利用鱼的PPARα基因监测CO₂酸化水体的方法

利用鱼的PPARα基因监测CO₂酸化水体的方法
【专利摘要】本发明公开了一种利用鱼的PPARα基因监测二氧化碳(CO2)酸化水体的方法，用鱼作为监测水体污染的生物样本，鱼的PPARα基因作为监测水中CO2酸化的敏感生物标记物；本发明的优点在于：本发明可以获知待测水域中CO2酸化水体的pH值大小，以及获知待测水域目前的危害程度；同时也能从生物的角度敏感地监测CO2酸化污染的危害性和危害程度，为水体生态环境监测、毒理诊断、调控和防治提供准确、快速的科学方法。
【专利说明】
利用鱼的PPARa基因监测C〇2酸化水体的方法
技术领域
[0001] 本发明设及监测C〇2酸化水体的技术领域。更具体地说，本发明设及一种利用鱼的 PPARa基因监测C〇2酸化水体的方法。
【背景技术】
[0002] 自工业革命W来，由于人类活动和工农业发展，大气中的C〇2水平W前所未有的速 度上升，导致海洋和其他水体吸收C〇2的量不断增加，水体pH值下降，导致水体酸化。
[0003] 0)2酸化如海水酸化，不同于一般意义上的酸化如盐酸化C1)酸化，0)2酸化对鱼类 的影响显著大于肥1酸化的影响。例如同是抑二6.2，0)2酸化对真觸(Pagrus major)的卵和 幼体产生的毒性(死亡率60-100% )远高于HCl酸化产生的毒性(死亡率1-4%)。由于C〇2分 子比r更易穿透生物膜，与水反应生成出c〇3,后者在碳酸酢酶的作用下，迅速分解成r和 肥化-;在相同的农度下(pH=6.16)，C〇2衍生出的分子种类化C〇3-、C〇32-)是HC1的150倍。肥1 酸化只是H+浓度升高;而C〇2进入生物体内后可W直接破坏体液的酸碱平衡，加之C〇2酸化还 会使机体新陈代谢率及蛋白合成下降，携氧能力下降，抑制机体正常生理活动，乃至死亡。 因此，由C〇2酸化升高导致的P啡華低对水生动物产生的影响比单一 H+浓度增加而产生的影响 更为严重。
[0004] 海水酸化是C〇2酸化，是全球环境变化的重大问题之一。海水酸化可直接和间接影 响鱼及其他水生生物的代谢、抗氧化、免疫防御、离子和酸碱平衡等，致其伤亡。海水酸化不 仅威胁某些物种，还可使整个海洋生态系统退化。海水酸化是亟待研究和积极应对的全球 性重大环境问题。
[0005] 目前有关海水酸化(0)2酸化水体）的研究刚起步，海水酸化对水生生物影响的研 究还少，对鱼类影响的研究更少，海水酸化的生物效应相对难W预测，并且尚无适宜的鱼类 基因检测C〇2酸化水体的程度，阻碍了海水酸化对水生生物影响的进一步研究。

【发明内容】

[0006] 本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供一种利用鱼的PPARa基因监测C〇2 酸化水体的方法，通过用对海水酸化非常敏感的海水青鎌(0巧zias melastigma)的PPARa 基因作为敏感生物标记物，测试并计算PPARa基因的相对表达量，能敏感的表达出水体中 0)2酸化的程度，方法简单，易操作，能快速灵敏的检测出水体C〇2酸化程度，更好的监测水体 酸化情况，有助于研究不同程度的海水酸化对鱼类PPARa基因指标的影响。
[0007] 为了实现根据本发明的运些目的和其它优点，提供了一种利用鱼的PPARa基因监 测C〇2酸化水体的方法；
[000引本发明提供的技术方案为：
[0009] 一种利用鱼的PPARa基因监测C〇2酸化水体的方法，用鱼作为监测水体污染的生物 样本，鱼的PPARa基因作为监测水中C〇2酸化的敏感生物标记物。
[0010]优选的是，建立鱼的PPARa基因的相对表达量与C〇2酸化水体的pH值关系的 标准曲线，获取与建立标准曲线同类同大小的待测水域的鱼，然后将计算得所述待测水域 的鱼的PPARa基因的相对表达量与标准曲线比对，获得c〇2酸化水体的pH值大小。
