区分水椰八角铁甲性别的微卫星标记的特异性引物及方法
【专利摘要】本发明公开了一种区分水椰八角铁甲性别的微卫星标记的特异性引物及方法，采用微卫星位点序列设计特异性引物，以水椰八角铁甲DNA为模板，采用所述特异性引物进行PCR反应，然后基于毛细管电泳对PCR产物进行STR分型分析，根据电泳结果，判断水椰八角铁甲的性别。本发明方法对DNA质量、浓度要求均很低，操作简单，适用于卵、幼虫、蛹、成虫，且对于初龄幼虫、卵等仅能提取出低浓度DNA的样本，采用本发明方法也能得到较好的结果，该方法准确性高、适用范围广。
【专利说明】
区分水椰八角铁甲性别的微卫星标记的特异性引物及方法
技术领域
[0001]本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种区分水椰八角铁甲性别的微卫星标记的特异性引物及方法。
【背景技术】
[0002]水椰八角铁甲是严重危害我国南方棕榈科植物的入侵害虫。为准确判断该虫的定殖、扩张情况，检验检疫部门及相关研究人员需对发现的水椰八角铁甲(虫态、性别、数量等)进行准确判断。有效鉴定该虫的性别，对相关的预测、监测以及防治工作有重要意义。
[0003]在现有的技术中，主要是利用水椰八角铁甲雌雄成虫部分形态特征的差异来鉴定雌雄，此类方法局限性较大:(I)要求操作者有较高的分类学经验；(2)仅适用于成虫，对于幼虫、蛹等虫态，需等样本自然生长至成虫，耗时较长；(3)需要待测成虫样本形态完整。上述方法在实际操作中的局限性很大，因此，急需一种适用性广、能准确检测水椰八角铁甲各虫态性别的方法。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种区分水椰八角铁甲性别的微卫星标记的特异性引物及方法，该方法适用性广，能够准确、快速的检测测水椰八角铁甲各虫态的性别。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案:
区分水椰八角铁甲性别的微卫星标记的特异性引物，是采用微卫星位点序列设计而成，所述特异性引物如下:
上游引物:57 -AACTTAAACCAGAATCGGCTCTC -37 ；
下游引物:5' -ATGATGTCGGACGATTCTCTTC-37。
[0005]本发明还提供了采用所述微卫星标记的特异性引物区分水椰八角铁甲性别的方法，包括以下步骤
1)提取水椰八角铁甲DNA;
2)合成带有荧光基团(FAM/ HEX / R0X)的微卫星特异性引物
3)以水椰八角铁甲DNA为模板，采用所述微卫星标记的特异性引物进行PCR反应，所述PCR反应体系为:
2XTaq PCR MasterMix 12.5 uL；ddH209.5 uL；
上游引物I yL;
下游引物I yL;
DNA模板I yL ；
所述上游引物终浓度为10 pmol/yL；
所述下游引物终浓度为10 pmol/yL； 4)基于毛细管电泳对上述步骤的PCR产物进行STR分型分析，根据电泳结果，判断水椰八角铁甲的性别:
若水椰八角铁甲DNA扩增出长度为141 bp的条带，则判断其为水椰八角铁甲雌虫；
若水椰八角铁甲DNA扩增出长度分别为138bp、141 bp的两种条带，则判断其为水椰八角铁甲雄虫。
[0006]进一步，所述步骤3)的PCR反应体系中，PCR反应程序为:94 °C预变性3 min；94°C变性30 s，55°C退火40 s,72 °C延伸40 s，35个循环;最后72 °C延伸5 min，4 °C保存。
[0007]本发明采用以上技术方案，基于分子生物学技术，利用雌雄水椰八角铁甲在特定微卫星DNA位点存在的序列差异，来进行性别快速鉴定。本发明的工作原理为:水椰八角铁甲的性别与特定微卫星位点的基因型相关，且雌雄虫该位点的基因型差异较大，水椰八角铁甲为二倍体生物，雌虫DNA该位点的两个等位基因基因序列一致，而雄虫该位点的两个等位基因基因序列不一致，且二者序列相差3 bp。根据该位点序列设计合适引物，水椰八角铁甲雌虫DNA样本能扩增出长度为141 bp的条带，而水椰八角铁甲雄虫DNA样本能扩增出长度分别为138、141 bp的两种条带，可根据以上特征鉴定水椰八角铁甲的性别。
[0008]与现有技术相比，本发明的有益效果在于:利用水椰八角铁甲雌雄虫特定微卫星位点的长度差异，利用相同引物，却能在二者中扩增出不同长度的片段，可直接根据毛细管电泳的结果来准确区分二者。本发明方法对DNA质量、浓度要求均很低，操作简单，适用于卵、幼虫、蛹、成虫，且对于初龄幼虫、卵等仅能提取出低浓度DNA的样本，采用本发明方法也能得到较好的结果，其准确性高、适用范围广。
