664-1793位。
[0021] 所述X的序列可为序列1的第638-1809位。
[0022] 所述DNA片段的核巧酸序列可为序列表中序列1的第31-2416位。
[0023] 序列1中，第1-6位为Bam HI的识别序列，第7-14位和第650-657为Notl的识别序 列，第31-637位为目的片段的正向序列，第664-1793位为拟南芥FAD2Intronl的序列，第 1800-1805位和第2437-2442为EcoRI的识别序列，第1810-2416位为目的片段的反向互补序 列，第2442-2447位为Κρη I的识别序列。
[0024] 含有上式（I)所示DNA片段的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌，也属于本 发明的保护范围。
[00巧]所述重组载体可为重组表达载体或重组克隆载体；
[00%]在本发明中，所述重组表达载体中启动所述DNA片段转录的启动子为rbcs启动子。
[0027] 进一步，所述rbcs启动子的序列如序列表中序列2所示。
[0028] 在本发明的一个实施例中，所述重组表达载体具体为在PBAC202-V载体的酶切位 点插入序列1的第7-2441位所示DNA片段后得到的重组质粒;所述酶切位点具体为Κρη I和 BamH I。
[0029] 由W上式(I)所示DM片段编码得到的RNA分子也属于本发明的保护范围。
[0030] W上式（I)所示DNA片段，或所述重组载体、表达盒或重组菌，或所述RNA分子，或麦 长管晒几下质合成酶1编码基因或其任意片段在如下al)-a8)任一中的应用也属于本发明 的保护范围：
[0031] al)抑制麦长管晒几下质合成酶1基因表达；
[0032] a2)降低麦长管晒几下质合成酶1活性；
[0033] a3)降低麦长管晒几下质合成酶1水平；
[0034] a4)降低麦长管晒耐药性；
[0035] a5)抑制麦长管晒繁殖；
[0036] a6)抑制麦长管晒蚁皮；
[0037] a7)防治麦长管晒；
[0038] a8)培育抗麦长管晒的转基因植物。
[0039] 为解决上述技术问题，本发明还提供了一种培育抗麦长管晒的转基因植物的方 法。
[0040] 本发明所提供的一种培育抗麦长管晒的转基因植物的方法，包括:将上式(I)所示 DM片段导入目的植物中，得到抗麦长管晒的转基因植物。
[0041 ] 所述抗麦长管晒具体可体现在如下bl)、b2)、b3)、b4)、b5)或b6):
[0042] bl)抑制麦长管晒几下质合成酶1基因表达；
[0043] b2)降低麦长管晒几下质合成酶1活性；
[0044] b3)降低麦长管晒几下质合成酶1水平；
[0045] b4)降低麦长管晒耐药性；
[0046] b5)抑制麦长管晒繁殖；
[0047] b6)抑制麦长管晒蚁皮。
[0048] 进一步，在本发明的一个实施例中，al)和bl)中所述抑制麦长管晒的簇酸醋酶基 因表达具体为使麦长管晒的几下质合成酶1编码基因在RNA水平的表达量降低。
[0049] 本发明中，所述植物可为下述单子叶植物或双子叶植物。所述单子叶植物可为小 麦，如小麦品种"保丰104"。在本发明的一个实施例中，所述麦长管晒具体为3龄麦长管晒。
[0050] 本发明通过RT-PCR方法克隆了麦长管晒几下质合成酶基因片段，进一步构建了此 基因片段的发夹RNAi构件。将该构件转化小麦幼胚愈伤组织，获得了转基因株系。晒虫饲喂 试验表明，麦长管晒食用转基因叶片后，几下质合成酶1基因表达量显著降低、繁殖数量和 蚁皮率下降。经证明利用CHS1基因片段构建的RNAi构件能够抑制晒虫体内几下质合成酶1 基因的表达，可W用于农业生产上害虫的防治。
[0051 ]本发明旨在利用植物介导的RNAi技术创建小麦新种质，从而达到减少化学农药的 使用而控制晒虫数量的目的，对于晒虫综合防治和小麦生产具有重要意义。
【附图说明】
[0化2] 图1为麦长管晒总RNA与CHS1基因的片段。其中，A为麦长管晒总RNA，M为2000bp Ladder，l为麦长管晒总RNA提取结果；B为RT-PCR获得畑S1片段（607bp)，M为2000bp Laddera为C服1-F/C服1-R PCR扩增结果。