[0011] 优选的是，计算PPARa基因的相对表达量具体包括W下步骤：
[0012] 1)用鱼作为监测酸化水体的生物样本；
[001引2)利用RNA提取试剂，提取鱼样品总RNA，利用反转录试剂将RNA反转录合成首链 cDNA；
[0014] 3)实时巧光定量PCR检测，W首链cDNA为模板，分别根据所述PPARa基因的特异性 引物，所述18s-rRNA基因引物，在罗氏PCR仪上进行实时巧光定量PCR扩增反应，巧光定量 ?〔尺反应体系为：5￥服试剂12.5化、上游引物!^化1^、下游引物1?化1^、〇0魁化1^、灭菌蒸馈水 8 .扣L，反应体系总体积为25化；反应程序采用Ξ步法：95°C预变性30s ; 95°C，15s ; 60°C， 30s; 72°C，30s，40个循环，采集巧光信号数值Ct，Ct值是每个反应管内的巧光信号到达设定 的域值时所经历的循环数；
[0015] 4)获得PPARa基因巧光信号数值CtPPARa和内参基因巧光信号数值Ctl8s-rRNA后， 采取 法进行数据分析，Act = CtPPARa-Ctl8s-rRNA，
[0016] AACt=(aPPARa-Ctl8s-rRNA)测试组-(CtPPARa-Ctl8s-rRNA)空白组，PPARa 基 因的相对表达量=2 ，计算2 AAet得出ppARa基因的相对表达量。
[0017] 优选的是，实验选鱼为稚鱼，将稚鱼分成若干组，其中一组作为正常pH对照组，其 他组为待测水域组;分别将稚鱼放入正常P肪?照水体和待测水域水体中饲养;8周后随机抽 取鱼样品，检测并计算PPARa相对表达量如果待测水域组的值小于正常抑对照 组的值，那么待测水域的pH值小于正常对照组的pH值，则待测水域的水体受到c〇2酸 化。
[001引优选的是，PPARa基因的特异性引物为：
[0019] 上游引物如沈9 10備.1所示:口口41?曰斗：5'-〔46了64〇：了66(：1'(：1'1'1'1^61'-3'，
[0020] 下游引物如沈Q ID NO. 2所示:PPARa-R: 5 ' -CGCCTGAATGATGCTCTCC-3 ' ；
[0021] 鱼的内参基因为18s-rRNA基因，18s-rRNA基因的引物为：
[0022] 上游引物如沈Q ID NO. 3所示：18s-rRNA-F: 5' -TTGACCCAACACGGGAAACCT-3'，
[0023] 下游引物如沈Q ID NO. 4所示：18s-rRNA-R: 5' -CAAATCGCTCCACCAACTAAGAA-3'。
[0024] 优选的是，鱼的PPARa基因的相对表达量与C〇2酸化水体的pH值大小呈正相关。
[0025] 优选的是，所述鱼为海水青鎌或淡水青鎌。
[00%] 优选的是，所述稚鱼均为30天龄稚鱼。
[0027] 本发明至少包括W下有益效果：
[0028] 过氧化物酶体增殖剂激活受体（peroxisome proliferators-activated receptors，PPARs)是核激素受体家族中的配体激活受体，其中PPARa是一个重要的脂肪酸 代谢调节者，还调节许多对脂肪和脂蛋白代谢至关重要的基因表达。PPARa对环境因素和营 养素敏感。本发明所要解决的技术问题在于提供一种基于鱼的PPARa基因监测C〇2酸化水体 的方法。同时也可监测其他酸化水体。有利于预测酸化水体的生物效应，对保护酸化水体的 首要冲击者、水体生产力中的主要产物一鱼类和其他生物，发展可持续的渔业和生态系统 具有现实意义。并且本发明可W利用鱼的PPARa基因监测C〇2酸化水体的状况，通过鱼的 PPARa基因的相对表达量与C〇2酸化水体的抑值大小呈正相关，就可W快速准确监测到水体 受到C〇2酸化的程度和危害程度。
