一种微生物法转化雄甾烯二酮生产睾酮的方法
【专利摘要】一种重组Yarrowia lipolytica高效生物转化雄甾烯二酮生产睾酮的方法，属于基因工程领域。该发明分别克隆了来源于人的17β?羟基类固醇脱氢酶和来源于酿酒酵母的葡萄糖脱氢酶，并将其在Y.lipolytica Polh中过量共表达，为国内外首次通过构建NADPH辅酶循环系统在解脂耶氏酵母中高效转化雄甾烯二酮生产睾酮。对构建的基因工程菌株进行酶活力测定及胞内辅酶水平研究表明重组菌能够持续有效地转化雄甾烯二酮生产睾酮。在转化温度为37℃，转化pH为7.5，底物助溶剂为甲基化?β?环糊精，生物量为200g/L，底物浓度为5g/L。经过3次补料全细胞转化后，15g/L雄甾烯二酮转化为14.3g/L睾酮，为目前报道微生物转化生产睾酮的最高水平，为微生物工业化生产睾酮提供了基础。
【专利说明】
-种微生物法转化雄酱稀二酬生产睾酬的方法
技术领域
[0001] -种生物转化雄酱締二酬生产睾酬的方法，属于基因工程和酶工程领域。
【背景技术】
[0002] 酱体药物可通过全合成或对天然酱体化合物的降解和其官能团的转化获得，酱体 药物具有很强的抗感染、刚过敏、抗病毒和抗休克等药理作用。随着时代的不断发展，酱体 药物已经成为仅次于抗生素的第二大类药物，2000年酱体药物在全球药物市场的销售额已 突破200亿美元，约占世界医药总销售额的6%。
[0003] 酱体激素类药物分类:肾上腺皮质激素，包括氨化可的松，强的松等。可治疗阿狄 森氏症，抗炎，抗过敏，抗休克的等;蛋白同化激素，其主要生理功能是抑制蛋白异化和促进 蛋白合成，主要用于治疗蛋白质增加和合成不足引起的疾病;性激素，包括雌性激素、雄性 激素和孕激素。
[0004] 早期合成酱体药物的原料大多从动物组织液中直接提取，由于运些原料的含量 低、来源少、合成路线复杂、回收率低、代价高昂，不能满足生产的需要。馨葫皂素的发现和 应用，为酱体药物的工业化生产提供了丰富而又廉价的原料，但是生产过程需要消耗大量 的馨葫皂素，使皂素价格不断上升，增加了生产成本，且生产过程严重污染环境。
[0005] 睾酬是由睾丸间质细胞产生的雄性激素，睾酬主要有W下方面作用：①维持生精 作用，睾酬自间质细胞分泌后，可经支持细胞进入曲细精管，睾酬可直接或先转变为活性更 强的双氨睾酬，与生精细胞的雄激素受体结合，促进精子的生成。②刺激生殖器官的生长发 育，促进男性第二性征出现并维持其正常状态;③维持正常的性欲;④促进蛋白质合成，特 别是肌肉和生殖器官的蛋白质合成，同时还能促进骨骼生长与巧憐沉积和红细胞生成等。
[0006] 170-径基类固醇脱氨酶（170-hyh〇wste;roid dehy化ogenase，170-HSD)为性激 素合成过程中最后步骤的催化酶。它催化性激C17位上的酬基和醇基之间的还原和氧化反 应，使低生物活性的雌酬、雄締二酬与高生物活性的雌二醇、睾酬之间相互转化。来源于人 体睾丸的17i3-HSD3,能够专一性的催化雄酱締二酬(AD)合成睾酬(TS)，它作为一种检测用 酶，应用于医疗检测领域。同时，在食品开发、医疗保健、临床监测、生物农药等方面具有广 泛应用价值。对17i3-HSD的深入研究对整个酱体药物行业的发展意义深远。生产更高附加值 的睾酬最直接有效的方法就是W雄酱締二酬为底物，通过微生物一步转化。
[0007] 本发明通过质粒PINA1292和pYLSC，实现了来源于人的及酿酒酵母的17f3-hsd3和 g化基因在化；rrowia lipol}ftica Polh中的可溶性过量表达，酶活分别达到7.35U/mg和 4.23U/mg，化发酵罐流加底物全细胞转化AD，12化将15g/L AD转化产生14.3g/L TS。来源于 人的17i3-HSD3在解脂耶氏酵母系统中表达，NADPH辅酶循环再生体系W及全细胞转化AD均 为首次报道，且重组菌表达的酶活及AD的转化率均较高。解脂耶氏酵母作为安全稳定的工 业生产菌株，培养条件简单，发酵周期短，成为微生物酱醇发酵工业潜在生产菌株。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的在于提供:通过基因工程手段来获得具有全细胞转化生产TS能力的 微生物的方法。对构建的重组菌株进行酶活力及发酵性能进行研究发现17i3-HSD3和GDH酶 活力均有较大提高，并且得到了较高的转化率。为微生物发酵生产TS的工业化提供有益的 指导。
