尿生物标志物群、基因表达特征及其使用方法

尿生物标志物群、基因表达特征及其使用方法
【专利摘要】本发明一般地涉及生物标志物分析领域，特别是测定来自尿样品的基因表达特征。本公开内容提供用于诊断男性受试者中的前列腺病症例如前列腺癌的组合物、试剂盒和方法。
【专利说明】尿生物标志物群、基因表达特征及其使用方法
[0001] 相关申请 本申请要求于2013年8月6日提交的美国临时申请号61 /862，630的权益，所述临时申请 的内容通过引用以其整体结合到本文中。 发明领域
[0002] 本发明一般地涉及生物标志物分析领域，特别是测定尿样品的基因表达特征。 [0003] 背景 不断增加的出现在癌细胞中的遗传和表观遗传变化的知识提供了通过分析肿瘤相关 的核酸序列和概况来检测、表征和监测肿瘤的机会。这些变化可通过检测多种癌相关生物 标志物中的任一个来观察。多种分子诊断测定被用于检测这些生物标志物并产生对患者、 医生、临床医生和研究者有价值的信息。迄今为止，这些测定主要在衍生自外科手术切除的 肿瘤组织或通过活组织检查获得的组织的癌细胞上进行。
[0004] 然而，使用体液样品进行这些检验的能力时常比使用患者组织样品更合乎需要。 使用体液样品的较小创伤方法在患者福利、进行纵向疾病监测的能力和甚至在组织细胞不 易接近时获得表达概况的能力方面具有广泛的影响，例如，在前列腺中。对于这些样品，先 前公开的采集方法常常需要直肠指检(DRE)或前列腺按摩以使得足够的前列腺衍生的细胞 液能够进入尿。无DRE或前列腺按摩采集的样品显示对这些生物标志物较低的检测率。
[0005] 因此，存在对新的、无创伤性的检测生物标志物，例如，尿微泡中生物标志物的方 法的需求以帮助对前列腺疾病或其他医疗病况的诊断、预后、监测或治疗选择。特别地，存 在对在尿样品采集之前不需要DRE或前列腺按摩和不需要涉及从尿样品分离细胞沉淀的样 品制备步骤的非创伤性方法的需求。
[0006] 发明概述 本发明提供检测尿微泡中的一种或多种生物标志物以帮助对受试者中的疾病，例如， 癌症，特别是前列腺疾病或其他医疗病况的诊断、预后、监测或治疗选择的方法。所述方法 包括从受试者获得随机尿样品；从样品中提取mRNA，检测PCA3和ERG的mRNA表达水平;和将 PCA3和ERG的mRNA表达水平归一化至KLK3或SPDEF。所述方法进一步包括使用预定的式计算 归一化的PCA3和ERG的mRNA表达水平的输出值;和比较输出值与使用基于PCA3和ERG的组合 产生的R0C曲线测定的预定截断值以区分处于高癌症风险的受试者与具有低癌症风险的受 试者。此外，这些方法允许鉴定相对于处于高GS前列腺癌的低风险的受试者，处于高 Gleason分数(GS)前列腺癌(例如，Gleason分数(GS) > 6)的高风险的受试者。例如，具有大 于，或在一些实施方案中等于用基于PCA3和ERG的组合产生的R0C曲线测定的预定截断值的 输出值的受试者处于高GS前列腺癌的高风险，而具有低于预定截断值的输出值的受试者处 于高GS前列腺癌的低风险。因此，这些方法可用于区分处于高GS前列腺癌的高风险的受试 者与处于高GS前列腺癌的低风险的受试者。
[0007] 本发明提供用于在有需要受试者中诊断、预后、监测或治疗选择的方法，所述方法 由以下步骤组成：从受试者获得随机尿样品；从样品中提取一种或多种mRNA;检测PCA3和 ERG的mRNA表达水平;和将PCA3和ERG的mRNA表达水平归一化至参考基因；通过将归一化的 PCA3和ERG的mRNA表达水平应用到预定式计算输出值;和比较输出值与使用基于PCA3 mRNA 和ERG mRNA的组合产生的ROC曲线测定的预定截断值以区分具有高癌症复发风险的受试者 与具有低癌症复发风险的受试者。
[0008] 本公开内容的方法使用来自男性受试者的尿样品，例如，在首段尿(first catch urine)的25-40 mL之间的样品。本公开内容的方法不需要直肠指检(DRE)，并且优选地，这 些方法中使用的尿样品为来自未经受DRE的患者的样品。
[0009] 在一些实施方案中，检测患者的PSA水平。在一些实施方案中，所述方法用于分析 来自处于具有在2-10 ng/mL之间的PSA水平的PSA"灰区（gray zone)"的患者的样品。在一 些实施方案中，所述患者为至少50岁的人类男性受试者。
[0010] 在一些实施方案中，患者样品使用以下算法分析：
在一些实施方案中，EX0106分数用于预测患者是否处于低前列腺癌风险或高前列腺癌 风险。例如，具有如使用上述算法所计算的小于10的EX0106分数的患者被鉴定为具有低前 列腺癌风险，具有为10或更高的EX0106分数的患者被鉴定为具有较高的前列腺癌风险。
[0011] 在一些实施方案中，EX0106分数用于预测患者是否处于高Gleason分数(GS)前列 腺癌的低风险或高GS前列腺癌的高风险。例如，具有如使用上述算法所计算的小于10的 EX0106分数的患者被鉴定为具有高GS前列腺癌的低风险，具有为10或更高的EX0106分数的 患者被鉴定为具有较高的高GS前列腺癌风险。
[0012] 在一些实施方案中，本发明的方法进一步包括从随机尿样品分离微泡部分和从微 泡部分提取核酸。
[0013] 在一些实施方案中，所述方法进一步包括检测AMACR、BIRC5、H0XC6和/或SPARCL1 的表达水平。在一些实施方案中，所述方法进一步包括检测六1^^811^5、11(^06和/或 SPARCL1的表达水平和计算基于PCA3、ERG和AMACR、BIRC5、H0XC6和/或SPARCL1组合的输出 值。
[0014] 在任何前述的方法中，在核酸提取之前向尿样品加入已知量的Q-P颗粒。检测Q-0 靶基因的表达水平，并将检测到的表达水平与已知的Q-0颗粒量比较。
[0015] 本发明提供用于受试者中医疗病况的诊断、预后、监测或治疗选择的方法，所述方 法包括以下步骤：（a)从受试者尿样品中获得微泡部分；（b)从微泡部分提取一种或多种 核酸;和(c)分析所提取的核酸以检测PCA3和ERG的存在、不存在或表达水平。这些标志物 在新鲜尿样品以及先前冷冻并解冻的尿样品中以稳定水平可检测。优选地，尿样品为40 mL 或20 mL。更优选地，尿样品为从膀胱排出的第一个40 mL或从膀胱排出的第一个20 mL。这 些标志物的检测在来自相同患者的样品中和来自不同患者的样品中可重现。
[0016] 本发明还提供一种方法，其进一步包括检测参考基因的表达水平和测定生物标志 物的归一化的相对表达水平的步骤，其中所述生物标志物的相对表达水平为生物标志物表 达水平与参考基因表达水平的比率，并且其中当生物标志物的相对表达水平大于生物标志 物表达的截断水平时，受试者被鉴定为患有或处于增加的医疗病况，例如癌症的风险中。在 一些实施方案中，所述生物标志物为至少ERG和PCA3。在一些实施方案中，所述生物标志物 为至少ERG和PCA3以及至少一种选自六1^〇?、81此5、11(^06、3?41?(^1和其组合的其他生物标 志物。在一些实施方案中，所述参考基因为前列腺特异性基因。在一些实施方案中，所述参 考基因为KLK3或SPDEF，或其组合。在一些实施方案中，所述参考基因为KLK3。在一些实施方 案中，所述参考基因为管家基因，例如GAPDH。
[0017] 在一些实施方案中，衍生自每一生物标志物水平的受试者工作特征（Receiver Operator Characteristic，ROC)曲线或通过生物标志物组合所建立的分数的曲线下面积 (AUC)使用来自对照和疾病患者二者的生物标志物结果计算。在一些优选的实施方案中，衍 生自每一生物标志物水平的R0C曲线或通过生物标志物组合所建立的分数的AUC值大于 0.5、0.6、0.7或0.8。优选地，AUC值大于0.7。通过实施考虑临床应用所必需的灵敏度、特异 性、阴性预测值(NPV)、阳性预测值(PPV)、阳性似然比（PLR)和阴性似然比（NLR)的截断分 析，本领域技术人员将容易地能够最大化生物标志物水平或生物标志物组合的诊断准确 度。生物标志物结果或生物标志物结果的组合以多种方法中的任一种分析。在一些实施方 案中，结果使用单变化的或单变量分析(SV)分析。在一些实施方案中，结果使用多变量分析 (MV)分析。生物标志物和/或生物标志物群的SV和MV分析的实例在下表中示出。
[0018] 在一些实施方案中，所述参考基因为前列腺特异性基因。在一些实施方案中，参考 基因为KLK3或SPDEF，或其组合。在一些实施方案中，参考基因为管家基因，例如GAPDH。
[0019] 生物标志物和生物标志物组合(本文中也称为生物标志物群）可用于医疗病况例 如，癌症，包括侵袭性癌症的诊断、预后、监测或治疗选择的方法中。在一些实施方案中，生 物标志物和生物标志物组合可用于基于所检测的表达水平和/或表达模式，关联生物标志 物和/或群表达与受试者患有侵袭性癌症或处于患侵袭性癌症风险中的可能性。在一些实 施方案中，生物标志物和生物标志物组合可用于基于所检测的表达水平和/或表达模式，关 联生物标志物和/或群表达与受试者患有癌症复发或处于患癌症复发风险中的可能性。在 一些实施方案中，生物标志物和生物标志物组合可用于基于所检测的表达水平和/或表达 模式，关联生物标志物和/或群表达与受试者患有侵袭性前列腺癌或处于患侵袭性前列腺 癌风险中的可能性。生物标志物和生物标志物组合可用于关联生物标志物和/或群表达与 受试者的Gleason分数。例如，生物标志物和/或群表达水平可用于基于所检测的表达水平 和/或表达模式鉴定受试者的Gleason分数。例如，PCA3和ERG的表达水平可用于鉴定受试者 的Gleason分数大于6。生物标志物和生物标志物组合可用于基于所检测的表达水平和/或 表达模式，关联生物标志物和/或群表达与受试者将需要根治性前列腺切除术的可能性。
[0020] 在一些实施方案中，所述医疗病况为癌症。例如，所述癌症为前列腺癌。在一些实 施方案中，所述癌症为泌尿生殖器癌症，例如，前列腺癌、肾癌、膀胱癌或扩散到泌尿生殖器 的转移性癌症。在一些实施方案中，所述癌症为侵袭性癌症。例如，在一些实施方案中，所述 医疗病况为侵袭性前列腺癌、侵袭性肾癌或侵袭性膀胱癌。
[0021] 有需要的受试者患有癌症例如，侵袭性癌症或处于患癌症，例如，侵袭性癌症的风 险中。在一些实施方案中，所述受试者患有前列腺癌或处于患前列腺癌的风险中。在一些实 施方案中，所述受试者没有患前列腺癌的风险。在一些实施方案中，所述受试者具有前列腺 癌并且已被指定具体的Gleason分数。例如，在一些实施方案中，受试者已被指定大于或等 于7的Gleason分数。在一些实施方案中，所述受试者已被指定大于或等于1、2、3、4、5、6、7、8 或9的Gleason分数。在一些实施方案中，受试者已被指定在1-10、1-9、1-8、1-7、1-6、1-5、1_ 4、1-3、卜2、2-10、2-9、2-8、2-7、2-6、2-5、2-4、2-3、3-10、3-9、3-8、3-7、3-6、3-5、3-4、4-10、 4-9、4-8、4-7、4-6、4-5、5-10、5-9、5-8、5-7、5-6、6-10、6-9、6-8、6-7、7-10、7-9、7-8、8-10、 8-9或9-10范围内的Gleason分数。在一些实施方案中，受试者已经历前列腺切除术，例如， 根治性前列腺切除术或处于必须经历前列腺切除术，例如，根治性前列腺切除术的风险中。
[0022] 所述受试者为，例如，基于PSA检验结果和/或可疑DRE，例如，临床疑似前列腺癌的 男性人类受试者。在一些实施方案中，受试者具有阴性活组织检查的临床史。在一些实施方 案中，受试者无阴性活组织检查的临床史。在一些实施方案中，受试者已被建议进行重复活 组织检查。在一些实施方案中，受试者已被建议进行初次或第一次活组织检查。
[0023] 在一些实施方案中，受试者已被建议或安排前列腺切除术。在一些实施方案中，所 述受试者已在组织学上证实腺泡型（即典型的）前列腺癌。在一些实施方案中，前列腺癌为 局部的。在一些实施方案中，前列腺癌为局部晚期。
[0024] 在一些实施方案中，所述受试者未患和/或不疑似患有诸如传染性疾病的疾病，例 如，肝炎(所有类型)和/或HIV。在一些实施方案中，受试者无并发性肾和/或膀胱肿瘤史。在 一些实施方案中，受试者先前没有接受或没有同时接受任何形式的对前列腺癌的新辅助或 定向治疗(focal therapy)。在一些实施方案中，所述受试者在提供尿样品的六个月内先前 没有接受或没有同时接受任何形式的新辅助或定向治疗，包括雄激素衍生治疗(androgen derivation therapy)〇