[0053] 图2为pBAC-rbcs-畑S1IR的构建过程。其中，A为EcoRI酶切验证结果，Μ为Ikb Laddera为酶切片段;B为Notl酶切验证结果，Μ为化b Laddera为酶切片段;C为PCR扩增重 组质粒的目标基因，Μ为2000bp Laddera为PCR扩增结果;D为化η I、BamHI酶切验证结果，Μ 为Ikb Ladder，！为ΚρηΙ与BamH I酶切地AC-rbcs-CHSlIR的结果；Ε为pBAC-rbcs-CHSlIR的 结构示意图。
[0054] 图3为To代转基因植株的PCR检测结果。其中，A为AtFAD-F/AtFAD-R PCR检测结果， B为CHS-F/C服-R PCR检测结果;Μ为2000bp Ladder，+表示地AC-rbcs-C服1，-表示受体品种 保丰104，泳道1为dd出0对照，泳道2-9为转基因植株。
[0055] 图4为Τι代转基因植株的PCR检测结果。其中，A为AtFAD-F/AtFAD-R PCR检测结果， B为CHS-F/C服-R PCR检测结果;Μ为2000bp Ladder，+表示地AC-rbcs-C服1，-表示受体品种 保丰104，泳道1为dd出0对照，泳道2-10为转基因植株。
[0056] 图5为不同转基因株系饲喂6天后麦长管晒体内CHS1基因相对表达量。**表示差异 达到极显著水平(P<〇. 01)，CK表示保丰104。
[0057] 图6为饲喂转基因株系不同天数后体内CHS1相对表达量。**表示差异达到极显著 水平(P<0.01)，bn 04表示保丰104。
[0058] 图7为转基因株系对麦长管晒繁殖数的影响。其中，纵坐标单位为"个"，bn〇4表示 保丰104，*表示差异达到显著水平(P<0.05)，**表示差异达到极显著水平(P<0.01)。
[0059] 图8为转基因株系对麦长管晒蚁皮数的影响。其中，纵坐标单位为"个"，bn〇4表示 保丰104，*表示差异达到显著水平(P<0.05)，**表示差异达到极显著水平(P<0.01)。
【具体实施方式】
[0060] 下面结合【具体实施方式】对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐 明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
[0061 ]下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
[0062] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0063] 麦长管晒(Sitobion avenae):从中国农业大学上庄实验站小麦试验田获得，按照 "王春芝，3种小麦晒虫的形态识别与防治技术，农技服务，2008，25(3): 50，58" -文记载的 方法，鉴定证实确为麦长管晒（Sitobion avenae)。其形态学特征如下：无翅孤雌晒体长 3.1mm，宽1.4mm，长卵形，草绿色至澄红色，有时头部带红色或褐色，腹部两侧有不明显的灰 绿至灰黑色斑。触角黑色，第3节有8-12个感觉圈排成一行。腹部第6-8节及腹面具横网 纹，无缘瘤。瞭粗大，黑色，长度超过中足基节。腹管长圆筒形，黑色，长为体长的1/4,在端部 有十几行网纹。有翅孤雌晒体长3.0mm，楠圆形，绿色。瞭不达中足基节。腹管长圆筒形，黑 色，端部具15~16行横行网纹，尾片长圆锥状，有8~9根毛。若晒体绿色，有时粉红色，复眼 红色，一般体较短。
[0064] P化rri cane载体:记载于"张付芸，陈伟霞，刘子擅，李保云，梁荣奇.小麦SS Π -A基 因片段的克隆及其RNAi表达载体的构建.中国农学通报，2011，27(7): 50-54"-文中的巧质 粒'。
[0065] 地AC35SI册载体:记载于"隋晓燕，赵谈，王树彬等.无载体框架结构的大豆铁蛋白 线性表达盒提高小麦巧粒铁含量的研究.农业生物技术学报，2012,20(7) :766-773"-文 中，用于基因枪遗传转化后抗性愈伤组织的筛选。