[0009] 本发明的技术方案:是W基因工程为手段构建一株全细胞转化胆固醇生成TS的重 组解脂耶氏酵母菌株，WHPLC为方法检测发酵液中产物的生成，筛选阳性重组子，通过酶活 力和发酵性能的检测来确定其目标酶的活力及底物转化率。本发明成功构建了一株WAD为 底物全细胞转化为方法的高产TS的解脂耶氏酵母工程菌株，其17i3-HSD3和GDH酶活力和底 物转化率较出发菌株有较大提高。
[0010] 主要试剂:AD和TS均购自美国SIGMA公司
[0011] 重组菌株构建方法：
[0012] (1) 17β-服D3和GDH基因全序列的克隆
[OOU] 根据GENBANK网站公布的人的17β-服D3的SD序列(GI:21706851)和酿酒酵母的G畑 基因全序列，首先经过密码子优化后，分别WpINA1292和机LSC质粒上的酶切位点设计17β- hsd3和g化基因引物。W基因全合成的DM为模板，通过PCR扩增出17f3-hsd3和ZWF1全序列。
[0014] PCR反应体系aOXExTaq Buffer SliUclNTP化L，模板DNA化L，上下游引物各0.5 liUEsTaq 酶化L，d 地2〇 补齐至总体积 50 化。PCR 反应条件：94°C5min，94°C30s，65°C45s，72°C 2min，循环 35 次，72°C10min，12°C10min。
[0015] (2)重组表达载体PINA1292-170-hsd3和pYLSC-g化的构建
[0016] 参照上海捷瑞公司胶回收试剂盒说明书回收PCR产物，胶回收产物按一定比例与 PMD18-T vector过夜连接，转化E.coli JM109感受态细胞，使用氨节青霉素抗性平板筛选 重组菌，重组质粒经BamH I/Nde I酶切分别释放出大小约为2.化b和1.Okb及2.化b和1.化b 的基因条带，表明重组质粒构建成功，重组质粒命名为pMD18-T-17f3-hsd3和pMD18-T-g化。
[0017] 提取保存于E.coli JM109中的质粒pINA1292、p化SC、pMD18-T-170-hsd3和PMD18- T-g化，质粒PINA1292和pMD18-T-170-hsd3及pYLSC和pMD18-T-g化分别经BamH I/Not 巧口 BstBI/趾〇1双酶切，胶回收纯化，T4DNA连接酶过夜连接两片段，过夜后将连接物热击转化 E.coli JM109感受态细胞，使用卡那霉素抗性平板筛选阳性转化子。提取转化子质粒，重组 质粒分别经BamH I/Not I和BstBI/趾〇1双酶切后分别释放出大小约为9.0kb和l.Okb及 3.6化和1.化b的基因片段，证明重组质粒构建成功，重组质粒命名为pINA1292-17f3-hsd3和 P化SC-g化。
[001引 （3)重组质粒口1難1292-170-}13(13和口￥1^50邑化电转化法转化菌株￥曰''0讯1曰 lipolytica Polh
[0019] 将经验证构建成功的重组质粒pINA1292-17f3-hsd3和p化SC-g化分别先后用电转 化法转化至模式菌株Y. lipolytica化化中表达。
[0020] (4)重组菌株Y. lipolytica化化阳性转化子的筛选；
[0021 ]挑取在具有YH)和潮霉素压力平板上长出的菌落，摇瓶培养，提取染色体进行PCR 验证。
[0022] (5)重组Y. lipolytica化化培养条件、酶活测定及HPLC分析