[0025] 本文所述的标志物和/或标志物组合可用于多种试剂盒，例如，可用于检验来自各 种患者的尿样品的诊断试剂盒。在一些实施方案中，在用试剂盒检验样品之前，例如使用过 滤浓缩步骤，浓缩尿样品。结果可使用多种方法的任一种处理，包括快速qPCR读出装置。
[0026] 附图简述 图1A和1B为描绘患者群7样品分析的实验室工作流程第一天（图1A)和第二天（图1B)的 一系列示意图。
[0027]图2A为描绘对于258个群7样品检测的郎Ct值的密度分布的图。Y轴代表密度，X轴 代表Ct值。
[0028]图2B为描绘对于258个群7样品检测的卯Ct值的密度分布的盒形图。X轴代表Ct 值。
[0029] 图3A和3B为描绘对于群7中每一患者当归一化至KLK3时PCA3 AUC值与样品体积的 相关性的两个图。在图3A中，Y轴代表AUC值并且X轴代表群7中的每一样品。在图3B中，Y轴显 示样品体积并且X轴代表群7中的每一样品。图例指示每一样品来自的临床地点。图3A和3B 表明当将供给体积限制于仅20 mL时，PCA3 AUC (归一化至KLK3)从〈0.65提高至>0.7。这些 图表明AUC高度依赖于样品体积。
[0030]图4A和4B为描绘对于来自患者群7的其中样品体积小于或等于100 mL的样品（N= 236)，基于归一化至KLK3的ERG表达分析(非估算的，图4A)和归一化至KLK3的PCA3表达分析 (图4B)的R0C曲线的两个图。在两个图中，X轴代表特异性;Y轴代表灵敏度。
[0031]图5A和5B为描绘对于来自患者群7的其中样品体积小于或等于40 mL的样品（N= 189)，基于归一化至KLK3的ERG表达分析(非估算的，图5A)和归一化至KLK3的PCA3表达分析 (图5B)的R0C曲线的两个图。在两个图中，X轴代表特异性;Y轴代表灵敏度。
[0032]图6A和6B为描绘对于来自患者群7的其中样品体积小于或等于20 mL的样品（N= 122)，基于归一化至KLK3的ERG表达分析(非估算的，图6A)和归一化至KLK3的PCA3表达分析 (图6B)的ROC曲线的两个图。在两个图中，X轴代表特异性;Y轴代表灵敏度。
[0033]图7为描绘对于来自患者群7的其中样品体积小于或等于100 mL的样品（N=236)， 基于归一化至KLK3的ERG和PCA3表达分析的ROC曲线的图。ERG表达分析为估算的。X轴代表 特异性;Y轴代表灵敏度。
[0034]图8为描绘对于来自患者群7的其中样品体积小于或等于40 mL的样品(N=189)，基 于归一化至KLK3的ERG和PCA3表达分析的R0C曲线的图。ERG表达分析为估算的。X轴代表特 异性;Y轴代表灵敏度。
[0035]图9为描绘对于来自患者群7的其中样品体积小于或等于20 mL的样品(N=122)，基 于归一化至KLK3的ERG和PCA3表达分析的R0C曲线的图。ERG表达分析为估算的。X轴代表特 异性;Y轴代表灵敏度。
[0036]图10为一系列显示使用应用于先前的群5数据的预定公式和模型截断阈值的群7 数据的2x2分析的四个表。（Sens =灵敏度;Spec =特异性;NPV =阴性预测值;PPV =阳性预 测值;C5 =群5; C7 =群7)。尽管C5与C7之间，例如，提取方案方法和探针化学有一些变化，当 应用于C7时拟合至C5数据的权重(Weights)表现良好。C5群体积一般小于C6中的，具有更多 的40 mL体积样品。
[0037] 图11为显示每一样品组(German池=对照池样品，患者=群7患者，参考=参考对照 和RT-对照=反转录对照）中所检测基因（AMACR、BIRC5、ERG、H0XC6、KLK3、PCA4、QBETA、 SPARCL1和SPDEF)的Ct值分布的盒形图。
[0038] 图12为比较通过小体积（20 mL)样品中每一指示基因（PCA3、ERG、AMACR、BIRC5、 H0XC6、SPARCL1和SPDEF)的单变量分析产生的AUC值和所有样品的AUC值的图。CI所有和CI 20 mL分别指示对于"所有样品"和"20 mL样品"的AUC的95%置信区间。Y轴代表AUC值;X轴代 表每一检验基因。
[0039] 图 13为显示通过每一指示基因（AMACR、BIRC5、ERG、HOXC6、KLK3、PCA3、SPARCL0P SPDEF)的单变量分析产生的AUC值和比较下列亚群之间的AUC值的图：归一化至SPDEF或 KLK3;估算并归一化至SPDEF或KLK3;所有样品体积与小体积样品；和拷贝数与Ct值。
[0040] 图14为显示通过三基因分析比较群5 (C5)和群7 (C7)的分析的两个图。左图显示 对于所有样品C5和C7的比较。右图显示C5和C7小体积样品的比较。FT0 =不使用PCA3的3基 因模型。FT0指不使用PCA3的3基因模型。
[0041]图15为显示通过下列基因的指定组合的三基因模型分析产生的AUC值:AMACR、 BIRC5、ERG、H0XC6、KLK3、PCA3、SPARCL1和SPDEF;和比较下列亚群之间的AUC值的图：归一化 至SPDEF或KLK3;估算并归一化至SPDEF或KLK3;所有样品体积与小体积样品；和拷贝数与Ct 值。
[0042] 图16为描绘其中n = 453个样品，PSA中值=5.3 ng/mL和80%的样品2〈 PSA〈 10 ng/mL的患者群中示例性EX0106分数分布的图。
[0043]图17为描绘与护理标准（S0C)治疗的AUC相比具有任何Gleason分数的患者的 EX0106表现的AUC的图。
[0044] 图18A和18B为通过四分位数描绘EX0106表现，即通过EX0106分数四分位数通过活 组织检查鉴定为阳性的样品百分数的一系列图。
[0045]图19为描绘EX0106分数对于高级别前列腺癌，例如，Gleason分数大于6的表现的 图。
[0046]图20为描绘基于Gleason分数亚群的EX0106分数表现的统计分析的图。
[0047]发明详述 癌-相关的生物标志物包括，例如，基因序列中的特异性突变(Cortez和Cal in, 2009; Diehl等人，2008; Network, 2008; Parsons等人，2008)，mRNA和miRNA表达的上调和下 调（Cortez和Calin, 2009; Itadani等人，2008; Novakova等人，2009)，mRNA剪接变异， DNA甲基化模式中的变化(Cadieux等人，2006; Kristensen和Hansen, 2009)，基因组区的 扩增和缺失(Cowell和Lo, 2009)，以及重复DNA序列的异常表达(Ting等人，2011)。各种分 子诊断测定例如突变分析，基因组DNA甲基化状态和基因表达分析可检测这些生物标志物 并产生对患者、医生、临床医生和研究者有价值的信息。迄今为止，这些测定主要在衍生自 外科手术切除的肿瘤组织或活组织检查获得的组织的癌细胞上实施。例如，PCA3、TMPRSS2: ERG和ERG先前已通过活组织检查分析显示与正常前列腺组织相比在前列腺癌中差异表达 (Bussemakers等人，1999; Petrovics等人，2005; Tomlins等人，2005)。
[0048]然而，使用体液样品进行这些检验的能力时常比使用患者组织样品更合乎需要。 使用体液样品的较小创伤方法在患者福利、进行纵向疾病监测的能力和甚至当组织细胞不 易接触时获得表达概况的能力方面具有广泛的影响，例如，在前列腺中。
[0049] 使用尿样品检测前列腺癌标志物例如PSA (也称为KLK3)、PCA3、TMPRSS2:ERG和 ERG先前已有研究（Hessels等人，2007; Laxman等人，2008; Laxman等人，2006; Nguyen 等人，2011; Rice等人，2010; Rostad等人，2009; Salami等人，2011; Tomlins等人， 2005)。然而，先前公开的样品采集方法需要直肠指检(DRE)或前列腺按摩以使得足够的前 列腺衍生的细胞液能够进入尿。无DRE或前列腺按摩采集的样品显示对这些生物标志物较 低的检测率。例如，用D R E时对T M P R S S 2 : E R G的检测率为约6 9 %，但无D R E时仅为约2 4 % (Rostad等人，2009)。
[0050]实际上，目前用于前列腺癌生物标志物的尿分析的样品采集方法需要使用DRE，并 在前列腺的整个触诊表面系统应用轻微指压，伴随每一侧叶3次扫描的指压前列腺，从每叶 的底部到顶部和从侧面到中线用力挤压前列腺，或从每叶的底部到顶部和从侧面到中线 (其中前列腺表面的凹陷在0.5到1 cm之间）用力挤压前列腺三次（Deras等人，2008; Hessels等人，2007; Laxman等人，2008; Laxman等人，2006; Nguyen等人，2011; Rice 等人，2010; Salami等人，2011)。
[0051]另外，先前公开的样品制备方法需要通过离心从DRE之后的尿样品中分离细胞沉 淀（Hessels等人，2007; Laxman等人，2008; Laxman等人，2006; Nguyen等人，2011; Rostad等人，2009; Salami等人，2011)。
[0052]许多先前研究提示在使得能够采集足够RNA材料用于无创伤性前列腺基因分析中 DRE为关键步骤(Deras等人，2008; Hessels等人，2007; Laxman等人，2008; Laxman等 人，2006; Nguyen等人，2011; Rice等人，2010; Rostad等人，2009; Salami等人， 2011; Tomlins等人，2011)。在这些研究的一些中，尿样品需要在采集4小时内处理(Deras 等人，2008; Tomlins等人，2011)。
[0053]与这些先前的样品采集和尿生物标志物检测方法相比，本文提供的方法在尿样品 采集之前不需要DRE或前列腺按摩，这些方法也不需要涉及从尿样品中分离细胞沉淀的样 品制备步骤。这些新的、非创伤性方法使用尿微泡检测生物标志物以帮助前列腺疾病或其 他医疗病况的诊断、预后、监测或治疗选择。肿瘤细胞释放的微泡可用于测定肿瘤的基因状 态（Skog等人，2008)。还参见WO 2009/100029、W0 2011/009104、W0 2011/031892和W0 2011/031877。
[0054]微泡从真核细胞脱落或从质膜出芽，至细胞外。这些膜囊泡大小不均一，直径范围 从约10 nm到约5000 nm。细胞脱落的直径小于0.8 ym的所有膜囊泡在本文中共同称为"微 泡"。
[0055] 本发明基于尿微泡包含受试者前列腺疾病或其他医疗病况的生物标志物这一出 乎意料的发现。因此，可测定患者尿样品用于检测受试者中前列腺疾病或其他医疗病况的 生物标志物。
[0056] 在本文所提供的方法中，采集受试者的随机尿样品而在尿采集之前不使用直肠指 检(DRE)或前列腺按摩。所述尿样品为60 mL、50 mL、40 mL、30 mL、20 mL、15 mL或10 mL。在 一些优选的实施方案中，所述尿样品为40 mL或20 mL。在一些实施方案中，所述尿样品可为 1- 40 mL、l_35 mL、l_30 mL、l_25 mL、1_20 mL、1_15 mL、1_10 mL、1_5 mL、5_40 mL、5_35 mL、5_30 mL、5_25 mL、5_20 mL、5_15 mL、5_10 mL、10_40 mL、10_35 mL、10_30 mL、10_25 mL、10_20 mL、10_15 mL、15_40 mL、15_35 mL、15_30 mL、15_25 mL、15_20 mL、20_40 mL、 20-35 mL、20_30 mL、20_25 mL、25_40 mL、25_35 mL、25_30 mL、30_40 mL、30_35 mL或35-40 mL〇
[0057] 在一个优选的实施方案中，所述尿样品为第一次从膀胱中排出的尿，也被称为"首 段(first catch)"尿。第一次排出的尿包含最高浓度的前列腺-衍生微泡，因此分析第一次 排出的尿提供更高的前列腺生物标志物信号。如本文所示，可用于前列腺癌诊断和预后的 生物标志物的诊断准确度随着第一次排出的尿样品的样品体积的减小而增加。本文所述的 发现表明第一次排出的40 mL或20 mL尿显示较高的诊断准确度（即AUC值）。因此，在一个优 选的实施方案中，所述尿样品为从膀胱排出的第一个40 mL或更少。例如，尿样品为从膀胱 排出的第一个20 mL。