[0066] 下述实施例中的PBAC202记载于"高泽发，陈旭清，杨凤萍，梁荣奇，张立全，张晓 东。人工合成gna基因在小麦中的表达及其抗晒虫效果研究，农业生物技术学报，2006,14 (4):559-56少一文中，该载体中含有rbcs启动子和N0S终止子。将地AC202用SacI酶切，回收 4.3肺载体片段，用T4DNA连接酶自连，得到中间载体地AC202-V。
[0067] 下述实施例中的小麦品种"保丰104"是中国农业科学院植物保护研究所白粉病组 培育的天津审定的小麦推广品种，在文献"周益林，段霞瑜，盛宝钦，司权民。高产抗病冬小 麦新品种一一保丰104。麦类作物学报，2003,23(4): 147"中公开过，公众可从中国农业大学 获得。
[0068] 实施例1、表达抑制麦长管晒几下质合成酶l(CHSl)基因的目的片段的获得
[0069] 1、目的片段的获得
[0070] 设计如下引物：
[0071] CHS1-F 5'-AACAGTACCAGTCACCATGTC-3'
[0072] CHS1-R 5 '-CGACGAGCGCACTGATCTTC-3 '
[0073] 扩增片段长度为607bp。
[0074] 取麦长管晒成虫，用TRIzol试剂盒提取麦长管晒成虫总RNA(图1中A)，图中，28S、 18S都很清晰，说明提取的总RNA可W用于RT-PCR。利用该总RNA、引物(CHS 1-F和CHS 1-R)进 行RT-PCR，得到607bp左右的麦长管晒CHS1基因目的片段（图1中B)。扩增程序:扩增前在95 °(：初始变性5111111，？0?扩增为35个循环，循环程序为:95°(：变性453,56°(：退火453,72°(：延伸 50s，最后一个循环结束后，在72°C延伸10min，4°C保存。
[0075] 回收目的片段，将其连接到pGEM-T Easy载体(Promega公司）上，将在pGEM-T &isy 载体上连入序列1的第31-637位所示的DM片段的重组载体命名为pTE-C服1。
[0076] 2、重组质粒地AC-rbcs-C服1IR的构建
[0077] 2.1目的片段反向插入FAD2Intronl的下游
[0078] 用EcoRI分别酶切步骤1的pTE-CHSl和pHurricane，分别回收前者0.服b左右的片 段和后者的载体骨架大片段，将两个片段连接后得到重组质粒，对连接后得到的重组质粒 进行酶切验证（图2中A)，挑选重组质粒进行序列测定，根据测序结果选择目的片段反向插 入尸402111*'〇111的下游的重组质粒。该重组质粒为将序列1的第1810-2416位插入 FAD2Intronl的下游的重组质粒，将该重组质粒命名为地SK-FAD2I1-C服1。
[00巧]2.2目的片段正向插入FAD2Intronl的上游
[0080] 用Notl分别酶切步骤1的pTE-CHSl和步骤2.1的地SK-FAD2I1-CHS1，分别回收前者 约0.服b片段和后者的载体骨架大片段，将两个片段连接后得到重组质粒，对连接后得到的 重组质粒进行酶切验证（图2中B)，挑选重组质粒进行序列测定，根据测序结果选择目的片 段正向插入FAD2In化onl的上游的重组质粒。该重组质粒为将序列1的第31-637位所示的 CHS1片段正向插入FAD2Intronl的上游的重组质粒，将该重组质粒命名为pBSK-CHSlIR，从 而得到了目的片段的发夹RNAi构件。
[0081] 2.3插入启动子和终止子
[0082] 用Bam HI和Κρη I分别对步骤2.2的地SK-CHS1IR和地AC202-V进行双酶切，将得到 的含有目的片段的发夹RNAi构件的DNA片段与含有rbcs启动子和N0S终止子的DNA片段进行 连接，将得到的重组质粒转化大肠杆菌后用邸S1-F/C服1-R进行PCR扩增目的片段验证（图2 中C)并且进行酶切验证（图2中D)筛选重组质粒，将含有rbcs启动子、目的片段发夹RNAi构 件和N0S终止子的序列正确的重组质粒命名为pBAC-rbcs-CHSlIR，pBAC-rbcs-CHSlIR的结 构示意图如图2中E所示。地AC-rbcs-C服IR为将PBAC202-V的Κρη I和Bam HI识别序列间的 DNA片段替换为序列1的第7-2441位所示的DNA片段得到的重组质粒。