[0029] 本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本 发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
【具体实施方式】
[0030] 结合下面实施例对本发明做进一步的详细说明，W令本领域技术人员参照说明书 文字能够据W实施。
[0031] 实施例1
[0032] 1、鱼样本的准备
[0033] 用30天龄海水青鎌稚鱼为起始鱼，在C〇2酸化水体养殖8周后作为监测酸化水体的 生物样本。将稚鱼分成5组，分别在表1所述的水环境中饲养，其中抑8.1水体为正常抑对照 组，每组3个平行进行，饲养8周后，每个平行取3尾鱼样品测定，每组测定3x3 = 9个数据，将 每组9个数据数理统计后得到各组鱼的PPARa基因的相对表达量结果。
[0034] 表1 5组稚鱼饲养的C〇2酸化水体的pH值
[0035]
[0036] 构建C〇2充气系统持续泡控目标pH值的酸化海水，W目前近海表层海水的平均值 (P册.1)为对照组。通过向海水中充入高纯C〇2气体，用皿NTEX抑/0RP控制器监测并控制每 个养殖槽中海水pH值，W保持各组实验海水pH值的稳定。饲养的其他条件可W是:每天Ξ次 投喂200目饲料，总投喂量为鱼体重的5%。每天详细观察和记录稚鱼活动、摄食、崎形、死亡 等，8周后随机采集鱼样品，分别称鱼体湿重，可W直接用于PPARa基因相对表达量的测定， 或暂存于-80°C冰箱中用于PPARa基因相对表达量的测定。
[0037] 2、利用RNA提取试剂，提取鱼样品总RNA，利用反转录试剂将RNA反转录合成首链 cDNA；
[0038] (1)快速称取冷冻的鱼样品lOOmg左右，记录实际重量为M，然后放入提前预冷的研 鉢中倒入液氮，用研巧研磨称量好的鱼样品，直至研磨成粉末状，然后用不诱钢小药匙迅速 将样品粉末移入冰浴中的玻璃匀浆管底部。
[0039] (2)用移液枪往玻璃匀浆管中加入0.6mL RNAiso试剂，充分匀浆至匀浆液呈无颗 粒透明状后，将匀浆液转入1.5ml离屯、管中。然后再向匀浆管中加入0.2mL RNAiso试剂，洗 涂匀浆棒和匀浆管管壁各一次，之后将匀浆液转入之前的离屯、管中，重复上述操作一次，使 加入的RNAiso试剂总体积为ImL。盖好离屯、管并颠倒混匀数次后室溫静置5min。
[0040] (3)用1000化微量移液枪往上一步的1.5mL离屯、管中加入2(Κ)化氯仿，盖紧离屯、管 盖，混匀至溶液乳化后，再室溫静置5min。
[0041 ] (4)转移至高速冷冻离屯、机中12000g，4°C，离屯、15min。
[0042] (5)小屯、从离屯、机中取出离屯、管，用1000化微量移液器吸取50化L上清液至一个新 的1.5ml离屯、管中。
[0043] (6)然后往新的1.5mL离屯、管中加入50化L异丙醇，盖好离屯、管并充分颠倒混匀，室 溫静置lOmin。
[0044] (7)转移至高速冷冻离屯、机中12000g，4°C，离屯、lOmin。
[0045] (8)将1.5mL离屯、管中上清液倒掉，再12000g，4°C，离屯、Imin，用小枪头（100化)将 上清液吸除干净。
[0046] (9)往离屯、管中加入现配的预冷的75%乙醇1ml(无水乙醇3:1DEPC水），盖好离屯、 管并轻轻上下颠倒洗涂离屯、管管壁及RNA，再12000g，4°C，离屯、Imin后小屯、去除乙醇。
[0047] (10)在超净工作台中打开离屯、管盖，室溫干燥沉淀lOmin，加入50化DEPC处理水 溶解沉淀，静置3min，待RNA沉淀完全溶解后存于-20°C冰箱待用。
[004引 （11)使用!'hermo Scientific Nano化op 2000c测定总RNA的含量，获得测定浓度，