[0058] 不适合用于本公开内容的试剂盒和/或方法的尿样品包括其中样品没有恰当地保 存和/或运送的样品。例如，试样不应长时间保持在室温(例如，15-25 °C)。在一些实施方案 中，试样不应保持在室温(例如，15-25 °C )超过24小时。在一些实施方案中，试样不应保持 在室温(例如，15-25 °C)超过36小时。在一些实施方案中，试样不应保持在室温(例如，15-25 °C )超过48小时。试样不应长时间保持在冷藏温度(例如，2-8 °C )。例如，试样不应保持 在冷藏温度(例如，2-8 °C)超过21天。在一些实施方案中，试样不应保持在冷藏温度(例如， 2- 8 °C)超过30天。通常，试样可无限期地冷冻（例如，< 70 °C)。如果试样是冷冻的，则试 样应该在冰袋或干冰上运送。
[0059] 不适合用于本公开内容的试剂盒和/或方法的尿样品包括严重染血的试样。
[0060] 采集尿样品的时间选择也可根据不同的应用而不同。样品可作为现场尿样品 (spot urine sample)在任何时间采集。当微泡中待分析的生物标志物的量在一天中无太 大波动时，现场尿可足以用于生物标志物分析。在其他情况下，当微泡中待分析的生物标志 物的量存在波动时，米集24-小时尿样品，并且24-小时米集可减轻波动效应。在又进一步的 情况下，采集一系列尿样品以研究微泡中生物标志物的量的波动。采集系列可以以一定的 时间间隔，例如，每六小时，或以情景间隔，例如，在治疗干预之前和之后进行。
[0061]在本文提供的方法中，尿样品首先通过使用包括至少一个过滤步骤的方法进行预 处理。例如，利用粗过滤器(0.8微米)去除细胞和细胞碎片。此过滤可随后是超滤步骤以去 除溶剂和小分子分析物而保留微泡。初次过滤中使用的滤器可为足以去除细胞和细胞碎片 的任何尺寸，例如，大于0.22微米的任何尺寸。为了分离尿微泡，预处理的样品接着经受过 滤浓缩步骤，其中利用具有截留分子量的滤器以保留和浓缩直径大于10 nm的微泡。例如， 样品接着浓缩至小于1 mL，优选100-200 yL的体积。例如，截留分子量至少为100 kDa。 [0062] 在一些实施方案中，用于预处理和处理尿样品的方法包括下列步骤。首先，使用 0.8 ym滤器处理一部分尿样品，例如，至少20 mL。例如，当样品体积< 50 mL时，将至少20 mL吸入附着在0.8 ym滤器上的注射器中，然后挤压入干净容器，例如，干净的50 mL管中。当 样品尿体积多50 mL，样品使用0.8 ym瓶式滤器单元过滤，并且在一些实施方案中，使用抽 吸装置吸取样品通过瓶式滤器单元。然后，不管初始样品体积如何，干净容器中的过滤尿随 后经受脉冲涡旋几秒钟，例如，1-2秒。然后存储过滤尿直至准准备好开始过滤浓缩。
[0063] 一部分过滤的尿，例如，15 mL，然后使用过滤浓缩器(FC)处理。一旦将过滤的尿吸 入FC室（即FC容器顶部的室）中，可以合适的浓度加入内部对照，例如，Q0噬菌体内部对照 (Attostar，Catalog #BAC200)。然后，例如，在吊桶式转头离心机中离心FC容器，并且在室 温(例如，20-25 °C)以4,500 x g离心5分钟。如果样品过滤不完全(在FC中剩余>500 yL保 留物），然后FC应该再次离心2-5分钟。显示最小过滤迹象(在FC中剩余>10 mL保留物）的样 品应丢弃。
[0064]然后从离心机中移走样品，并丢弃滤液（即FC容器底部的液体）。然后用5 mL剩余 的过滤尿和10 mL IX PBS重悬保留物。例如，通过将FC容器倒转3-4次将样品混合均匀。然 后，例如，在吊桶式转头离心机中离心FC容器，并且在室温(例如，20-25 °C)以4,500 x g离 心5分钟。然后从离心机中移走样品，并丢弃滤液。
[0065]在第一个洗涤步骤中，将保留物重悬在15 mL IX PBS中。例如，通过将FC容器倒转 3-4次将样品混合均匀。然后，例如，在吊桶式转头离心机中离心FC容器，并且在室温(例如， 20-25 °C)以4,500 x g离心5分钟。
[0066]在第二个洗涤步骤中，将保留物重悬在15 mL IX PBS中。例如，通过将FC容器倒转 3-4次将样品混合均匀。然后，例如，在吊桶式转头离心机中离心FC容器，并且在室温(例如， 20-25 °C)以4,500 x g离心7分钟。预期的保留体积为100-200 yL。如果样品体积大于250 yL，然后将FC容器在RT下以4,500 x g另外离心5分钟。
[0067] 分离和浓缩尿微泡之后，样品用RNA酶抑制剂预处理，然后提取核酸，以防止消化 提取的RNA并提高提取的质量。任选地，样品可使用合适的缓冲液洗涤至少一次以进一步富 集或纯化微泡部分。在一些实施方案中，样品使用合适的缓冲液洗涤两次以进一步富集或 纯化微泡部分。通过包括裂解微泡、处理裂解物通过RNA-结合柱和从RNA-结合柱上洗脱RNA 的方法在设计为获得高质量的RNA制备物的适当条件下从微泡中提取RNA。任选地，在预处 理步骤中使用的滤器上裂解浓缩的微泡。这些高质量的RNA制备物为前列腺癌和其他前列 腺病症提供基于尿的分子诊断。
[0068] 在一些实施方案中，向FC容器的上室中加入4 yL RNA酶抑制剂。然后横向振动容 器以确保RNA酶抑制剂悬浮良好。然后样品用RNA酶抑制剂室温(例如，15-25 °C)孵育2-3分 钟。然后以250 y 1的体积向每个样品中加入RNA裂解缓冲液，例如，包含2% 1-硫代甘油的 Promega RNA Lysis Buffer (Catalog #Z3051)。然后短暂祸旋样品，并在室温下孵育1分 钟。
[0069] 然后将移液器置于FC容器底部(注意不要接触或刮擦到容器或滤器的侧面），并将 150 yl溶液（即样品+RNA酶抑制剂)转移到2 mL无RNA酶的管中。重复这一步骤直到所有的 样品移走并转移到2 mL无RNA酶的管中。分离的微泡部分然后可供核酸提取，例如，RNA提 取。
[0070] 然后向2 mL管中加入150 yl体积的异丙醇，并通过移液器混合溶液。将裂解物转 移至提取柱，并将提取柱以13,000 x g离心30秒。然后将提取柱转移至新的收集管中，以 13,000 x g离心30秒并重复从提取柱转移至新的收集管直到所有的裂解物已转移。然后向 收集管中加入5〇〇 yl体积的来自Promega的RNA Wash Solution (RWA Buffer) (Catalog #Z309B-C)，并以13,000 x g将管离心30秒。然后将样品转移至新的收集管，向收集管中加 入300 yl RWA Buffer，然后将收集管以13,000 x g离心2分钟。接着将样品转移至新的收 集管，然后以13，000 x g离心收集管2分钟。接着将收集管的内含物转移到无RNA酶DNA酶的 1.5 mL Eppendorf? 管中。然后使用 16 yl无核酸酶水，例如，Promega Nuclease-Free Water (Catalog #P119E)洗脱管的内含物，并以13,000 x g离心1分钟。
[0071] 从微泡部分中提取的RNA然后可在超低温冰箱中< -70 °C保存。
[0072] 本文所述方法可包括使用对照颗粒以测定或评估微泡分离和/或微泡核酸提取的 品质。对照颗粒统一指在微泡分离或核酸提取过程期间某一时刻加入的微泡大小范围的颗 粒，其中所述颗粒包含对照核酸，例如DNA或RNA。特别地，对照核酸包含至少一种用于在分 离或提取过程期间测定对照颗粒回收的量的待测定或测量的靶基因。
[0073] 优选地，对照颗粒为Q-0噬菌体，本文中称为"Q-0颗粒"。本文所述方法中使用的Q-0颗粒可为天然存在的病毒颗粒或可为其中病毒颗粒的至少一个组分(例如，基因组或外壳 蛋白部分)通过本领域已知的重组DNA或分子生物学技术合成的重组或经工程改造的病毒。 Q-0为光滑病毒科家族的成员，特征在于由编码四种病毒蛋白：外壳蛋白、成熟蛋白、裂解蛋 白和RNA复制酶的3种基因组成的线性、单链RNA基因组。由于其与平均微泡大小相似，Q-P可 使用用于分离微泡的同种纯化方法从生物样品中容易地纯化，如本文所描述的。此外，Q-0 病毒单链基因结构的低复杂性有利于其在基于扩增的核酸测定中用作对照。Q-0颗粒包含 用于定量样品中Q-0颗粒的量的待检测或测量的对照靶基因或对照靶序列。例如，对照靶基 因为Q-0外壳蛋白基因。将Q-0颗粒加入尿样品或分离的尿-衍生微泡后，Q-0颗粒的核酸与 来自微泡和/或尿样品的核酸使用本文所述提取方法一起提取。Q-0对照靶基因的检测可通 过RT-PCR分析，例如，与目的生物标志物（即BIRC5、ERG和SPARCL1)同时测定。对照靶基因10 倍稀释的至少2、3或4个已知浓度的标准曲线可用于测定拷贝数。可比较所检测到的拷贝数 和所加入Q-0颗粒的量以测定分离和/或提取过程的品质。
[0074]在一些实施方案中，本公开内容的试剂盒和/或方法使用包括SEQ ID NO: 1的核 酸序列的至少一部分例如，至少10个核苷酸、至少20个核苷酸、至少30个核苷酸、至少40个 核苷酸、至少50个核苷酸、至少100个核苷酸、至少150个核苷酸、至少200个核苷酸、至少250 个核苷酸、至少300个核苷酸、至少350个核苷酸、至少400个核苷酸、至少450个核苷酸和/或 至少500个核苷酸或更多的Q-f3颗粒： 在一些实施方案中，Q-0颗粒在核酸提取之前加入尿样品中。例如，Q-0颗粒在超滤之前 和/或预过滤步骤之后加入尿样品中。
[0075]在一些实施方案中，向尿样品中加入50、100、150、200、250、300、350、400、450、 500、1，000或5，000拷贝的Q-f3颗粒。在一些实施方案中，向尿样品中加入100拷贝的Q-f3颗 粒。Q-0颗粒的拷贝数可基于Q-0噬菌体感染靶细胞的能力来计算。因此，Q-0颗粒的拷贝数 与Q-0噬菌体的集落形成单位有关。
[0076]本文所提供方法可用于，例如，由于升高的PSA、可疑的DRE或任何其他本领域公认 的前列腺癌诊断技术而疑似具有前列腺癌的受试者。在一些实施方案中，本文所提供的方 法可用于无任何先前诊断检验，例如，PSA检验、DRE或任何其他本领域公认的前列腺癌诊断 技术的受试者。
[0077]本文所提供的方法证明了尿微泡中生物标志物与如通过前列腺活组织检查测定 的前列腺癌的发现的关联。前列腺活组织检查为用于前列腺癌诊断的现行标准，但是与前 列腺活组织检查相关的风险是显著的，特别是当考虑到在美国每年实施一百万次活组织检 查。疼痛、出血、尿潴留和尿路感染并非不常见，并且还可出现严重威胁生命的感染。
[0078] 本文所述的方法提供尿样品或尿微泡中癌症-相关转录物的RNA表达水平的非创 伤性分析的方法。特别地，所述方法用于检测尿样品中至少PCA3和ERG的mRNA表达。ERG mRNA可包括一种或多种ERG同种型，包括ERG1、ERG2、ERG3、ERG4、ERG5、ERG6、ERG7、ERG8、 ERG9、ERG前列腺癌特异性同种型1 (EPC1)和ERG前列腺癌特异性同种型2 (EPC2)。如本文 所证明的，检测尿微泡中PCA3和ERG的表达水平在先前经受前列腺活组织检查的受试者(本 文中称为活组织检查群或患者群）中作为前列腺癌和其他前列腺-相关病症的生物标志物 提供极好的灵敏度和特异性。在一些实施方案中，组合检测2、3、4、5、6、7、8、9或10种或更多 种生物标志物。
[0079] 在一些实施方案中，本公开内容的试剂盒和/或方法用于检测具有下列核酸序列 的至少一部分例如，至少10个核苷酸、至少20个核苷酸、至少30个核苷酸、至少40个核苷酸、 至少50个核苷酸、至少100个核苷酸、至少150个核苷酸、至少200个核苷酸和/或至少250个 核苷酸或更多的ERG mRNA:
(SEQ ID NO: 2) 如本文所显示的，PCA3和ERG通过单变量分析来分析，并且表明每一基因单独（当归一 化至参考基因例如KLK3)具有高诊断准确度(AUC值大于0.6)。本文所公开的分析显示当一 起测定二者的归一化表达水平时，PCA3和ERG具有比单独测定时更大的诊断价值。
[0080]在一些实施方案中，本公开内容的试剂盒和/或方法用于检测具有以下核酸序列 的至少一部分例如，至少10个核苷酸、至少20个核苷酸、至少30个核苷酸、至少40个核苷酸、 至少50个核苷酸、至少100个核苷酸、至少150个核苷酸、至少200个核苷酸、至少250个核苷 酸、至少300个核苷酸、至少350个核苷酸、至少400个核苷酸和/或至少450个核苷酸或更多 的PCA3 mRNA:
在一些实施方案中，本公开内容的试剂盒和/或方法用于检测具有SEQ ID NO: 2的核 酸序列的至少一部分，例如，至少10个核苷酸、至少20个核苷酸、至少30个核苷酸、至少40个 核苷酸、至少50个核苷酸、至少100个核苷酸、至少150个核苷酸、至少200个核苷酸和/或至 少250个核苷酸或更多的ERG mRNA，以及具有SEQ ID N0: 3的核酸序列的至少一部分，例 如，至少10个核苷酸、至少20个核苷酸、至少30个核苷酸、至少40个核苷酸、至少50个核苷 酸、至少100个核苷酸、至少150个核苷酸、至少200个核苷酸、至少250个核苷酸、至少300个 核苷酸、至少350个核苷酸、至少400个核苷酸和/或至少450个核苷酸或更多的PCA3 mRNA。 [00811在一些实施方案中，本公开内容的试剂盒和/或方法用于检测具有SEQ ID NO: 2 的全长核酸序列的ERG mRNA和具有SEQ ID NO: 3的全长核酸序列的PCA3 mRNA。
[0082] 额外的生物标志物组合可与PCA3和ERG-起使用，其中1、2、3、4、5、6、7、8、9或10或 更多个额外的基因作为癌症，例如侵袭性癌症或前列腺癌的生物标志物可具有高诊断价 值。这些额外基因的实例包括AMACR、BIRC5、H0XC6和SPARCL1。
[0083]在一些实施方案中，本公开内容的试剂盒和/或方法用于检测具有SEQ ID N0: 4、 SEQ ID NO: 37或SEQ ID NO: 38的核酸序列的至少一部分，例如，至少10个核苷酸、至少20 个核苷酸、至少30个核苷酸、至少40个核苷酸、至少50个核苷酸、至少100个核苷酸、至少150 个核苷酸、至少200个核苷酸、至少250个核苷酸、至少300个核苷酸、至少350个核苷酸、至少 400个核苷酸、至少450个核苷酸和/或至少500个核苷酸或更多的AMACR mRNA: 人AMACR，转录物变体l，mRNA (SEQ ID N0: 4)
NO: 38) 在一些实施方案中，本公开内容的试剂盒和/或方法用于检测具有SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 39或SEQ ID NO: 40的核酸序列的至少一部分，例如，至少10个核苷酸、至少20个核 苷酸、至少30个核苷酸、至少40个核苷酸、至少50个核苷酸、至少100个核苷酸、至少150个核 苷酸、至少200个核苷酸、至少250个核苷酸、至少300个核苷酸、至少350个核苷酸、至少400 个核苷酸、至少450个核苷酸和/或至少500个核苷酸或更多的BIRC5 mRNA: 人BIRC5,转录物变体l，mRNA (SEQ ID NO: 5)
在一些实施方案中，本公开内容的试剂盒和/或方法用于检测具有SEQ ID NO: 6或SEQ ID NO: 41的核酸序列的至少一部分，例如，至少10个核苷酸、至少20个核苷酸、至少30个核 苷酸、至少40个核苷酸、至少50个核苷酸、至少100个核苷酸、至少150个核苷酸、至少200个 核苷酸、至少250个核苷酸、至少300个核苷酸、至少350个核苷酸、至少400个核苷酸、至少 450个核苷酸和/或至少500个核苷酸或更多的HOXC6 mRNA: 人HOXC6,转录物变体l，mRNA (SEQ ID NO: 6)
人H0XC6,转录物变体2，mRNA (SEQ ID NO: 41)
在一些实施方案中，本公开内容的试剂盒和/或方法用于检测具有SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 42、SEQ ID NO: 43或SEQ ID NO: 44的核酸序列的至少一部分，例如，至少10个核 苷酸、至少20个核苷酸、至少30个核苷酸、至少40个核苷酸、至少50个核苷酸、至少100个核 苷酸、至少150个核苷酸、至少200个核苷酸、至少250个核苷酸、至少300个核苷酸、至少350 个核苷酸、至少400个核苷酸、至少450个核苷酸和/或至少500个核苷酸或更多的SPARCL1 mRNA： 人SPARCL1，转录物变体l，mRNA (SEQ ID NO: 7)
人SPARCL1，转录物变体2，mRNA (SEQ ID NO: 42)
在一些实施方案中，本公开内容的试剂盒和/或方法用于检测（i)具有SEQ ID NO: 2的 核酸序列的至少一部分，例如，至少10个核苷酸、至少20个核苷酸、至少30个核苷酸、至少40 个核苷酸、至少50个核苷酸、至少100个核苷酸、至少150个核苷酸、至少200个核苷酸和/或 至少250个核苷酸或更多的ERG mRNA，（ii)具有SEQ ID NO: 3的核酸序列的至少一部分， 例如，至少10个核苷酸、至少20个核苷酸、至少30个核苷酸、至少40个核苷酸、至少50个核苷 酸、至少100个核苷酸、至少150个核苷酸、至少200个核苷酸、至少250个核苷酸、至少300个 核苷酸、至少350个核苷酸、至少400个核苷酸和/或至少450个核苷酸或更多的PCA3 mRNA， 和（iii)至少一种选自以下的其他mRNA的至少一部分：（1)具有SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 37或SEQ ID NO: 38的核酸序列的至少一部分例如，至少10个核苷酸、至少20个核苷酸、至 少30个核苷酸、至少40个核苷酸、至少50个核苷酸、至少100个核苷酸、至少150个核苷酸、至 少200个核苷酸、至少250个核苷酸、至少300个核苷酸、至少350个核苷酸、至少400个核苷 酸、至少450个核苷酸和/或至少500个核苷酸或更多的AMACR mRNA; (2)具有SEQ ID NO: 5、 SEQ ID NO: 39或SEQ ID NO: 40的核酸序列的至少一部分，例如，至少10个核苷酸、至少20 个核苷酸、至少30个核苷酸、至少40个核苷酸、至少50个核苷酸、至少100个核苷酸、至少150 个核苷酸、至少200个核苷酸、至少250个核苷酸、至少300个核苷酸、至少350个核苷酸、至少 400个核苷酸、至少450个核苷酸和/或至少500个核苷酸或更多的BIRC5 mRNA; (3)具有SEQ ID NO: 6或SEQ ID NO: 41的核酸序列的至少一部分，例如，至少10个核苷酸、至少20个核 苷酸、至少30个核苷酸、至少40个核苷酸、至少50个核苷酸、至少100个核苷酸、至少150个核 苷酸、至少200个核苷酸、至少250个核苷酸、至少300个核苷酸、至少350个核苷酸、至少400 个核苷酸、至少450个核苷酸和/或至少500个核苷酸或更多的H0XC6 mRNA;和(4)具有SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 42、SEQ ID NO: 43或SEQ ID NO: 44的核酸序列的至少一部分，例 如，至少10个核苷酸、至少20个核苷酸、至少30个核苷酸、至少40个核苷酸、至少50个核苷 酸、至少100个核苷酸、至少150个核苷酸、至少200个核苷酸、至少250个核苷酸、至少300个 核苷酸、至少350个核苷酸、至少400个核苷酸、至少450个核苷酸和/或至少500个核苷酸或 更多的SPARCL1。
[0084]在一些实施方案中，本公开内容的试剂盒和/或方法用于检测具有SEQ ID N0: 2 的全长核酸序列的ERG mRNA、具有SEQ ID NO: 3的全长核酸序列的PCA3 mRNA和至少一种 选自以下的其他mRNA:具有SEQ ID NO: 4、SEQ ID N0: 37或SEQ ID N0: 38的全长核酸序 列的AMACR mRNA、具有SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 39或SEQ ID NO: 40的全长核酸序列的 BIRC5 mRNA、具有SEQ ID NO: 6或SEQ ID NO: 41的全长核酸序列的H0XC6 mRNA和具有SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 42、SEQ ID NO: 43或SEQ ID NO: 44的全长核酸序列的SPARCL1 mRNA。
[0085] mRNA表达水平使用各种本领域公认的技术中的任一种检测。例如，尿微泡中每个 生物标志物的Ct (循环阈值)值通过RT-qPCR分析测定。在实时PCR测定中，阳性反应通过荧 光信号的累积检测。Ct值定义为荧光信号越过阈值(即，超过背景水平)所需要的循环数目。 Ct水平与样品中靶核酸的量成反比（即，Ct水平越低，样品中靶核酸的量越大）。
[0086] 在一些实施方案中，计算所检测基因（即，PCA3和ERG)的拷贝数。拷贝数也可使用 从尿微泡中提取的一种或多种核酸的RT-qPCR分析定量。使用本领域已知的方法，例如通过 使用校准曲线，技术人员可容易地测定拷贝数。
[0087] 为了生成校准曲线，在同一板上分析已知拷贝数的与检测基因同一的合成RNA序 列的cDNA的稀释系列，如同分析那些相同基因的样品。通过比较样品的Ct值与校准曲线的 Ct值，可测定所分析样品中序列的精确拷贝数。通过关联样品Ct值与相同板上的校准曲线， 该方法"归一化"由于移液器不精确性的变化、测定组分表现（例如，酶、探针、引物、dNTP 等）、qPCR热循环仪仪器性能(例如，滤波器、温度，等)和其他可能发生的板间变化引起的测 定性能差异。
[0088] 在本文所提供的方法中，其表达水平用于计算相对表达水平的那些基因统一称为 "参考基因"。用于确定尿样品对微泡-衍生RNA的充分性的参考基因为通常存在于尿微泡中 的基因，例如管家基因或前列腺特异性基因。这些参考基因的表达水平用于将所检测信号 的量归一化以控制样品之间所分离微泡的量的变异性。例如，在本文所提供的方法中，用于 归一化PCA3和ERG表达的参考基因可为KLK3、编码前列腺特异性抗原的基因（PSA)或SPDEF。 参考基因可为前列腺特异性基因。在一些实施方案中，参考基因可为非组织特异性管家基 因，例如GATOH。在本文所提供的方法中，相对表达分析或归一化通过从对于PCA3和ERG所获 得的Ct值减去前列腺特异性标志基因（例如，KLK3)的Ct值完成，所得的结果称为A Ct。拷贝 数通过拟合下式的曲线 Ct = b + a*loglO(校准_拷贝数） 至板上的稀释系列上已知的校准点以得到"校准曲线"而计算。然后通过式： 样品_拷贝数=1〇~((以_样品-b)/a) 计算样品的拷贝数。
[0089] 拷贝数计算对于每个标志基因（例如PCA3和/或ERG)以及对于参考基因（例如KLK3 或SPDEF)独立进行。然后通过将基因标志拷贝数除以参考基因拷贝数（例如ERG/SPDEF、 ERG/KLK3、PCA3/SPDEF和ERG/SPDEF)实现标志基因（例如PCA3和/或ERG)的所得信号的"归 一化"。
[0090]在一些实施方案中，本公开内容的试剂盒和/或方法使用包含具有下列核酸序列 的至少一部分，例如，至少10个核苷酸、至少20个核苷酸、至少30个核苷酸、至少40个核苷 酸、至少50个核苷酸、至少100个核苷酸、至少150个核苷酸、至少200个核苷酸和/或至少250 个核苷酸或更多的KLK3 mRNA的参考基因：
在一些实施方案中，本公开内容的试剂盒和/或方法使用包含具有下列核酸序列的至 少一部分，例如，至少10个核苷酸、至少20个核苷酸、至少30个核苷酸、至少40个核苷酸、至 少50个核苷酸、至少100个核苷酸、至少150个核苷酸、至少200个核苷酸、至少250个核苷酸、 至少300个核苷酸、至少350个核苷酸、至少400个核苷酸、至少450个核苷酸和/或至少500个 核苷酸或更多核酸序列的SPDEF mRNA的参考基因：
PCA3和ERG的相对或归一化表达水平与参考基因也可使用各种本领域公认的技术中的 任一种进行分析和比较。例如，可对PCA3和ERG以及任选地至少一种其他生物标志物进行受 试者工作特征(R0C)分析，其中对于所测量的每个生物标志物所测量的生物标志物的表达 水平产生曲线下面积(AUC)值。生物标志物的R0C分析可逐个运行，即作为个体生物标志物， 或组合用于线性回归分析。具有高诊断价值的生物标志物的组合(作为如本文所述的具有 高诊断能力的生物标志物)具有大于0.5、0.6、0.7或0.8的衍生自R0C曲线的AUC值。优选地， 生物标志物或生物标志物的组合具有大于0.7的AUC值。例如，PCA3和ERG的组合产生大于 0.7的厶1](：值。
[0091] R0C曲线为一种广泛使用的用于评估生物标志物的识别和诊断能力的工具。当对 于一些观察，生物标志物值漏测时，由于样品大小减少仅基于完整情况的R0C分析失去有效 性，并且更为重要地，其常遭受潜在偏倚。因此，在生物标志物值漏测的情况下，应用估算方 法。
[0092]对于生物标志物的每个水平衍生自受试者工作特征（R0C)曲线的曲线下面积 (AUC)或通过生物标志物的组合创建的分数使用来自对照和疾病患者二者的生物标志物的 结果计算。通过考虑临床应用所必需的灵敏度、特异性、阴性预测值(NPV)、阳性预测值 (PPV)、阳性似然比(PLR)和阴性似然比(NLR)的截断值分析，本领域技术人员将容易地能够 最大化生物标志物水平或生物标志物组合的诊断准确度。