[0083] 序列1中，第1-6位为Bam HI的识别序列，第7-14位和第650-657为Notl的识别序 列，第31-637位为目的片段的正向序列，第664-1793位为FAD2Intronl的序列，第1800-1805 位和第2437-2442为EcoRI的识别序列，第1810-2416位为目的片段的反向互补序列，第 2442-2447位为Κρη I的识别序列。
[0084] 实施例2、转基因小麦的获得
[0085] 外植体:小麦幼胚诱导得到的愈伤组织；
[00化]菌株:大肠杆菌化scherichia coli)菌株D册α;
[0087]载体：由实施例 1 得到的pBAC-rbcs-CHSlIR，pBAC35SI 册 [008引培养基：
[0089] (a)幼胚愈伤诱导培养基，幼胚接种培养基为向MS培养基中加入2,4-D得到的固体 培养基，幼胚接种培养基中2，4-D的浓度为2g/L，pH为5.8;
[0090] (b)筛选培养基，筛选培养基为向MS培养基中添加 Basta得到的Basta浓度为 0.2mg/L的固体培养基，抑为5.8;
[0091] (C)分化培养基，分化培养基为向MS培养基中添加 IAA、反玉米素和Basta得到的 IAA、反玉米素和Basta的浓度分别为Img/L、lOmg/L和0.05mg/L的固体培养基，抑为5.8;
[0092] (d)壮苗生根培养基，壮苗生根培养基为向MS培养基中添加 IAA、PBA和薦糖得到的 IAA、PBA和薦糖浓度分别为lOmg/L、5mg/L、80mg/L的固体培养基，抑为5.8，该壮苗生根培养 基中琼脂粉的添加量为6g/L。
[0093] 选取开花后12-15天的小麦品种"保丰104" (W下简称"CK"或"bn〇4")的幼穗，将 其种子消毒后剥取幼胚，盾片向上置于幼胚接种培养基上，25±rC暗培养3-5天诱导出小 麦愈伤组织。选择生长状态良好的愈伤组织块进行基因枪共转化（将pBAC-rbcs-CHSl和 PBAC35SIH3按照3:1的摩尔比混合，其中地AC35SI册带有Bas化抗性基因 Bar),转化后的愈 伤25 ± rC暗培养2-3天后移至筛选培养基上进行除草剂抗性筛选;观察筛选1-2周之后，将 生长状态良好的抗性愈伤组织转移到分化培养基上使其分化，大约4-5周后可分化出幼苗， 将其转移到壮苗生根培养基中进行生根壮苗;炼苗2-3天后移栽至±壤中可长成To代转基 因植株。
[0094] 1、转基因植株的PCR鉴定
[0095] 转基因植株To代PCR鉴定：
[0096] WpBAC-rbcs-C服1IR作为阳性对照，受体品种保丰104作为阴性对照，用FAD2内含 子引物A tFAD-F/A tFAD-R W及CHS 1引物CHS 1-F/CHS1-R，对转基因植株To进行PCR扩增检测 (图3)，阳性植株可W分别扩增出0.95肺和0.6化左右的目标带，阴性对照和水对照没有扩 出目标片段;共筛选出阳性植株26株，图3中泳道2、3和9为阳性植株的结果。结果表明，初步 说明RNAi载体中的FAD2Intron巧日C服1片段已经转入小麦基因组中。AtFAD-F/AtFAD-R的序 列如下：
[0097] AtFAD-F:5 '-CCGCTCACGATAGATCTGCT-3 '
[009引 AtFAD-R:5 '-GGTAACGATTCAAGAGAGTCTTC-3 '
[0099] 转基因植株Τι代PCR鉴定：
[0100] 按照To代转基因植株的鉴定方法，对Τι代转基因植株进行PCR扩增检测（图4)，筛选 出阳性植株72株，属于20个株系。阳性植株可W分别扩增出944bp和610bp左右的目标带，阴 性对照和水对照没有扩出目标片段，图4中泳道2、4、6和9为阳性植株的结果。说明转基因植 株中的外源基因能够遗传到下一代。
[0101] 2、转基因 T2植株沉默麦长管晒CHS1基因表达效果分析：