[0023] 培养条件：LB培养基：胆固醇Ig/L，葡萄糖lOg/L，蛋白腺lOg/1，酵母膏5g/L， NaCl lOg/L(固体培养基加入2 %琼脂粉）
[0024] 平板MD培养基(g/L):酵母基础氮源(YNB) 13.4，生物素4 X ΙΟΛ葡萄糖20，琼脂15;
[0025] YTO培养基(g/L):蛋白腺20，葡萄糖20，酵母粉10，用于筛选G418抗性时在YTO固体 培养基加入所需浓度的G418即得YPD/G418平板，用于筛选潮霉素抗性时在YTO固体培养基 加入所需浓度的潮霉素即得YPD/Hy浊平板；
[00%] Buffered Minimal Glycerol-complex Medium(BMGY)培养基（g/L) :YNB 13.4,甘 油10，生物素4X ΙΟΛ定容采用0.1mol/L憐酸钟缓冲液(pH 6.0);
[0027] Buffered Minimal Methanol Medium(BMMY)培养基（g/L):甲醇20,生物素4ΧΙΟ -4，ΥΝΒ13.4，定容采用0.1mol/L憐酸钟缓冲液(pH 6.0);
[002引酶活测定方法:采用HPLC方法测定。具体方法如下:取培养24h的菌液50mL，4°C，8， 00化/min离屯、5min收集菌体，用50mL pH 7.0的化is-肥1缓冲液洗涂两次，重悬于5ml的该 缓冲液中。冰浴中40%功率超声破碎，工作2s间歇5s，工作时间lOmin。10，OOOr/min离屯、 30min获得上清液，上清液中即为目的蛋白。酶活测定方法如下：酶活测定体系ImL包括 0.5mM NADPH，200μΜ AD(溶于甲醇），再加入适量酶液。酶活力单位定义：37 °C溫度下，Imin 转化?μL?ο? AD生成TS的酶量定义为1个酶活单位化）。葡萄糖-6-憐酸脱氨酶活力测定方法： ImL反应体系包括50mM憐酸钢缓冲液(pH 6.5)，lOmM葡萄糖-6-憐酸和ΙμΜ NADP+。根据在 340nm下NADPH吸光值的变化测定活力，酶活单位定义:每分钟产生ΙμL?ο? NADPH所需要的酶 量。葡萄糖脱氨酶活力测定方法：ImL反应体系包括50mM憐酸钢缓冲液(pH 6.5)，lOmM葡萄 糖和ΙμΜ NADP+。根据在340nm下NADPH吸光值的变化测定活力，酶活单位定义:每分钟产生1 皿01 NADPH所需要的酶量。
[0029] HPLC分析:AD和TS在240nm紫外波长下均有特征吸收峰，所W采用HPLC法测定产物 浓度。色谱条件:色谱柱:DimosoilCi8(5μ1，250mmX 4.6mm)，流动相：乙腊-水(V/V = 85:15)， 检测器:UV Detector，检测波长:210nm，柱溫:30°C，进样量：lOyL，流速：1.0ml/min。
[0030] 本发明的有益效果:通过基因工程手段扩增全合成的17i3-HSD3和GDH基因，借助本 实验室已有的成熟的解脂耶氏酵母表达体系，实现了 17i3-HSD3和G6PDH基因在模式菌株 Y.lipolytica Polh中的过量表达。将该菌株W5%接种量接种于lOOmL BMGY培养基中，培 养2地，然后W5%接种量接种于装有化BMMY培养基的化发酵罐中，持续添加甲醇进行诱导 4天。离屯、回收菌体，洗涂两次，用一定量的50mM的化iS-HC1 pH 7.5缓冲液复溶，加入底物 AD进行转化，转化条件为:转化溫度为37 °C，转化抑为7.5，底物助溶剂为甲基化-β-环糊精 (摩尔比例为1:1)，生物量为200g/L，底物浓度为5g/L。经过3次补料全细胞转化后，15g/L雄 酱締二酬转化为14.3g/L睾酬，为国内外首次通过构建NADPH辅酶循环再生系统在毕赤酵母 中利用雄酱締二酬转化生产睾酬，最终实现提高转化速率、高效生产睾酬的目的。
[0031] 将底物AD-步转化成具有更高附加价值的TS，其具有重要的生理及医学作用，同 时是重要的医药中间体;用微生物法生产TS，其较之化学生产法具有反应条件溫和、原料利 用率高、产品纯度高及工艺简单、易于控制等优点，同时有利于环境保护，易于推广应用。