[0093] R0C曲线产生和样品群分析用于建立用于区分不同受试者亚群的截断值。例如，截 断值可区分具有高癌症复发风险与低癌症复发风险的受试者。在一些实施方案中，截断值 可区分具有癌症的受试者与无癌症的受试者。在一些实施方案中，截断值可区分具有非侵 袭性癌症与侵袭性癌症的受试者。在一些实施方案中，截断值可区分具有高Gleason分数 (例如，GS > 6)前列腺癌与低Gleason分数癌症的受试者。
[0094] 如本文所述，将从受试者尿样品测定的归一化的的PCA3和ERG的表达水平计算为 与截断值比较的输出值以区分受试者亚群。在一些实施方案中，归一化的PCA3和ERG的表达 水平使用KLK3作为参考基因测定，如下： ACtERG = CtERG ~ CtKLK3 ACtpCA3 = CtpCA3 ~ CtKLK3 然后将ERG和PCA3的ACt值应用到数学式中以产生输出值。产生输出值的实例公式如 下： 输出值=(ACtERG X 0.233) + (ACtpcA3 X 0.446) 在拷贝数的情况下，检验的输出值如下计算： 输出值=拷贝PCA3/拷贝KLK3鄉PDEF X C〇eff + 拷贝ERG/拷贝KLK3鄉PDEF X C〇eff， 其中系数可都相等，例如1 (一）。在其中系数相等的情况下，所有基因对输出值具有相 同的相对贡献。在一些实施方案中，对于每个标志基因系数不同，表明每个标志基因对输出 值并因此对阳性活组织检查的可能性具有不同的贡献。在一种方法中，系数可通过经由线 性回归将等式输出值=拷贝PCA3/拷贝KLK3鄉PDEF X C〇eff +拷贝ERG/拷贝KLK3鄉PDEF X C〇eff 拟合至现有数据集确定。
[0095]如本文所提供的实施例中显示的，PCA3和ERG的组合能够以77.8%的灵敏度和 61.8%的特异性明确区分活组织检查阴性和活组织检查阳性的受试者。这些值证明了本文 所公开的生物标志物基因组合作为癌症，例如前列腺癌的灵敏和特异性诊断生物标志物的 效力。
[0096]术语"受试者"意在包括显示或预期在尿中具有包含核酸的微泡和/或循环核酸的 所有动物。在具体的实施方案中，所述受试者为哺乳动物;例如，人类或非人灵长类、狗、猫、 马、牛或其他农场动物，或啮齿类(例如小鼠、大鼠、豚鼠等）。
[0097] 从尿样品中获得微泡部分 用于从尿样品中获得微泡部分的方法在本申请以及在科学出版物和专利申请(Chen等 人，2010; Miranda 等人，2010; Skog 等人，2008)中描述。还参见 WO 2009/100029、W0 2011/009104、W0 2011/031892和W0 2011/031877。这些出版物对于它们关于微泡分离或部 分获取的方法和技术的公开内容，通过引用结合到本文中。这些方法可包括，例如，通过检 测该部分内18S和28S RNA表达水平而评估所分离微泡部分的RNA完整性的步骤。
[0098]例如，通过差速离心获得微泡的方法在Raposo等人的论文(Raposo等人，1996)、 Skog等人(Skog等人，2008)的论文和Nilsson等人的论文(Nilsson等人，2009)中描述。阴 离子交换和/或凝胶渗透色谱的方法在美国专利号6，899，863和6，812，023中描述。蔗糖密 度梯度或细胞器电泳的方法在美国专利号7,198,923中描述。磁活化细胞分选(MACS)的方 法在Taylor和Gercel-Taylor的论文(Taylor和Gercel-Taylor，2008)中描述。纳米膜超滤 浓缩的方法在Cheruvanky等人的论文中（Cheruvanky等人，2007)描述。此外，微泡可通过 使用微流体平台以分离肿瘤衍生微泡的微芯片技术从受试者体液鉴定和分离(Chen等人， 2010)。对于这些方法的教导，前述各参考文献均通过引用结合到本文中。
[0099] 在本文所述方法的一个实施方案中，对于源自前列腺或肿瘤细胞的那些，富集从 尿中分离的微泡。由于微泡经常携带表面分子，例如来自其供体细胞的抗原，表面分子可用 于鉴定、分离和/或富集来自特异性的供体细胞类型的微泡（Al-Nedawi等人，2008; Taylor和Gercel-Taylor, 2008)。这样，可对源自不同细胞群的微泡的核酸内含物进行分 析。例如，肿瘤(恶性的和非恶性的)微泡携带肿瘤-相关表面抗原并且可经由这些特异性的 肿瘤-相关表面抗原进行检测、分离和/或富集。在一个实例中，表面抗原为上皮细胞黏附分 子(EpCAM)，其对来自肺、结肠直肠、乳腺、前列腺、头和颈部以及肝脏源而不是血液学细胞 源的癌的微泡特异(Balzar等人，1999; Went等人，2004)。
[0100] 另外，肿瘤特异性微泡可表征为缺乏表面标志，例如⑶80和⑶86。在这些情况下， 对于肿瘤特异性标志的进一步分析，具有标志，例如⑶80和⑶86的微泡可排除。排除可通过 各种方法实现，例如亲和力排除。
[0101] 从前列腺获得微泡部分可，例如，通过使用抗体、适体、适体类似物或对期需表面 抗原特异的分子印迹聚合物实现。在一些实施方案中，表面抗原对癌症类型特异。在一些实 施方案中，表面抗原对细胞类型(不一定是癌性)特异。
[0102] 基于细胞表面抗原的微泡分离方法的一个实例在美国专利号7,198,923中提供。 如，例如美国专利号5，840，867和5，582，981、W0/2003/050290及Johnson等人的出版物 (Johnson等人，2008)中所描述的，适体及其类似物特异性结合表面分子并且可用作用于 回收细胞类型特异性微泡的分离工具。分子印迹聚合物也特异性识别表面分子，如在，例如 美国专利号6,525，154、7,332,553和7,384,589以及8〇881等人的出版物（8〇88丨等人， 2007)中所描述的，并且为用于回收和分离细胞类型特异性微泡的工具。对于这些方法的教 导，前述各参考文献均结合到本文中。
[0103] 在本文所述的方法中，尿样品可通过一个或多个过滤或浓缩步骤预处理以去除细 胞碎片和其他非微泡物质。例如，尿样品可过滤通过〇 ? 8 um滤器。任选地，从0 ? 8 um滤器获 得的滤液可进一步过滤通过0.22 um滤器。为了分离尿微泡，然后使用过滤浓缩步骤浓缩预 处理的样品。该步骤包括使用具有分子截留以保留和浓缩直径大于10 nm的微泡的滤器。例 如，然后将样品浓缩至小于1 mL，优选地100-200 yL的体积。例如，分子量截留为至少100 kDa。优选地，分子量截留为100 kDa。
[0104] 从微泡提取核酸 用于核酸提取的方法一般基于本领域所熟知的程序。技术人员将选择一种适合具体生 物样品的具体提取程序。提取程序的实例在专利出版物WO 2009/100029、US 201/ 00196426、US 2011/0003704、US 2011/0053157、W0 2011/009104和TO 2011/031892中提 供。这些出版物对于其关于微泡核酸提取方法和技术的公开内容，通过引用结合到本文中。
[0105] 在本文所述的方法中，为了防止提取后不期需的核酸降解的目的，在微泡分离和 纯化后但在微泡裂解和核酸提取之前向样品中加入RNA酶抑制剂。微泡在RNA酶抑制剂的存 在下裂解。然后在本领域所已知的使得微泡RNA与柱结合的条件下将裂解物加入RNA-结合 柱中。任选地，洗涤柱以增加RNA的品质和收率。然后在本领域所已知的使得高品质RNA被收 集的条件下洗脱RNA。
[0106] 在一些实施方案中，所提取核酸的品质可通过检测18S和28S核糖体RNA并测定比 率评估。18S: 28S rRNA的比率优选为约1:1-约1:2;更优选地约1:2。
[0107] 在一些实施方案中，核酸可从尿样品中提取而不分离或纯化微泡部分。
[0108] 核酸生物标志物的检测 生物标志物检测可以以许多不同方式对提取的核酸进行，并构成许多方面。在一些实 施方案中，从一个或多个尿样品检测核酸生物标志物是为了获得所有或部分提取核酸的概 况。
[0109] 本文所使用的术语概况(prof i 1 e)是指核酸收集物的具体特征的表现，其可通过 微泡或从受试者尿样品分离的微泡部分所包含的一种或多种核酸的定量或定性分析测定。 在此将参考概况定义为从独立受试者或一群受试者，或从不同时间点的相同受试者获得的 概况。
[0110] 微泡中的核酸可为一种或多种类型的核酸，其实例在本文中提供。
[0111] 核酸可为RNA ANA可为编码RNA，例如，可编码蛋白质的信使RNA ANA也可为非编码 RNA (ncRNA)，例如，核糖体RNA、转运RNA、微小RNA和可源自基因组DNA的其他非编码转录 物。这些非编码RNA转录物可包括从卫星重复转录的转录物和可为DNA转座子或反转录转座 子的转座子。优选地，核酸为mRNA。
[0112] 核酸可为DNA ANA可为从RNA反转录的单链DNA，例如，cDNA。反转录通常由细胞中 的反转录酶基因编码的反转录酶介导。DNA也可为DNA复制期间产生的单链DNA。当细胞分裂 时基因组DNA在细胞核中复制。一些复制的DNA可脱离其模板，输出细胞核，并包装入微泡 中。DNA可进一步为双链DNA的片段。
[0113] 另外，DNA可为非编码DNA (ncDNA)。人类基因组仅包含约20,000个蛋白质编码基 因，代表小于2%的基因组。非编码与蛋白质编码DNA序列的比率随着发育复杂性的变化而增 加(Mattick，2004)。原核生物具有小于25%的ncDNA，简单的真核生物具有25-50%，更复杂 的多细胞生物如植物和动物具有超过50%的ncDNA，而人类具有约98.5%的ncDNA (Mattick， 2004)〇
[0114] 来自基因组的一些ncDNA转录为ncRNA AcRNA涉及细胞中的许多重要过程，例如， 酶(核酶)与蛋白质(适体)特异性结合以及在转录和转录后水平二者调苄基因活性。
[0115] 核酸的概况可通过根据本领域标准方案分析从分离的微泡获得的核酸获得。例 如，DNA的分析可通过本领域已知的一种或多种不同方法进行，包括用于测定提取物中的核 酸种类的微阵列分析、用于测量基因表达水平的定量PCR、用于检测基因突变的DNA测序和 用于检测基因甲基化模式的亚硫酸氢盐甲基化测定。
[0116] 在某些情况下，为了获得概况，可进行数据分析。这种数据分析可例如，通过聚类 分析、主要成分分析、线性判别分析、受试者工作特征曲线分析、二元分析、Cox比例风险分 析（Cox Proportional Hazards Analysis)、支持向量机（Support Vector Machine)和递 归特征消除（SVM-RFE)、近质心分类（Classification to Nearest Centroid)、循证分析 (Evidence-based Analysis)或任何前述分析技术的组合进行。
[0117] 对于另一个实例，RNA的分析可使用数字基因表达(DGE)分析方法进行(Lipson等 人，2009)。对于RNA分析的又一个实例，可将RNA消化并转化为单链cDNA，单链cDNA可然后 在DNA测序机器，例如，如Ting等人的出版物（Ting等人，2011)中所描述的来自Helicos BioSciences的HeliScope?单分子测序仪上经受测序分析。
[0118] 在其他情况下，RNA可在进一步扩增前反转录为互补DNA (cDNA)。这种反转录可单 独或与扩增步骤组合进行。组合反转录和扩增步骤的方法的一个实例为反转录聚合酶链反 应(RT-PCR)，其可进一步改进为定量的，例如，如美国专利号5,639,606中所描述的定量RT-PCR，所述专利通过引用结合到本文中用于该教导。该方法的另一个实例包括两个分开的步 骤:第一个反转录步骤以使RNA转换为cDNA和第二个使用定量PCR定量cDNA的量的步骤。
[0119] 核酸扩增方法包括，但不限于，聚合酶链反应(PCR)(美国专利号5，219，727)和其 变体例如原位聚合酶链反应(美国专利号5,538，871)、定量聚合酶链反应(美国专利号5， 219,727)、巢式聚合酶链反应(美国专利号5,556,773)、自主序列复制及其变体(6皿仏111 等人，1990)、转录扩增系统及其变体(Kwoh等人，1989)、Qb复制酶及其变体(Miele等人， 1983)、cold-PCR (Li等人，2008)、BEAMing (Li等人，2006)或任何其他核酸扩增方法，随 后使用本领域技术人员所熟知的技术检测扩增分子。如果这些分子以非常低的数目存在， 特别有用的为那些为检测核酸分子设计的检测方案。前述参考文献结合到本文中，用于其 对这些方法的教导。