[0102] 光照培养箱中种植Τι转基因阳性植株所结种子和受体品种保丰104,设置Ξ个重 复。待麦苗长到Ξ叶期的时候，对种植的麦苗进行PCR鉴定，筛选出阳性植株，每盆留9株。然 后dsCHSl-5-2、dsC服1-10-3两个株系的Τ2转基因阳性植株和受体品种保丰104每株分别接 种10头Ξ龄麦长管晒，接种当天记为接种第0天，并用玻璃罩隔离起来，防止晒虫逃逸。在用 dsCHSl-5-2、dsCHSl-10-3两个株系饲喂麦长管晒6天(接种第6天)后取20头麦长管晒进行 实时巧光定量实验，分析其CHS1基因表达的差异显著性;在用dsCHSl-5-2株系饲喂麦长管 晒第4天、第8天、第12天和第16天（即接种第4天、第8天、第12天和第16天)分别取20头麦长 管晒进行实时巧光定量实验，检测c服1基因的表达量并分析差异显著性。
[0103] 利用Primers.0分别设计不同基因的巧光定量引物，内参为Actin，巧光定量引物 如下：
[0104] CHS1-L:GCTATTGTGGCTTCTATCTCAAAC
[0105] C 服 1-R:GTCTGGTTCTTTATCTCGGTCG(扩增产物为 200bp)
[0106] 内参基因 ActinF: 5' -CCGAAAAGCTGTCATAATGAAGACC-3' ；
[0107] 内参基因4。^诚:5'-66了64440：刊61'(：了4(：了67^〔41'(：刊6-3'；
[0108] 巧光定量采用的试剂盒是TaKaRa的SYBR Premix E^aq，扩增体系如下： 2XSYBR Premix Exhq 5 uL PC民 Forward Primer (10 μ mol * L-1) 0.2 μ L PCR Reverse Primer (10 μ mol · L-1) 0.2 u L
[0109] ROX ReferenceDyell 化 2. 'pL 模板油NA 1 μ L dd也0补充至 10 μ L
[0110] 将得到的cDNA稀释10倍作为巧光定量的模板，每个样品3个重复，检测所设计引物 的特异性，找到最合适的引物退火溫度。所用的扩增反应:95°C30s，95°C5s，60°C34s，95°C 15s，60°C 1111；[]1，95"€153,40个循环。最终结果的计算采用2^"^^1；法(抗表示循环数)进行计 算，即Δ Act = (Ct (目的基因 ）-Ct (Actin))试验组-(Ct (目的基因 ）-Ct (Actin))对照组，使 用Excel 2007和SPSS19.0软件进行统计学分析，计算每种处理的平均值与方差，并进行显 著性差异的分析（3化(16]11:1：-1631:，]1 = 3,9<0.01或0.05)。
[0111] 不同的转基因株系对麦长管晒CHS1基因的干扰效果比较明显，从图5可W看出，相 对于保丰104的对照，在饲喂麦长管晒转基因株系dsC服1-10-3和dsC服1-5-2第6天(接种第 6天）麦长管晒体内的几下质合成酶1基因的表达水平极显著降低，相比对照分别降低了 50.29%，45.32%。
[0112] 饲喂麦长管晒转基因株系dsCHSl-5-2,在第4天、第8天、第12天和第16天分别取20 头麦长管晒做实时巧光定量实验，检测进食转基因植株不同天数后麦长管晒体内CHS1相对 表达量。结果如图6,在接种第4天(4d)、第8天(8d)、第12天（12d)和第16天（16d)C服1基因表 达量相比对照均明显下降，相比对照降低58.87 %、59.20%、62.06%、45.53 %，差异均达到 极显著水平(P<0.01)。
[0113] 3、转基因植株对麦长管晒繁殖数量及蚁皮数的结果分析：
[0114] 转基因植株可W抑制麦长管晒的繁殖
[0115] 光照培养箱中种植Τι转基因阳性植株种子和受体品种保丰104,设置Ξ个重复。待 麦苗长到10天(Ξ叶期）的时候，对种植的麦苗进行PCR鉴定，筛选出阳性植株，每盆留9株。 然后dsC服l-5-2、dsCHSl-10-3两个株系的Τι转基因阳性植株和受体品种保丰104每株分别 接种10头大小相同的3龄麦长管晒，接种当天记为接种第0天，并用玻璃罩隔离起来，防止晒 虫飞逸。分别在dsCHSl-5-2和dsC服1-10-3两个株系接种麦长管晒的第7天、第11天、第15天 和第19天统计麦长管晒的数量。