[0049] RNA含量的计算公式：
[0050] 样品RNA浓度(yg/mg)=测定浓度(ng/μL) X50X1000今M。
[0051 ] (12)用1 %琼脂糖凝胶电泳检测其纯度，若测定的0D260/0D280值在1.9~2.1之 间，且总RNA电泳条带清晰呈现为28S，18S和5SS条带，28S的条带亮度约为18S的两倍，说明 RNA纯度和浓度符合要求，可继续进行后续实验；
[0052] (13)利用反转录试剂将RNA反转录合成首链cDNA;
[0053] a)逆转录:用普通PCR仪将RNA反转录成首链cDNA，按照表2配制反转录反应液：
[0054] 表2反转录反应液组成
[0化5]
[0056] 反应液配制方法:配置前先根据反转录样品的数量计算出各反应液实际需要量， 统一加入无菌离屯、管中混合均匀，然后分装到各个反应管中，最后添加样品并小屯、点动离 屯、混匀，使反应更加充分并减少误差。配制过程需在冰浴且无菌体系中进行，
[0057]反转录反应条件：50°C，20min一95°C，5min一5°C，5min一 15°C，15min。
[005引 3、实时巧光定量PCR检测目的基因
[0059] (1)引物设计
[0060] 所述PPARa基因的特异性引物为：
[0061 ]上游引物为：PPARa-F: 5 ' -CAGTGACCTGGCTCTTTTCGT-3 '，（沈Q ID NO. 1)
[0062] 下游引物为:口口4尺曰-尺:5'-〔6〇：了644了64了6(：1'押〇：-3'；（569 10^.2)
[0063] 所述鱼的内参基因为18s-rRNA基因，所述18s-rRNA基因的引物为：
[0064] 上游引物为：183-诚酷斗：5'-1764〔〇：44〔4〔666444〇：1'-3'，（沈9 10備.3)
[00化]下游引物为：18s-rRNA-R: 5 ' -CAAATCGCTCCACCAACTAAGAA-3 ' ；（沈Q ID NO. 4)
[0066] (2)PCR检测目的基因
[0067] PCR扩增反应用普通PCR仪扩增cDNA，按表3配制PCR反应液：
[0068] 表3 PCR反应液组成
[0070] 根据反转录样品数量计算各PCR反应试剂用量，配制反应混合液，点动离屯、混匀， 然后分装到PCR反应结束后的PCR反应管中，再点动离屯、混匀。反应结束后，将PCR管保存于4 °(：冰箱保存，待用。
[0071] PCR扩增反应条件：95 °C，Imin一（94°C，30sec一60 °C，30sec一72 °C，Imin，40个循 环)一72°C，5min一 15°C，pause。
[0072] 用1%琼脂糖凝胶电泳检iiPCR产物，条件为100V，30min。若PCR反应产物的条带单 一，出现位置在100-20化P之间，可初步确定PCR产物为目的基因。
[0073] PCR产物纯化与浓缩，PCR产物的1%琼脂糖凝胶电泳检测符合实验要求后，取经纯 化浓缩后的PCR产物测序，测序结果经BLAST化ttp://WWW.ncbi .nlm.nih. gov)比对后，确定 PCR扩增产物是目的基因片段，方可进行后续的巧光定量实验。
[0074]本实验义用的是TaKaRa公司的:SYB.R@Premix Ex Taq?(perfect Real Time)试 剂盒，本试剂盒是在PCR扩增合成双链DM的过程中，巧光分子SYBR'K Green I与双链DM结 合能够发出巧光信号，通过连续监测巧光信号出现的先后顺序W及信号的强弱变化，来及 时分析目的基因 PPARa的拷贝数目，从而对目的基因的表达量进行实时准确定量。实时巧光 定量PCR (RTQ-PCR)的反应体系如表4:
[00巧]表4 RTQ-PCR反应体系组成
[0076]