[0120] 在一些实施方案中，不进行核酸扩增步骤。未扩增的核酸可通过定量PCR (RT-PCR)分析，或例如通过下一代测序或nanostring技术直接分析。
[0121 ]所分离微泡中存在的核酸的分析可为定量的和/或定性的。对于定量分析，用本领 域已知的和本文所述的方法测量所分离微泡内的特异性目的核酸的表达水平，相对的或绝 对的表达水平。对于定性分析，用本领域已知的方法鉴定所分离微泡内的目的核酸的种类， 无论是野生型还是变体。
[0122]在一些实施方案中，核酸生物标志物的检测涉及检测一种或一批基因畸变的存在 或不存在。术语"基因畸变"在本文中用于指包含核酸的微泡内核酸的量以及核酸变体。特 别地，基因畸变包括，但不限于，一个基因（例如，致癌基因）或一组基因的过表达、一个基因 (例如，肿瘤抑制基因例如P53或RB)或一组基因的低表达、一个基因或一组基因的剪接变体 的选择性产生、基因拷贝数变体(CNV)(例如，DNA双微体）（Hahn，1993)、核酸修饰(例如， 甲基化、乙酰化和磷酸化）、单核苷酸多态性(SNPs)(例如，Alu元件中的多态性）、染色体重 排(例如，倒置、缺失和重复)和一个基因或一组基因的突变(插入、缺失、重复、错义、无义、 同义或任何其他核苷酸变化），这些突变，在许多情况下，最终影响基因产物的活性和功能， 导致选择性转录剪接变体和/或基因表达水平的改变，或任何前述的组合。
[0123] 基因畸变可存在于许多类型的核酸中。这种基因畸变的测定可通过技术人员已知 的多种技术进行。例如，核酸的表达水平、选择性剪接变体、染色体重排和基因拷贝数可通 过微阵列分析(参见，例如，美国专利号6,913,879、7,364,848、7,378,245、6,893,837和6， 004,755)和定量?0?测定。拷贝数变化可例如，用111111^的111行1^1111111全基因组基因分型 测定或Agilent人基因组CGH微阵列（Steemers等人，2006)检测。
[0124] 核酸修饰可通过，例如，美国专利号7，186，512和专利出版物W0/2003/023065中描 述的方法测定。甲基化概况可，例如，通过Illumina DNA Methylation 0MA003 Cancer Panel测定。
[0125] SNP和突变可通过以下检测：与等位基因特异性探针杂交、酶突变检测、错配异源 双链体的化学切割(Cotton等人，1988)、配错碱基的核糖核酸酶切割(Myers等人，1985)、 质谱分析法(美国专利号6,994,960、7,074,563和7，198,893)、核酸测序、单链构象多态性 (SSCP) (Orita等人，1989)、变性梯度凝胶电泳（DGGE) (Fischer和Lerman, 1979a; Fischer和Lerman, 1979b)、温度梯度凝胶电泳（TGGE) (Fischer和Lerman, 1979a; Fischer和Lerman, 1979b)、限制性片段长度多态性（RFLP) (Kan和Dozy, 1978a; Kan和 Dozy，1978b)、寡核苷酸连接测定（OLA)、等位基因特异性PCR (ASPCR)(美国专利号5， 639,611)、连接链反应（LCR)及其变体（Abravaya等人，1995; Landegren等人，1988; Nakazawa等人，1994)、流式细胞异源双链体分析(W0/2006/113590)及其组合/改良。
[0126] 在一些实施方案中，突变的检测通过使用仅消化生物标志物的一种变体而不消化 生物标志物的其他变体的限制酶进行。如本领域已知的，限制酶忠实地识别多核苷酸的特 定段并且该多核苷酸段中的一个或多个核苷酸的变化将很有可能使该多核苷酸不能被酶 识别和消化。正因如此，可通过消化掉一些或所有其他可被酶识别的变体而帮助检测生物 标志物的一种变体。待检测的变体可为野生型变体或突变体变体。
[0127] 基因表达水平可通过基因表达系列分析(SAGE)技术(Velculescu等人，1995)、定 量PCR、定量反转录PCR、微阵列分析和下一代DNA测序测定，如本领域所已知的。
[0128] -般而言，用于分析基因畸变的方法在许多出版物中报道，不限于本文引用的那 些，并且可为技术人员获得。适当的分析方法将取决于分析的具体目标、患者的病况/病史 和待检测、监测或治疗的具体癌症、疾病或其他医疗病况。
[0129] 与疾病或其他医疗病况相关的生物标志物 许多生物标志物可与受试者中疾病或其他医疗病况的存在或不存在情况有关。因此， 根据本文公开的方法，在自分离的微泡的核酸提取中检测这样的生物标志物的存在或不存 在情况可帮助诊断、预后或监测受试者中疾病或其他医疗病况的进展或复发。
[0130] ERG，如本文所使用的，指也称为v-ets成红细胞增多症病毒E26癌基因同源物的基 因和任何鉴定的同种型。例如，ERG同种型包括ERG1、ERG2、ERG3、ERG4、ERG5、ERG6、ERG7、 ERG8和ERGLERG也可指ERG前列腺癌特异性同种型1 (EPC1)和ERG前列腺癌特异性同种型2 (EPC2) ARG或任何一种ERG同种型可用作前列腺癌的生物标志物。
[0131] 如本文所使用的PCA3也指还称为DD3的基因和任何鉴定的同种型，并可用作前列 腺癌的生物标志物。
[0132] 还发现许多生物标志物影响对特定患者的治疗选择。根据本文公开的方法，在自 分离的微泡的核酸提取中检测这样的生物标志物的存在或不存在情况可帮助给定患者中 的治疗选择。
[0133] 患者亚群 本发明提供检测受试者尿样品中的一种或多种生物标志物的方法以帮助疾病，例如， 癌症，特别是侵袭性癌症的诊断、预后、监测或治疗选择。
[0134] 从其分离微泡的个体的选择由技术人员基于多种因素中的一个或多个的分析进 行。要考虑的这种因素为受试者是否具有特定疾病(例如，癌症)的家族史、是否具有这种疾 病的遗传倾向、是否具有这种疾病的增加的风险、是否具有指示某种倾向的身体症状或环 境原因。环境原因包括生活方式、暴露于引起或促成疾病的媒介物例如空气、土地、水或饮 食。选择个体用于进行本文所公开方法的其他原因包括疾病的既往史、治疗前或治疗后目 前正诊断为该疾病、当前正治疗该疾病(处于治疗中）或处于疾病减轻或恢复中。
[0135] 用本发明方法诊断、监测或其他方式评估的癌症可为任何种类的癌症或癌前病 况。这包括，但不限于，上皮细胞癌例如肺癌、卵巢癌、宫颈癌、子宫内膜癌、乳腺癌、脑癌、结 肠癌和前列腺癌。还包括胃肠癌、头和颈部癌、非小细胞肺癌、神经系统癌、视网膜癌、皮肤 癌、肝癌、胰腺癌、肾癌、生殖器癌及膀胱癌、黑色素瘤和白血病。另外，本发明的方法和组合 同样可适用于个体非恶性肿瘤（例如，纤维神经瘤、脑膜瘤和神经鞘瘤）的检测、诊断和预 后。癌症可为任何侵袭性癌症。在一些实施方案中，癌症为泌尿生殖器癌，例如前列腺癌、膀 胱癌、肾癌和已扩散至泌尿生殖道的转移性癌症。
[0136] 本发明提供在不同患者亚群中具有显著诊断和预后价值的生物标志物。所述患者 患有癌症，例如，前列腺癌。在一些实施方案中，所述一种或多种生物标志物在已经经受根 治性前列腺切除术的患者中检测。在一些实施方案中，所述一种或多种生物标志物在已指 定具体Gleason分数的患者中检测。在一些实施方案中，所述一种或多种生物标志物在表达 ERG的患者或其癌症经测定受ERG表达驱动的患者中检测。这些患者在本文中称为"ERG表达 者(Expr esser)'ERG的存在或ERG表达超过某个预定阈值决定受ERG表达驱动的癌症。在一 些实施方案中，所述一种或多种生物标志物在不表达ERG的患者或其癌症经测定不受ERG表 达驱动的患者中进行检测。这些患者在本文中称为"ERG非表达者"。
[0137] Gleason分级系统通常在本领域用作前列腺癌预后参数，经常与其他预后因素或 检验组合使用。前列腺活组织检查样品例如，通过显微镜检查，并且Gleason分数通过病理 学家基于前列腺肿瘤的架构模式确定。Gleason分数基于正常腺组织架构（即腺体的形状、 大小和分化)的丧失程度。样品被赋予最常见肿瘤模式的一个级别和下一最常见肿瘤模式 的第二个级别。可存在可鉴定的主要或最常见模式，然后次要或第二最常见模式;或者，可 仅存在单个级别。Gleason模式与下列特征相关： 模式1-癌性前列腺与正常前列腺组织极为相似。腺体小、良好成形，并且紧密堆积。
[0138] 模式2-组织仍具有良好成形的腺体，但是它们较大并且其间具有较多组织。
[0139] 模式3-组织仍具有可识别的腺体，但细胞较暗。在高放大倍数下，这些细胞中的一 些已离开腺体并开始侵入周围组织。
[0140] 模式4-组织几乎无可识别的腺体。许多细胞正在侵入周围组织。
[0141] 模式5-组织不具有可识别的腺体。往往仅有细胞片层遍及整个周围组织。
[0142] 将两个级别加在一起以得到Gleason分数，也称为Gleason总和。2-4分为非常低的 癌症侵袭标度。5-6分为轻微侵袭的。7分表明癌症为中等侵袭的。8-10分表明癌症为高度侵 袭的。
[0143] 对于其他癌症，例如膀胱癌或肾癌，将非侵袭性癌症与侵袭性癌症分层的其他分 级系统为本领域所知。 实施例
[0144] 实施例1:材料和方法: 引物/探针序列：用于检测尿生物标志物群的试剂盒和方法使用以下引物/探针序列。 下列缩略语用于下表1中：来自Integrated DNA Technologies的探针指定为"IDT"、5'-FAM 指5 '报告染料、"3IABkFQ"指3 ' -IowaBlack猝灭剂和"ZEN"指来自IDT的序列内ZEN ?猝灭 剂。
[0145] 表1.引物/探针序列
实施例2:患者群7样品制备 患者群样品用于鉴定生物标志物，其可用于自从尿-衍生微泡提取的核酸检测前列腺 癌。258个受试者的患者群，本实施例中称为"群7"，参加了该研究。258个受试者中，196个接 受他们的第一次活组织检查，并且59个接受重复活组织检查。初次活组织检查患者中，87个 具有阳性活组织检查结果，109个具有阴性活组织检查结果。重复活组织检查的患者中，15 个具有阳性活组织检查结果，44个具有阴性活组织检查结果。
[0146] 尿样品体积为20-100 mL。患者尿样品的初始体积分布如下：样品体积(V)等于20 mL (即V = 20 mL)，21%的患者（n=55);样品体积大于20 mL但小于或等于40 mL (即20 mL 〈V彡40 mL)，27%的患者(n=70);或样品体积大于40 mL (即V > 40 mL)，52%的患者(n= 133)〇
[0147] 如图1A和1B所描绘的分析群7的尿样品。例如，收集尿样品并过滤通过0.8 wii滤器 以分离细胞与微泡中的其他细胞碎片，并将微泡-富集的部分冷冻在-80 °C。将每一样品的 第一个等分试样（S1)进一步处理。额外的处理步骤可包括离心、通过过滤浓缩器浓缩、1-2 个洗涤步骤和/或加入RNA酶抑制剂。任选地，可在微泡分离或核酸提取之前向样品中加入 对照颗粒，例如Q-0颗粒，以测定分离或核酸提取的品质。例如，由于Q-0对照失效，18个受试 者从研究中移除。
[0148] 特别地，首先过滤尿样品，并将滤液丢弃。Q-0对照以合适的浓度(例如，100拷贝） 加入过滤尿样品的等分试样(例如，15 mL)中。然后通过过滤浓缩器处理等分试样，并将滤 液丢弃。保留物用过滤尿样品的第二个等分试样(例如，5 mL过滤尿)重悬并通过过滤浓缩 器处理。然后将保留物至少洗涤一次(例如两次），并在过滤浓缩器中重新旋转。向位于过滤 浓缩器上室的保留物中加入RNA酶抑制剂，并在室温下孵育，例如2-3分钟。然后直接向样品 中加入裂解缓冲液并孵育1分钟。然后将裂解物转移至到另一个容器中以继续核酸提取。
[0149] 然后样品使用本领域熟知的方法和适于产生高品质RNA的条件经受核酸提取。通 过BioAnalyzer Profile分析 12 yl提取的RNA。将提取的RNA反转录为cDNA (SUPERSCRIPT ? VILO cDNA Synthesis Kit, Life Technologies)。在cDNA样品上进行定量实时PCR以 测定PCA3、ERG、KLK3和郎（每基因2 yl)的基因表达。每一qPCR板上均存在校准标准曲线。
[0150] 引物和探针序列可参见表1。
[0151] 实施例3: PCA3和ERG基因表达分析 多重分析使用来自qPCR实验的基因表达结果进行。R0C曲线基于相对于归一化基因 KLK3的ACt或拷贝数产生。估算可用于获得漏测值。PCA3的R0C分析，使用KLK3作为归一化 基因，产生0.727的AUC值（图3) WCA3和ERG的R0C曲线分析产生增加的AUC值0.756 (图4)。 在其他实验中，使用的归一化基因为SPDEF (图13)，并且使用SPDEF归一化的分析所产生的 AUC值显示KLK3和SH)EF表现相当。
