一种水稻穗粒数Gn1a基因人工定点突变体及其应用
【专利摘要】本发明公开了一种水稻穗粒数Gn1a基因人工定点突变体及其应用。所述水稻穗粒数Gn1a基因人工定点突变体采用CRISPR/Cas9基因靶向修饰技术对Gn1a基因的第4外显子修饰，使得第4外显子的碱基发生缺失或插入而得到；CRISPR/Cas9修饰时修饰靶点长度为20bp，位于第4外显子中第164～183位碱基，靶点序列为AAGCAGTACCTGCCTTACTA。本发明采用CRISPR/Cas9对Gn1a基因的第4显子进行人工突变，并筛选出能够显著提高水稻产量的突变体。本发明提供的Gn1a基因基因人工定点突变体能够将水稻产量提高到20％以上。
【专利说明】
-种水稻穗粒数Gn1 a基因人工定点突变体及其应用
技术领域
[0001] 本发明设及水稻基因组编辑育种领域，尤其设及一种水稻穗粒数Gnla基因人工定 点突变体及其应用。
【背景技术】
[0002] 每穗粒数是水稻最重要的农艺性状之一，是水稻产量的构成因子，直接决定水稻 单产，故增加每穗粒数是水稻增产的重要途径。然而，每穗粒数是典型的数量性状，受多基 因的数量性状基因位点(如ant;Uative Trait Loci,QTL)控制。2005年，日本名古屋大学的 1曰1311〇43研究组利用釉梗交化63131^/1(〇3111111431'；[，在第1染色体短臂上定位到一个控制 粒数的QTL-Gnl。进一步利用NIL-Gnl的杂合植株(Gnl/gnl)产生的96个F2单株，将Gnl分 解为两个位点:Gnla和Gn化，运两个位点的效应相当，Gnla定位于R3192和C12072S之间不到 2cM的区间，Gn化位于Gnla的上游。
[0003] 位于第1染色体的Gnla基因是控制水稻每穗粒数的主效基因，可W解释釉梗品种 化ba化ki、Koshihika;ri间44%的表型变异，来自釉稻品种化ba化ki的等位基因可W增加水 稻的每穗粒数，从而可W增加水稻的单株产量。
[0004] Matsuoka的研究掲示出Gnla基因在第一外显子处出现6bp的deletion(缺失），导 致水稻产量的提高，故被育种家发现用来育种。此突变体(第一外显子6bp的缺失)为自然突 变体，是随机发生的。近年来，基因组编辑技术蓬勃发展，使用基因组编辑技术CRISPR/Cas9 体系对野生型的Gnla进行人工突变，能够获得不同于自然界突变体的新型高产突变体。
【发明内容】
[0005] 利用基因组定点修饰技术CRISPR/Cas9体系，本发明公开了一种水稻穗粒数Gnla 基因人工定点突变体及其应用。本发明通过对Gnla基因的第4显子进行人工突变，影响第4 显子的正常表达，导致基因功能丧失或弱化从而进一步提高水稻的产量。
[0006] 本发明的技术方案如下：一种水稻穗粒数Gnla基因人工定点突变体，所述水稻穗 粒数Gnla基因人工定点突变体采用CRISPR/Cas9基因祀向修饰技术对Gnla基因的第4外显 子修饰，使得第4外显子的碱基发生替换、缺失和/或插入(Ξ种突变方式可随机组合)而得 到;CRISPR/化s9修饰时修饰祀点长度为20bp，位于第4外显子中第164位碱基~第183位碱 基，修饰祀点序列为AAGCAGTACCTGCCTTACTA。
[0007] 所述CRISPR/Cas9基因祀向修饰技术在修饰祀点第180位与181位碱基之间内插入 单个碱基A，得到Gnla基因突变体Gnla-Gl，插入碱基后的第4外显子的碱基序列如SEQ ID NO. 1，产量提高3 %左右。
[000引进一步地，所述CRISPR/Cas9基因祀向修饰技术在修饰祀点第179位造成碱基T缺 失，得到Gnla基因突变体Gnla-G2,缺失单个碱基后的第4外显子碱基序列如SEQ ID NO.2， 该突变体能将水稻产量提高10% W上。
[0009] 所述CRISPR/Cas9基因祀向修饰技术在修饰祀点位于第180位与181位碱基之间内 插入单个碱基C，得到Gnla基因突变体Gnla-G3,插入碱基后的第4外显子的碱基序列如SEQ ID NO. 3,该突变体能将水稻产量提高20% W上。
[0010] 所述CRISPR/Cas9基因祀向修饰技术在修饰祀点第179~182位造成碱基TACT缺 失，得到Gnla基因突变体Gnla-G4,缺失4个碱基后的第4外显子的碱基序列如SEQ ID NO.4， 该突变体能将水稻产量提高20% W上。