[0077] RTQ-PCR反应体系的配制必须在冰浴无菌条件下进行，试剂使用前需点动离屯、混 匀后才能使用，反应液配制、分装均要使用无菌的新枪头，W避免污染，而且配制的速度要 快，W免其中的反应酶失活。反应试剂添加完成后，使用配有八联管转头的台式冷冻离屯、机 短暂离屯、，确保试剂沉积在管底。
[007引巧光定量反应条件:95°C预变性30s;95°C，15s;60°C，30s;72°C，30s，40个循环;采 集巧光信号数值Ct;获得PPARa基因巧光信号数值Ct PPARa和内参基因巧光信号数值 Ctl8s-rRNA后，采取2-^Gt法进行数据分析，Act = Ct PPARa-Ctl8s-rRNA，
[0079] AACt=(Ct PPARa-Ctl8s-rRNA)测试组-(Ct PPARa-Ctl8s-rRNA)空白组，PPARa 基因的相对表达量= 计算得出ppARa基因的相对表达量;现憶并经数理统计的 结果如表5所不：
[0080] 表5 5组鱼样品的PPARa基因的相对表达量
[0081]
[0082] 受到酸化海水胁迫的，鱼样本生理机能发生变化，通过PPARa基因的相对表达量来 监测水体酸化的程度，随着抑不断降低，鱼体内PPARa基因相对表达量也随之降低，于本实 验中，当抑为7.3时，PPARa基因相对表达量最低，为1.03。
[00削通过表5的数据结果，建立海水青鎌的PPARa基因的相对表达量与C02酸化水 体的pH值的标准曲线，获取86天龄左右的海水青鎌，然后将计算得所述待测水域的海水青 鎌的PPARa基因的相对表达量与标准曲线比对，获得c02酸化水体的抑值大小。通过本 发明的方法，就可W通过鱼作为监测水体酸化的生物样本，鱼的PPARa基因作为监测水中 0)2酸化的敏感生物标记物，就可W获知待测水域中C02酸化水体的pH值大小，W及获知待测 水域目前的危害程度。
[0084] 实施例2
[0085] 1、鱼样本的准备
[0086] 采用海水青鎌稚鱼为起始鱼，在C〇2酸化水体养殖8周后作为监测酸化水体的生物 样本。将稚鱼分成2组，每组3个平行进行养殖实验，运2组分别为正常(无酸化)对照组与待 测水域组，其中正常水域的抑值为8.1。将稚鱼分别放入正常水体和待测水域水体中饲养。 养殖8周后，每个平行取3尾鱼样品测定，每组测定3*3 = 9个数据，将每组9个数据数理统计 后得到各组鱼的PPARa基因相对表达量。
[0087] 2、按照分组，利用RNA提取试剂，提取鱼样品总RNA，利用反转录试剂将RNA反转录 合成首链cDNA;
[0088] (1)快速称取冷冻的鱼样品lOOmg左右，记录实际重量为M，然后放入提前预冷的研 鉢中倒入液氮，用研巧研磨称量好的稚鱼样品，直至研磨成粉末状，然后用不诱钢小药匙迅 速将样品粉末移入冰浴中的玻璃匀浆管底部。
[0089] (2)用移液枪往玻璃匀浆管中加入0.6mL RNAiso试剂，充分匀浆至匀浆液呈无颗 粒透明状后，将匀浆液转入1.5ml离屯、管中。然后再向匀浆管中加入0.2mL RNAiso试剂，洗 涂匀浆棒和匀浆管管壁各一次，之后将匀浆液转入之前的离屯、管中，重复上述操作一次，使 加入的RNAiso试剂总体积为ImL。盖好离屯、管并颠倒混匀数次后室溫静置5min。
[0090] (3)用1000化微量移液枪往上一步的1.5mL离屯、管中加入2(Κ)化氯仿，盖紧离屯、管 盖，混匀至溶液乳化后，再室溫静置5min。
[0091] (4)转移至高速冷冻离屯、机中12000g，4°C，离屯、15min。
[0092] (5)小屯、从离屯、机中取出离屯、管，用1000化微量移液器吸取50化L上清液至一个新 的1.5ml离屯、管中。
[0093] (6)然后往新的1.5mL离屯、管中加入50化L异丙醇，盖好离屯、管并充分颠倒混匀，室 溫静置lOmin。