[0152] 对于每个样品，PCA3和ERG基因表达的模型或输出值也使用下式计算，其从不同的 患者群(群5)的数据分析确定： 模型值=(ACtERG x 0.233) + (ACtpCA3 x 0.446) 其中 ACtERG = CtERG - CtKLK3; ACtpCA3 = CtpCA3 - CtKLK3 选择模型截断值，例如，本实施例中使用的截断值为4.7，并且通过2x2分析和Gleason 分析测定使用PCA3和ERG的组合与截断模型值4.7的诊断准确度(图10)。
[0153] 对于群7的每个样品体积亚群，使用PCA3和ERG基因表达的2x2分析结果在表2a、3a 和4a中概括。对于鉴定已通过活组织检查鉴定为阳性的样品中的前列腺癌，PCA3和ERG的组 合灵敏度大于84%。特别地，数据证明20 mL的尿样品体积产生更好的诊断准确度，具有 83.6%的灵敏度和58.7%的特异性。该方法还具有79.4%的高阴性预测值和53.4%的阳性预测 值。
[01 M] 进一步分析包括通过其Gleason分数，如表2b、3b和4b所示，以及四分位数分析，如 表2d、2e、3d、3e、4d和4e所示对样品分层。特别地，具有Gleason分数6或更高的患者的样品 正确地鉴定了 70%的样品。
[0155] 实施例4:包含PCA3的三基因模型 多变量分析使用包含PCA3的基因集进行。如图15中所示，包含PCA3的模型（即，PCA3和 ERG与额外的基因，例如AMACR、BIRC5、H0XC6和SPARCL1)始终胜过不包含PCA3的FT0三基因 模型。使用的参考基因可为KLK3或SPDEF，如图15中通过使用任一基因归一化的一致的AUC 值所示。
[0156] 三基因模型还显示当使用小体积样品（即20 mL)时与所有样品相比具有改善的 AUC值（图 15)。
[0157] 实施例5:最佳尿样品体积 患者群7的尿样品为20-100 mL。群7中具有20 mL或更小、40 mL或更小但大于20 mL和 大于40 mL体积的样品分布在图1中不出。
[0158] 如实施例1和2中所述分离微泡、提取RNA和测定生物标志基因表达。群7中生物标 志物（即，PCA3、ERG)的生物统计学分析通过基于群中所有样品的拷贝数和KLK3归一化基因 表达产生AUC和R0C图进行。图3显示从PCA3表达分析产生的AUC高度依赖样品体积。例如，产 生大于0.7的AUC的样品来自样品体积小于40 mL的样品。相反地，产生0.60-0.65范围的AUC 的样品具有40 mL或更大的样品体积。图12显示每个指定基因（PCA3、ERG、AMACR、BIRC5、 H0XC6、SPARCL1和SPDEF)的单变量分析和与对于所有样品产生的AUC相比对于20 mL或更少 的样品产生的AUC。这些结果显示20 mL或更少的样品导致增加的AUC值，表明单基因的诊断 能力在小体积尿样品中增加。STOEF为用于归一化的参考基因，因此，对于较小样品体积AUC 值没有提尚。
[0159] 生物标志物表达的拷贝数而非Ct值的分析也显示当与所有样品比较时，具有较小 体积(20 mL)的样品产生提高的AUC值(图13)。
[0160] 实施例6:患者样品评分及其统计验证 在本文所述的研究中，若满足下列标准则使用样品：（i)仅第一次活组织检查；（ii) 患者年龄彡50岁；（iii) PSA"灰区"水平在2-10 ng/mL的范围内；和（iv)尿供给体积在 20-49 mL之间。选择PSA灰区中的患者样品，因为具有高PSA水平的患者将几乎总是进行活 组织检查，并且具有低PSA水平的患者由于其他非PSA驱动的原因通常仅推荐进行活组织检 查。
[0161] 根据实验室开发的检验(LDT)分数(本文称为EX0106分数)使用下列算法：
为患者样品评分，其中拷贝数对于每个基因使用板上校准曲线用RGQ软件(Qiagen)计 算，并且其中截断值为10。小于10的EX0106分数为与低前列腺癌风险关联的分数。大于或等 于10的EX0106分数为与较高前列腺癌风险关联的分数。
[0162] 应注意的是，分数通过乘以1.83按比例调节并通过加上16.92补偿以将EX0106分 数转换为更吸引人和易读的范围。然而，这种按比例调节和补偿对检验的表现无影响。 EX0106分数的转换将大部分数据置于0-30的范围，但任一端的分数均无上限（即，个体样品 可评分落在该范围外）。配置EX0106分数的算法以致截断为10时EX0106分数的阴性预测值 (NPV)大于前列腺癌预防性试验风险计算表(PCPTRC)的NPV，其中选择NPV pcptrc截断值以致 其将至少30%的患者预测为阴性。EX0106分数的算法还设计为使得预测为阴性（即EX0106分 数小于10)的患者部分为至少30%。
[0163] 本文中称为群8 (即C8，n = 453个样品，PSA中值=5.3 ng/mL，并且80%的样品2〈 PSA〈 10 ng/mL)的患者群中的示例性EX0106分数分布在图16中示出。具有任何Gleason分 数的患者的EX0106表现的AUC与护理标准(S0C)疗法的AUC的比较在图17中示出，其中S0C的 AUC = 0.595;EX0106 的 AUC = 0.738;并且 EX0106 + SOC 的 AUC = 0.764。图 17 中使用的患 者群具有下列特征:所有样品均在PSA灰区，仅来自第一次活组织检查，并且来自小体积尿 样品。依据四分位数，即按照EX0106分数四分位数通过活组织检查鉴定为阳性的样品百分 数的EX0106表现在图18A和18B中示出。再次，这些样品来自具有任何G1 eason分数的患者。
[0164] EX0106分数对于高级别前列腺癌，例如，大于6的Gleason分数的表现在图19中示 出，并且基于Gleason分数亚群的EX0106分数表现的统计分析在图20中示出。
[0165] 因此，EX0106分数可用于确定高级别前列腺疾病，例如，具有大于6的Gleason分数 的疾病的预测。通常，来自首次活组织检查和来自重复活组织检查群体的样品是十分不同 的，并且应该分别分析。
[0166] 虽然本发明已经参考某些实施方案公开，但是不脱离如上文和所附权利要求中所 述的本发明精神和范围的所述实施方案的许多修饰、变更和变化是可能的。因此，本发明意 在不限于具体描述的实施方案，而是被赋予在法律之下享有的全部范围。
[0167] 表2a?群7 2x2分析(V 彡 100 mL, N = 236)
表2b.群7 Gleason分数分析(V 彡 100 mL, N = 236)
表2c.群7分析（V 彡 100 mL, N = 236)
表2d?群7四分位数分析(V彡100 mL，N = 236)
表2e?群7四分位数分析(V彡100 mL，N = 236)
表3a?群7 2x2分析(V 彡 40 mL, N = 189)
表3b.群7 Gleason分数分析(V < 40 mL, N = 189)
表3c.群7分析(V 彡 40 mL, N = 189)
表3d?群7四分位数分析(V彡40 mL，N = 189)
表3e?群7四分位数分析(V彡40 mL，N = 189)
表4a?群7 2x2分析(V 彡 20 mL, N = 122)
表4b?群7 Gleason分数分析(V 彡 20 mL, N = 122)
表4c.群7分析(V < 20 mL，N = 122)_
表4d.群7四分位数分析（V < 20 mL，N = 122)
表4e.群7四分位数分析(V < 20 mL，N = 122)
参考文献 Al-Nedawi， K.， B. Meehan， J. Micallef， V. Lhotak， L. May， A. Guha和J. Rak. 2008. Intercellular transfer of the oncogenic receptor EGFRvIII by microvesicles derived from tumour cells (致癌受体EGFRvIII通过肿瘤细胞衍生的微 泡的胞间转移）.Nat Cell Biol. 10:619-24. Balzar， M.， M.J. Winter， C.J. de Boer和S.V. Litvinov. 1999. The biology of the 17-1A antigen (Ep-CAM) (17-1A抗原的生物学）? J Mol MecL 77:699-712. Bossi，A., F. Bonini，A.P. Turner和S.A. Piletsky. 2007. Molecularly imprinted polymers for the recognition of proteins: the state of the art (用 于蛋白质识别的分子印迹聚合物:技术现状）.Biosens Bioelectron. 22:1131-7. Bussemakers， M.J., A. van Bokhoven, G.ff. Verhaegh, F.P. Smit， H.F. Karthaus， J.A. Schalken， F.M. Debruyne， N. Ru和W.B. Isaacs. 1999. DD3: a new prostate-specific gene, highly overexpressed in prostate cancer (DD3:-种新的 前列腺特异性基因，在前列腺癌中高度过表达）.Cancer Res. 59:5975-9. Chen, C., J. Skog， C.H. Hsu, R.T. Lessard， L. Balaj, T. ffurdinger, B.S. Carter, X.O. Breakefield, M. Toner和D. Irimia. 2010. Microfluidic isolation and transcriptome analysis of serum microvesicles (血清微泡的微流体分离和转录 组分析）.Lab Chip. 10:505-11. Cheruvanky, A., H. Zhou, T. Pisitkun， J.B. Kopp， M.A. Knepper， P.S. Yuen 和R.A. Star. 2007. Rapid isolation of urinary exosomal biomarkers using a nanomembrane ultrafiltration concentrator (使用纳米膜超滤浓缩器快速分离尿体外 生物标志物）.細】？1^81〇11^紐1?1^81〇1.292屮1657-61. Cotton， R.G.， N.R. Rodrigues和R.D. Campbell. 1988. Reactivity of cytosine and thymine in single-base-pair mismatches with hydroxylamine and osmium tetroxide and its application to the study of mutations (单喊基对错配中胞喃啶 和胸腺嘧啶与羟胺和四氧化锇的反应性及其在突变研究中的应用）.Proc Natl Acad Sci USA. 85:4397-401. Cowell, J.K?和K.C. Lo. 2009. Application of oligonucleotides arrays for coincident comparative genomic hybridization, ploidy status and loss of heterozygosity studies in human cancers (寡核苷酸阵列在人类癌症中一致性比较基 因组杂交、倍性状态和杂合性缺失的研究中的应用）.Methods Mol Biol. 556:47-65. Deras, I.L., S.M. Aubin, A. Blase, J.R. Day, S. Koo, A.ff. Partin, ff.J. Ellis， L.S. Marks， Y. Fradet， H. Rittenhouse和J. Groskopf. 2008. PCA3: a molecular urine assay for predicting prostate biopsy outcome (PCA3:-种用于预 测前列腺活组织检查结果的分子尿测定）.J Urol. 179:1587-92. Furusato， B., C.L. Gao, L. Ravindranath， Y. Chen, J. Cullen, D.G. McLeod, A. Dobi， S. Srivastava, G. Petrovics和I?A. Sesterhenn. 