【附图说明】
[0009]以下结合附图和【具体实施方式】对本发明作进一步详细的说明:
图1为水椰八角铁甲DNA样本的PCR产物的STR分型图；
其中，a代表水椰八角铁甲雌虫，b代表水椰八角铁甲雄虫。
【具体实施方式】
[0010]下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0011]下述实施例中所用的试验材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
[0012]一种区分水椰八角铁甲性别的方法，包括以下步骤:
I)提取水椰八角铁甲DNA:
获得水椰八角铁甲单个样本，成虫、蛹、个体较大的幼虫可采用常规昆虫提取试剂盒或CTAB法提取DNA(具体方法参考相关说明书，本方法对DNA浓度、质量均无特殊要求)；个体较小幼虫、卵可采用DNA微量提取试剂盒(上海生工生物工程有限公司、天根生物科技有限公司等生物公司均有成熟的解决方案)提取，-20°C保存。
[0013]2)在相关引物合成公司(深圳华大基因科技服务有限公司、上海生工生物工程有限公司等)合成带有荧光基团(FAM / HEX / R0X)的微卫星特异性引物，所述特异性引物如下:
上游引物:57 -AACTTAAACCAGAATCGGCTCTC -37 ；
下游引物:5' -ATGATGTCGGACGATTCTCTTC-37。
[0014]3)以水椰八角铁甲样本DNA为模板，采用上述特异性引物进行PCR反应，所述PCR反应体系为:
2XTaq PCR MasterMix (TIANGEN，产品编号KT201)12.5 yL；
CldH2O 9.5 yL；
上游引物(10 pmol/μυ? yL；
下游引物(10 pmol/μυ? yL；
DNA模板 I yL;
PCR反应程序为:94 °C预变性3 min;94°C变性30 s，55°C退火40 s，72 °C延伸40s，35个循环;最后72 °C延伸5 min，4 °C避光保存。
[0015]4)将PCR产物用锡箔纸包好(防止见光猝灭)，送至测序公司(深圳华大基因科技服务有限公司、上海生工生物工程有限公司等)进行STR分型分析(毛细管长度电泳)，一般使用的机型为ABI测序仪3730，接到样品后3-12小时即可得到结果，并使用配套软件进行长度分析、作图。
[0016]5)根据电泳结果，判断水椰八角铁甲的性别:
本实施例STR分型图如图1所示，扩增出长度为141 bp的条带的判定为水椰八角铁甲雌虫(图1a);
扩增出长度分别为138bp、141 bp的两种条带的判定为水椰八角铁甲雄虫(图la)。
【主权项】
1.区分水椰八角铁甲性别的微卫星标记的特异性引物，其特征在于:采用微卫星位点序列设计特异性引物，所述特异性引物如下: 上游引物:57 -AACTTAAACCAGAATCGGCTCTC -37 ； 下游引物:5' -ATGATGTCGGACGATTCTCTTC-37。2.采用权利要求1所述的引物区分水椰八角铁甲性别的方法，其特征在于:其包括以下步骤 1)提取水椰八角铁甲DNA; 2)合成权利要求1所述的微卫星标记的特异性引物； 3)以水椰八角铁甲DNA为模板，采用权利要求1所述的微卫星标记的特异性引物进行PCR反应，所述PCR反应体系为: 2 XTaq PCR MasterMix 12.5 uL； CldH2O9.5 uL； 上游引物I yL; 下游引物I yL; DNA模板I yL ； 所述上游引物终浓度为10 pmol/yL； 所述下游引物终浓度为10 pmol/yL； 4)基于毛细管电泳对上述步骤的PCR产物进行STR分型分析，根据电泳结果，判断水椰八角铁甲的性别: 若水椰八角铁甲DNA扩增出长度为141 bp的条带，则判断其为水椰八角铁甲雌虫； 若水椰八角铁甲DNA扩增出长度分别为138bp、141 bp的两种条带，则判断其为水椰八角铁甲雄虫。3.根据权利要求2所述的区分水椰八角铁甲性别的方法，其特征在于:所述步骤3)的PCR反应体系中，PCR反应程序为:94 °C预变性3 min;94°C变性30 s，55°C退火40 S，72°C延伸40 s，35个循环;最后72 °C延伸5 min，4 °C保存。
【文档编号】C12Q1/68GK106011266SQ201610506663
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年6月30日
【发明人】侯有明, 陈俊, 陈智明, 张翔, 汤宝珍, 黄斌
【申请人】福建农林大学