[0094] (7)转移至高速冷冻离屯、机中12000g，4°C，离屯、lOmin。
[0095] (8)将1.5mL离屯、管中上清液倒掉，再12000g，4°C，离屯、Imin，用小枪头（100化)将 上清液吸净。
[0096] (9)往离屯、管中加入现配的预冷的75%乙醇1ml(无水乙醇3:1DEPC水），盖好离屯、 管并轻轻上下颠倒洗涂离屯、管管壁及RNA，再12000g，4°C，离屯、Imin后小屯、去除乙醇。
[0097] (10)在超净工作台中打开离屯、管盖，室溫干燥沉淀lOmin，加入50化DEPC处理水 溶解沉淀，静置3min，待RNA沉淀完全溶解后存于-20°C冰箱待用。
[009引 （11)使用!'hermo Scientific Nano化op 2000c测定总RNA含量，获得测定浓度，
[0099] RNA含量的计算公式：
[0100] 样品 RNA 浓度(yg/mg)=测定浓度(ngAU)X50X1000 今M。
[0101 ] (12)用1 %琼脂糖凝胶电泳检测其纯度，若测定的0D260/0D280值在1.9-2.1之间， 且总RNA电泳条带清晰呈现为28S，18S和5SS条带，28S的条带亮度约为18S的两倍，说明RNA 纯度和浓度符合要求，可继续进行后续实验；
[0102] (13)利用反转录试剂将RNA反转录合成首链cDNA;
[0103] a)逆转录:用普通PCR仪将RNA反转录成首链cDNA，按照表2配制反转录反应液：
[0104] 表2反转录反应液组成 Γ01051
[0107] 反应液配制方法:配置前先根据反转录样品的数量计算出各反应液实际需要量， 统一加入无菌离屯、管中混合均匀，然后分装到各个反应管中，最后添加样品并小屯、点动离 屯、混匀，使反应更加充分并减少误差。配制过程需在冰浴且无菌体系中进行，
[0108] 反转录反应条件：50°C，20min一95°C，5min一5°C，5min一 15°C，15min。
[0109] 4、实时巧光定量PCR检测目的基因
[0110] (1)引物设计
[0111] 所述PPARa基因的特异性引物为：
[0112] 上游引物为：口口4尺曰斗：5'-〔46了64〇：了66(：1'(：1'1'1'1^61'-3'，（沈9 10備.1)
[0113] 下游引物为:口口4尺曰-尺:5'-〔6〇：了644了64了6(：1'押〇：-3'；（569 10^.2)
[0114] 所述鱼的内参基因为18s-rRNA基因，所述18s-rRNA基因的引物为：
[0115] 上游引物为：183-诚酷斗：5'-1764〔〇：44〔4〔666444〇：1'-3'，（沈9 10備.3)
[0116] 下游引物为：18s-rRNA-R: 5 ' -CAAATCGCTCCACCAACTAAGAA-3 ' ；（沈Q ID NO. 4)
[0117] (2)PCR检测目的基因
[011引 PCR扩增反应用普通PCR仪扩增cDNA，按表3配制PCR反应液：
[0119] 表3 PCR反应液组成
[0120]
[0121] 根据反转录样品数量计算各PCR反应试剂用量，配制反应混合液，点动离屯、混匀， 然后分装到PCR反应结束后的PCR反应管中，再点动离屯、混匀。反应结束后，将PCR管保存于4 °C冰箱待用。
[0122] PCR扩增反应条件：95 °C，Imin一（94°C，30sec一60 °C，30sec一72 °C，Imin，40个循 环)一72°C，5min一 15°C，pause。
[0123] 用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，条件为100V，30min。若PCR反应产物的条带单 一，出现位置在100-20化P之间，可初步确定PCR产物为目的基因。