[0011] 本发明还提供所述水稻穗粒数Gnla基因人工定点突变体在杂交水稻育种和基因 组编辑水稻育种中的应用。
[0012] 本发明机理如下:本发明通过针对水稻Gnla基因，本发明使用CRISPR/化s9技术在 Gnla基因的第4外显子设计祀点进行人工突变，从而人工产生不同的突变类型，然后查看运 些不同类型的突变对水稻产量的影响，继而筛选出表现优异的突变类型，在第4外显子上设 计祀点不易脱祀，能够得到较多的突变类型。
[0013] 与现有技术相比，本发明具有W下有益效果:本发明采用CRISPR/Cas9对Gnla基因 的第4显子进行人工突变，并筛选出能够显著提高水稻产量的突变体。本发明提供的Gnla基 因基因人工定点突变体能够将水稻产量提高到20 % W上。
【附图说明】
[0014] 图1为Gnla基因突变体Gnla-Gl第四外显子碱基序列图；
[001引图2为Gnla基因突变体Gnla-G2第四外显子碱基序列图；
[0016] 图3为Gnla基因突变体Gnla-G3第四外显子碱基序列图；
[0017] 图4为Gnla基因突变体Gnla-G4第四外显子碱基序列图；
[001引图5为Gnla基因突变体Gnla-G5第四外显子碱基序列图；
[0019] 图6为Gnla基因突变体Gnla-G6第四外显子碱基序列图；
[0020] 图7为野生型水稻穗粒数Gnla基因第四外显子碱基序列图；
[0021] 注：图中黑色加粗区域为祀点序列，插入的碱基采用斜体表示，缺失的碱基采用 表示。
【具体实施方式】
[0022] 下面结合具体实施例对本发明的技术方案做进一步详细说明。
[0023] 实施例1
[0024] 水稻穗粒数Gnla基因的碱基序列如SEQ ID NO.7所示。
[0025] Gnla基因的第4外显子碱基序列(野生型）如SEQ ID NO.8所示，见图7
[00%] 本实施例CRISPR/化s9修饰时修饰祀点长度为20bp，位于第4外显子中164位碱基 ~183位碱基，修饰祀点序列为AAGCAGTACCTGCCTTACTA。本实施例将祀点序列进行合成：
[0027] 01ig〇15'-GGCAAAGCAGTACCTGCCTTACTA-3'，
[0028] 01〇g〇2:5 '-AAACTAGTAAGGCAGGTACTGCTT-3 '。
[0029] 本实施例使用含有cas9表达盒(35S启动子启动）和guid RNA表达盒(水稻0sU3启 动子)的双元载体化ambial300为骨架载体进行载体构建，将祀点序列插入骨架载体中，具 体做法为:将Oligol与01ig〇2进行退火憐酸化，使用限制性内切酶Aarl对骨架载体进行酶 切，然后使用T4连接酶将退火憐酸化后的祀点序列连入骨架载体0sU3启动子与sgRNA- scaffold序列之间，完成载体构建。
[0030] 载体构建后，将载体转入农杆菌EHA105，W水稻中的梗稻品种日本晴作为受体进 行农杆菌转化。在经过筛选，分化，生根过程后获得TO代转基因植株。采集TO代植株叶片提 取DNA，在Gnla基因第4外显子的祀点外围设计检测引物进行PCR检测，检测引物为：
[0031] Gnla-test-f:ACATGAAAAACAATGTCCGTT,
[0032] Gnla-test-r:CGTATGCACAGTACACCCAT〇
[0033] 将PCR产物进行SANG邸测序，确定发生突变的TO代植株。
[0034] 将在TO代检测到有突变现象的植株进行收种，进行T1代的种植，采集T1代植株叶 片提取DNA，使用如上的检测引物进行检测，确定Gnla基因突变类型为纯合突变或杂合突 变；同时设计潮霉素(全写）检测引物，引物序列为:HYG-f: CTATTTCTTTGCCCTCGGAC，肌G-r: CCTGACCTATTGCATCTCCC，检测潮霉素片段的存在，W此确定外源载体T-DNA片段是否存在。 筛选出6种Gnla突变类型为纯合突变同时HYG检测为阴性的植株进行收种。
[0035] 将T1代筛选出的植株进行收种，进行T2代的种植，每种突变类型种植49株。理论上 T2代为6种突变类型的纯合突变体。为了验证运一点，随机筛选部分植株进行了基因型检 测，证明T2代植株确实为6种突变类型的纯合突变体。为了确定6种突变类型对产量的影响， 然后在T2代的成熟期，对每种基因型的结实率、穗粒数、有效穗、千粒重和单株产量等产量 指标进行了统计。