【附图说明】
[0032] 无
【具体实施方式】
[0033] 实施例1:重组Y.lipolytica化化菌株的构建
[0034] W实验室全合成的基因为模板，利用PCR手段获得该酶的基因，连接克隆载体，实 现基因的大量扩增。将大量扩增的17iHisd3和g化基因片段，纯化后分别连接到PINA1292和 P化SC载体上，验证成功后，转化模式菌株Y. lipolytica Polh。在抗性平板上筛选阳性转化 子，接种摇瓶发酵，用HPLC检测发酵液中产物TS。检测到有产物TS，说明构建成功了具有转 化AD为TS的重组菌株。本发明最终得到具有高效转化AD为TS的Y. lipolytica化化菌株。
[0035] 实施例2:重组菌株的酶活力测定
[0036] 酶活测定方法:采用HPLC方法测定。具体方法如下:取培养24h的菌液50mL，4°C，8， 00化/min离屯、5min收集菌体，用50mL pH 7.0的化is-肥1缓冲液洗涂两次，重悬于5ml的该 缓冲液中。冰浴中40%功率超声破碎，工作2s间歇5s，工作时间lOmin。10，OOOr/min离屯、 30min获得上清液，上清液中即为目的蛋白。酶活测定方法如下：酶活测定体系ImL包括 0.5mM NADPH，200μΜ AD(溶于甲醇），再加入适量酶液。酶活力单位定义：37 °C溫度下，Imin 转化Ιμηιο? AD生成TS的酶量定义为1个酶活单位化）。葡萄糖脱氨酶活力测定方法：ImL反应 体系包括50mM憐酸钢缓冲液(pH 6.5)，10mM葡萄糖和ΙμΜ NADP+。根据在340nm下NADPH吸光 值的变化测定活力，酶活单位定义:每分钟产生?μL?ο? NADPH所需要的酶量。酶活分别达到 7.3抓/111旨和4.231]/111邑。
[0037] 实施例3:重组菌株全细胞转化性能检测
[0〇3引将该菌株W5%接种量接种于lOOmL BMGY培养基中，培养2地，然后W5%接种量接 种于装有化BMMY培养基的化发酵罐中，持续添加甲醇进行诱导4天。离屯、回收菌体，洗涂两 次，用一定量的50mM的化is-肥1 pH 7.5缓冲液复溶，加入底物AD进行转化，转化条件为:转 化溫度为37 °C，转化pH为7.5，底物助溶剂为甲基化-β-环糊精(摩尔比例为1:1 )，生物量为 200g/L，底物浓度为5g/L。经过3次补料全细胞转化后，15g/L雄酱締二酬转化为14.3g/L睾 酬，为国内外首次通过构建NADPH辅酶循环再生系统在毕赤酵母中利用雄酱締二酬转化生 产睾酬，最终实现提高转化速率、高效生产睾酬的目的。
【主权项】
1. 一种经过密码子优化的17β-羟基类固醇脱氢酶基因，其特征在于，其核苷酸序列如 SEQ ID Ν0.1 所示。2. -种重组质粒pINA1292-170-hsd3，其特征在于，将权利要求1所述的17β-羟基类固 醇脱氢酶基因与载体ΡΙΝΑ1292连接获得。3. -种转化体系的构建，其特征在于，将能够催化NADP+合成NADPH的酶如葡萄糖脱氢酶 GDH与权利要求2所述的重组质粒连接获得新的重组质粒pINA1292-170-hsd3-GDH，并将重 组质粒pINA1292-170-hsd3_GDH在Yarrowia lipolytica Polh中共表达获得。4. 权利要求3所述转化体系的应用，其特征在于，应用于转化雄留烯二酮合成睾酮。5. 权利要求3所述的能够催化NADP+合成NADPH的酶，其特征在于，优选，但不限于选用葡 萄糖脱氢酶。
【文档编号】C12N15/53GK106011158SQ201610575007
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年7月20日
【发明人】饶志明, 邵明龙, 张显, 杨套伟, 徐美娟
【申请人】江南大学