[0124] PCR产物纯化与浓缩，PCR产物的1%琼脂糖凝胶电泳检测符合实验要求后，取经纯 化浓缩后的PCR产物测序，测序结果经BLAST化ttp://WWW.ncbi .nlm.nih. gov)比对后，确定 PCR扩增产物是目的基因片段，方可进行后续的巧光定量实验。
[0125] 本实验采用的是TaKaRa公司的SYBR?Premix Ex Taq?(p>e；ffect Real Time)试 剂盒，本试剂盒是在PCR扩增合成双链DM的过程中，巧光分子SY:BR?Green I与双链DM结 合能够发出巧光信号，通过连续监测巧光信号出现的先后顺序W及信号的强弱变化，来及 时分析目的基因 PPARa的拷贝数目，从而对目的基因的表达量进行实时准确定量。实时巧光 定量PCR (RTQ-PCR)的反应体系如表4:
[01%] 表4 RTQ-PCR反应体系组成 [0127]
[01%] RTQ-PCR反应体系的配制必须在冰浴无菌条件下进行，试剂使用前需点动离屯、混 匀后才能使用，反应液配制、分装均要使用无菌的新枪头，W避免污染，而且配制的速度要 快，W免其中的反应酶失活。反应试剂添加完成后，使用配有八联管转头的台式离屯、机短暂 离屯、，确保试剂沉积在管底。
[0129] 巧光定量反应条件:95°C预变性3〇8;95°(：153;6〇1：3〇3;721：3〇3,40个循环;采集 巧光信号数值Ct;采用上述参数，多次循环测试，相对其他参数来说采集到的巧光信号数值 Ct误差小;获得PPARa基因巧光信号数值Ct PPARa和内参基因巧光信号数值Ctl8s-rRNA后， 采取法进行数据分析，Act = Ct PPARa-Ctl8s-rRNA，
[0130] AACt=(Ct PPARa-Ctl8s-rRNA)测试组-(Ct PPARa-Ctl8s-rRNA)空白组，PPARa 基因的相对表达量=2 ，计算2 ΑΔα得出ppARa基因的相对表达量，采取2 AAet法进行数 据分析能减少误差，能够准确表述PPARa基因的相对表达量从而精准反映出水污染程度;检 ii结果:对照组的值为1.78，待测组的2AAet值为1.69，结果显示对照组的值大 于待测组的值，所述待测水域已经受到了 c〇2酸化的污染，需及早进行水域治理，而用 化学的方法测试C〇2酸化的程度，一般采用试纸测试，但由于海水中存在各种杂质而导致测 试C〇2酸化的程度不准确，且难W判断酸化的危害程度，不能及时监控和防治海水酸化。
[0131] 本法还可W通过借助在实施例1中得到的PPARa基因的相对表达量与C〇2酸化水域 的抑值的正相关曲线，获得在实施例帥待测水域中鱼的PPARa基因的相对表达量值 为1.69时，比对正相关曲线得到待测水域的C〇2酸化水体的抑值为7.9。本发明所提到的空 白组为所使用的试剂盒的空白对照，目的是为了减小误差。
[0132] 尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列 运用，它完全适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可轻易改作他 用，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节 和运里示出与描述的实施例。
[0133]
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【主权项】