[0036] 6种Gnla基因突变体如下：
[0037] Gnla基因突变体Gnla-Gl:在修饰祀点第180位与181位碱基之间内插入单个碱基 A，祀点序列变为AAGCAGTACCTGCCTTAACTA，插入碱基后的第4外显子的碱基序列如SEQ ID ^.1，见图1。
[003引G η 1 a基因突变体G η 1 a - G 2 :在修饰祀点第1 7 9位碱基T缺失，祀点序列变为 八八6〔46了40：了60：1'-4口^，缺失单个碱基后的第4外显子碱基序列如沈9 10^.2，见图2。
[0039] Gnla基因突变体Gnla-G3:在修饰祀点位于第180位与181位碱基之间内插入单个 碱基C，祀点序列变为AAGCAGTACCTGCCTTA唯TA，插入碱基后的第4外显子的碱基序列如SEQ ID NO.3,见图3。
[0040] Gnla基因突变体Gnla-G4:在修饰祀点第179~182位碱基TACT造成缺失，祀点序列 变为AAGCAGTACCTGCCT--A，缺失4个碱基后的第4外显子的碱基序列如SEQ ID NO.4,见图 4。
[0041 ] Gn 1 a基因突变体Gn 1 a-G5 :在修饰祀点第1 80位碱基A缺失，祀点序列变为 AAGCAGTACCTGCCTT-CTA，缺失4个碱基后的第4外显子的碱基序列如SEQ ID NO. 5，见图5。
[0042] Gnla基因突变体Gnla-G6:在修饰祀点第164位~184位碱基缺失，缺失的碱基为 八八6〔46了4〇：了6〇：7^(：了4(：，缺失4个碱基后的第4外显子的碱基序列如569 10^.6，见图6。
[0043] 6种Gnla基因突变体对单株产量的影响，如表1所示。
[0044] 表1.Gnla不同突变体对产量的影响
[0045]
[0046] 注："ns"表示在0.01及0.05水平差异均不显著/'*、**"分别表示在0.05、0.01差异 达显著水平;G1-G6为6中突变体，wide为野生型对照。
[0047] 由表1可知，Gnla-G5和Gnla-G6没有提高水稻产量，甚至导致产量降低。Gnla-G3和 Gnla-G4的增产效果最显著，达到了 20%W上。
【主权项】
1. 一种水稻穗粒数Gn la基因人工定点突变体，其特征在于，所述水稻穗粒数Gn la基因 人工定点突变体采用CRISPR/Cas9基因靶向修饰技术对Gnla基因的第4外显子修饰，使得第 4外显子的碱基发生替换、缺失和/或插入而得到；CRISPR/Cas9修饰时修饰靶点长度为 20bp，位于第4外显子中第164位~第183位碱基，修饰靶点序列为AAGCAGTACCTGCCTTACTA。2. 如权利要求1所述的水稻穗粒数Gnla基因人工定点突变体，其特征在于，所述 CRISPR/Cas9基因靶向修饰技术在修饰靶点第180位与181位碱基之间内插入单个碱基A，得 到Gnla基因突变体Gnla-Gl，插入碱基后的第4外显子的碱基序列如SEQ ID N0.1。3. 如权利要求1所述的水稻穗粒数Gnla基因人工定点突变体，其特征在于，所述 CRISPR/Cas9基因修饰技术在修饰靶点造成179位碱基T缺失，得到Gnla基因突变体Gnla-G2,缺失碱基后的第4外显子碱基序列如SEQ ID NO.2。4. 如权利要求1所述的水稻穗粒数Gnla基因人工定点突变体，其特征在于，所述 CRISPR/Cas9基因靶向修饰技术在修饰靶点位于第180位与181位碱基之间内插入单个碱基 C，得到Gnla基因突变体Gnla-G3,插入碱基后的第4外显子的碱基序列如SEQ ID NO.3。5. 如权利要求1所述的水稻穗粒数Gnla基因人工定点突变体，其特征在于，所述 CRISPR/Cas9基因靶向修饰技术在修饰靶点第179~182位造成碱基TACT缺失，得到Gnla基 因突变体Gnla-G4,缺失4个碱基后的第4外显子的碱基序列如SEQ ID N0.4。6. -种如权利要求1~5任一所述的水稻穗粒数Gnla基因人工定点突变体在杂交水稻 育种和基因组编辑水稻育种中的应用。
【文档编号】C12N15/29GK106011150SQ201610615319
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年8月1日
【发明人】张业胜, 张如, 黄光福, 胡凤益
【申请人】云南纳博生物科技有限公司, 云南大学