[0116] 结果如图7所示，用转基因株系饲喂麦长管晒不同天数后，麦长管晒繁殖数量相对 对照在第7天、第11天、第15天和第19天的时候数量均有减少，在第15天的时候，麦长管晒数 量均显著降低，到第19天的时候，dsCHSl-5-2株系饲喂的麦长管晒的数量显著降低， dsCHSl-10-3株系饲喂的麦长管晒数量相对对照极显著降低。说明，转基因小麦的植株对晒 虫的繁殖有一定的抑制作用。
[0117] 转基因植株可W抑制麦长管晒的蚁皮
[0118] 光照培养箱中种植Τι转基因阳性植株种子和受体品种保丰104,设置Ξ个重复。待 麦苗长到10天(Ξ叶期）的时候，对种植的麦苗进行PCR鉴定，筛选出阳性植株，每盆留9株。 然后dsC服l-5-2、dsCHSl-10-3两个株系的Τι转基因阳性植株和受体品种保丰104每株分别 接种5头大小相同的3龄麦长管晒，接种当天记为接种第0天，并用玻璃罩隔离起来，防止晒 虫飞逸。分别在dsCHSl-5-2和dsC服1-10-3两个株系接种麦长管晒的第6天、第10天、第14天 和第18天统计麦长管晒的蚁皮数。
[0119] 结果如图8所示，结果显示，麦长管晒的蚁皮数量一直处于增长状态。其中，dsCHSl 5-2株系在饲喂麦长管晒的第10天和第14天蚁皮数相比对照显著降低，第18天的时候达到 极显著水平。dsCHSl 10-3株系饲喂麦长管晒的第6天和第10天的时候蚁皮数相比对照显著 降低，第14天和第18天的时候差异均达到极显著水平。
【主权项】
1. 如式(I)所示的DNA片段： SEto-X-SEQ颇](I) 所述SE(to的序列为麦长管蚜几丁质合成酶1编码基因的序列或其任意片段； 所述SEQ銅的序列与所述SEQ躺的序列反向互补； 所述X是所述SEQ躺与所述SEQ銅之间的间隔序列，在序列上，所述X与所述SEQ躺与所述 SEQ颇]均不互补。2. 根据权利要求1所述的DNA片段，其特征在于:所述SEQ躺的序列为如下al)至a4)中的 任一种： al)序列表中序列1的第31-637位； a2)在al)的5'端和/或3'端添加一个或几个核苷酸得到的序列； a3)与al)或a2)限定的单链DNA具有85 %以上的同一性的序列； a4)在严格条件下与al)或a2)限定的单链DNA杂交的序列； 所述X的序列为含有FAD2Intronl的序列。3. 根据权利要求1或2所述的DNA片段，其特征在于:所述X的序列为序列1的第638-1809 位。4. 根据权利要求卜3任一所述的DNA片段，其特征在于:所述DNA片段的核苷酸序列为序 列表中序列1的第31-2416位。5. 含有权利要求1-4中任一所述DNA片段的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。6. 根据权利要求5所述的重组载体，其特征在于:所述重组载体为重组表达载体或重组 克隆载体； 所述重组表达载体中启动所述DNA片段转录的启动子为rbcs启动子。7. 权利要求1-4中任一所述DNA片段编码得到的RNA分子。8. 权利要求1-4中任一所述的DNA片段，或权利要求5或6所述的重组载体、表达盒、转基 因细胞系或重组菌，或权利要求7所述的RNA分子，或麦长管蚜几丁质合成酶1编码基因或其 任意片段在如下al)_a8)中的任一种中的应用： al)抑制麦长管蚜几丁质合成酶1基因表达； a2)降低麦长管蚜几丁质合成酶1活性； a3)降低麦长管蚜几丁质合成酶1水平； a4)降低麦长管蚜耐药性； a5)抑制麦长管蚜繁殖； a6)抑制麦长管姐銳皮； a7)防治麦长管蚜； a8)培育抗麦长管蚜的转基因植物。9. 一种培育抗麦长管蚜的转基因植物的方法，包括:将权利要求1 _4中任一所述的DNA 片段导入目的植物中，得到抗麦长管蚜的转基因植物。10. 根据权利要求8所述的应用或权利要求9所述的方法，其特征在于:所述植物为下述 cl)、c2)或c3): cl)单子叶植物； c2)双子叶植物；
【文档编号】A01H5/00GK106011138SQ201610652264
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年8月10日
【发明人】梁荣奇, 赵艳杰, 卢立华, 王雪平, 倪中福, 尤明山, 解超杰, 李保云, 彭惠茹, 姚颖垠, 杜金昆, 辛明明, 胡兆荣, 孙其信
【申请人】中国农业大学