1. 一种利用鱼的PPARa基因监测C〇2酸化水体的方法，其特征在于，用鱼作为监测水体污 染的生物样本，鱼的PPARa基因作为监测水中C0 2酸化的敏感生物标记物。2. 根据权利要求1所述的利用鱼的PPARa基因监测C02酸化水体的方法，其特征在于，建 立鱼的PPARa基因的相对表达量2^ AGt与⑶2酸化水体的pH值关系的标准曲线，获取与建立 标准曲线同类同大小的待测水域的鱼，然后将计算得所述待测水域的鱼的PPARa基因的相 对表达量2^ Aet与标准曲线比对，获得C02酸化水体的pH值大小。3. 根据权利要求2所述的利用鱼的PPARa基因监测C02酸化水体的方法，其特征在于，计 算PPARa基因的相对表达量具体包括以下步骤： 1) 用鱼作为监测酸化水体的生物样本； 2) 利用RNA提取试剂，提取鱼样品总RNA，利用反转录试剂将RNA反转录合成首链cDNA; 3) 实时荧光定量PCR检测，以首链cDNA为模板，分别根据所述PPARa基因的特异性引物， 18s-rRNA基因引物，在罗氏PCR仪上进行实时荧光定量PCR扩增反应，荧光定量PCR反应体系 为：SYBR试剂12.5yL、上游引物FlyL、下游引物RlyL、cDNA 2yL、灭菌蒸馏水8.5yL，反应体系 总体积为25yL;反应程序采用三步法:95 °C预变性30s; 95 °C，15s; 60 °C，30s; 72 °C，30s，40个 循环，采集荧光信号数值Ct，Ct值是每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的 循环数； 4) 获得PPARa基因荧光信号数值CtPPARa和内参基因荧光信号数值Ctl8s-rRNA后，采取 2-ΛΔα法进行数据分析，Δ Ct = CtPPARa-Ctl8s-rRNA， Δ Δ Ct = (CtPPARa-Ct 18s_rRNA)测试组-(CtPPARa-Ct 18s_rRNA)空白组，PPARa基因的 相对表达量= 2_AAet，计算2_AAet得出PPARa基因的相对表达量。4. 根据权利要求3所述的利用鱼的PPARa基因监测C02酸化水体的方法，其特征在于，实 验选鱼为稚鱼，将稚鱼分成若干组，其中一组作为正常pH对照组，其他组为待测水域组;分 别将稚鱼放入正常pH对照水体和待测水域水体中饲养;8周后随机抽取稚鱼，检测并计算 PPARa相对表达量，如果待测水域组的值小于正常pH对照组的值，那么待 测水域的pH值小于正常对照组的pH值，则待测水域的水体受到C0 2酸化。5. 根据权利要求1-4任一项所述的利用鱼的PPARa基因监测C02酸化水体的方法，其特征 在于，PPARa基因的特异性引物为： 上游引物如SEQ ID NO · 1 所示：PPARa-F: 5 '-CAGTGACCTGGCTCTTTTCGT-3 '， 下游引物如SEQ ID N0.2所示：PPARa-R:5'-CGCCTGAATGATGCTCTCC-3'； 鱼的内参基因为18s-rRNA基因，18s-rRNA基因的引物为： 上游引物如SEQ ID NO · 3所示：18s-rRNA-F: 5 ' -TTGACCCAACACGGGAAACCT-3 '， 下游引物如SEQIDN0·4所示：18s-rRNA-R:5'-CAAATCGCTCCACCAACTAAGAA-3'。6. 根据权利要求5所述的利用鱼的PPARa基因监测C02酸化水体的方法，其特征在于，鱼 的PPARa基因的相对表达量与C0 2酸化水体的pH值大小呈正相关。7. 根据权利要求6所述的利用鱼的PPARa基因监测C02酸化水体的方法，其特征在于，所 述鱼为海水青鏘或淡水青鏘。8. 根据权利要求7所述的利用鱼的PPARa基因监测C02酸化水体的方法，其特征在于，所 述稚鱼均为30天龄稚鱼。
【文档编号】C12Q1/68GK106011271SQ201610546287
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年7月12日
【发明人】许友卿, 丁兆坤, 刘永强, 张茜, 唐旎, 郑民, 郑一民
【申请人】广西大学