2008. Mapping of TMPRSS2-ERG fusions in the context of multi-focal prostate cancer (TMPRSS2-ERG融合物在多病灶性前列腺癌背景下的作图）.Mod Pathol. 21:67-75. Guatelli， J.C.， K.M. Whitfield， D.Y. Kwoh， K.J. Barringer， D.D. Richman和 T.R. Gingeras. 1990.1 sothermal, in vitro amplification of nucleic acids by a multienzyme reaction modeled after retroviral replication (通过逆车专录病毒复制 后模仿的多酶反应，等温体外扩增核酸）.Proc Natl Acad Sci U S A. 87:1874-8. Hahn, P.J. 1993. Molecular biology of double-minute chromosomes (双微染色 体的分子生物学）.Bioessays. 15:477-84. Hessels， D.， F.P. Smit， G.W. Verhaegh， J.A. Witjes， E.B. Cornel和J.A. Schalken. 2007. Detection of TMPRSS2-ERG fusion transcripts and prostate cancer antigen 3 in urinary sediments may improve diagnosis of prostate cancer (检测尿沉渣中TMPRSS2-ERG融合转录物和前列腺癌抗原3可改善前列腺癌的途 断）? Clin Cancer Res. 13:5103-8. Johnson, S., D. Evans, S. Laurenson， D. Paul, A.G. Davies, P.K. Ferrigno 和C. ffalti. 2008. Surface-immobilized peptide aptamers as probe molecules for protein detection (表面固定化肽适体作为用于蛋白质检测的探针分子）.Anal Chem. 80:978-83. Kwoh， D.Y.， G.R. Davis， K.M. Whitfield， H.L. Chappelle， L.J. DiMichele和 T.R. Gingeras. 1989. Transcription-based amplification system and detection of amplified human immunodeficiency virus type 1 with a bead-based sandwich hybridization format (基于转录的扩增系统和用基于小珠的夹心杂交模式检测扩增的1 型人免疫缺陷病毒）.Proc Natl Acad Sci U S A. 86:1173-7. Laxman, B., D.S. Morris, J. Yu， J. Siddiqui， J. Cao， R. Mehra， R.J. Lonigro， A. Tsodikov, J.T. Wei, S.A. Tomlins和A.M. Chinnaiyan. 2008. A first-generation multiplex biomarker analysis of urine for the early detection of prostate cancer (用于前列腺癌早期检测的第一代尿多重生物标志物分析）.Cancer Res. 68:645-9. Laxman, B., S.A. Tomlins, R. Mehra， D.S. Morris, L. Wang， B.E. Helgeson， R.B. Shah， M.A. Rubin， J.T. Wei和A.M. Chinnaiyan. 2006. Noninvasive detection of TMPRSS2:ERG fusion transcripts in the urine of men with prostate cancer (患前列腺癌男性尿中TMPRSS2:ERG融合转录物的无创检测）.Neoplasia. 8:885-8. Li， J., L. Wang， H. Mamon， M.H. Kulke， R. Berbeco和G.M. Makrigiorgos. 2008. Replacing PCR with COLD-PCR enriches variant DNA sequences and redefines the sensitivity of genetic testing (用COLD-PCR替代PCR富集变体DNA序 列并重新定义基因检测的灵敏度）.Nat Med. 14:579-84. Lipson，D., T. Raz，A. Kieu，D.R. Jones, E. Giladi，E. Thayer, J.F. Thompson, S. Letovsky, P. Milos和M. Causey. 2009. Quantification of the yeast transcriptome by single-molecule sequencing (通过单分子测序定量酵母转录组）. Nat Biotechnol. 27:652-8. Mattick，J.S. 2004. RNA regulation: a new genetics? (RNA调控：一种新的遗传 学）Nat Rev Genet. 5:316-23. Miele， E.A., D.R. Mills和F.R. Kramer. 1983. Autocatalytic replication of a recombinant RNA (重组RNA的自催化复制）? J Mol Biol. 171:281-95. Myers, R.M., Z. Larin和T. Maniatis. 1985. Detection of single base substitutions by ribonuclease cleavage at mismatches in RNA:DNA duplexes (通 过配错处核糖核酸酶切割检测在RNA:DNA双链体中的单碱基置换）.Science. 230:1242- 6. Nguyen, P.N., P. Violette, S. Chan, S. Tanguay, ff. Kassouf， A. Aprikian和 J.Z. Chen. 2011. A panel of TMPRSS2:ERG fusion transcript markers for urine-based prostate cancer detection with high specificity and sensitivity (具有高 特异性和灵敏度的用于基于尿的前列腺癌检测的一组TMPRSS2:ERG融合转录物标志）.Eur Urol. 59:407-14. Nilsson, J., J. Skog， A. Nordstrand， V. Baranov, L. Mincheva-Nilsson， X.O. Breakefield和A. Widmark. 2009. Prostate cancer-derived urine exosomes: a novel approach to biomarkers for prostate cancer (前列腺癌衍生的尿外来体：前列 腺癌生物标志物的新方法）? Br J Cancer. 100:1603-7. Orita， M., H. Iwahana, H. Kanazawa, K. Hayashi和T. Sekiya. 1989. Detection of polymorphisms of human DNA by gel electrophoresis as single- strand conformation polymorphisms (通过凝胶电泳检测人DNA多态性作为单链构象多 态性）? Proc Natl Acad Sci U S A. 86:2766-70. Orozco, A.F?和D.E. Lewis. 2010. Flow cytometric analysis of circulating microparticles in plasma (血楽中循环微粒的流式细胞分析）? Cytometry A. 77:502-14. Palanisamy, N., B. Ateeq， S. Kalyana-Sundaram， D. Pflueger， K. Ramnarayanan， S. Shankar, B. Han, Q. Cao， X. Cao， K. Suleman， C. Kumar-Sinha， S. M. Dhanasekaran， Y.B. Chen, R. Esgueva, S. Banerjee， C.J. LaFargue， J. Siddiqui， F. Demichelis， P. Moeller, T.A. Bismar， R. Kuefer， D.R. Fullen， T. M. Johnson, J.K. Greenson， T.J. Giordano, P. Tan, S.A. Tomlins, S. Varambally, M.A. Rubin, C.A. Maher和A.M. Chinnaiyan. 2010. Rearrangements of the RAF kinase pathway in prostate cancer, gastric cancer and melanoma (前列 腺癌、胃癌和黑色素瘤中RAF激酶通路的重排）.Nat Med. 16:793-8. Petrovics, G., A. Liu, S. Shaheduzzaman， B. Furusato， C. Sun, Y. Chen, M. Nau， L. Ravindranath, A. Dobi， V. Srikantan， I.A. Sesterhenn， D.G. McLeod, M. Vahey, J.ff. Moul和S. Srivastava. 2005. Frequent overexpression of ETS-related gene-1 (ERG1) in prostate cancer transcriptome (前列腺癌转录组中常见的ETS-相 关基因-l(ERGl)的过表达）? Oncogene. 24:3847-52. Raposo， G., H.ff. Nijman， ff. Stoorvogel, R. Liejendekker， C.V. Harding, C.J. Melief^PH.J. Geuze. 1996. B lymphocytes secrete antigen-presenting vesicles (B淋巴细胞分泌抗原呈递囊泡）.J Exp Med. 183:1161-72. Rice, K.R., Y. Chen, A. Ali， E.J. Whitman, A. Blase, M. Ibrahim, S. Elsamanoudi， S. Brassell， B. Furusato， N. Stingle， I.A. Sesterhenn， G. Petrovics, S. Miick， H. Rittenhouse， J. Groskopf， D.G. McLeod和S. Srivastava. 2010. Evaluation of the ETS-related gene mRNA in urine for the detection of prostate cancer (用于检测前列腺癌的尿中ETS-相关基因mRNA的评估）.Clin Cancer Res. 16:1572-6. Rostad， K., 0.J. Hellwinkel, S.A. Haukaas， 0.J. Halvorsen, A.M. Oyan, A. Haese，L. Budaus，H. Albrecht, L.A. Akslen，T. Schlomm和K.H. Kalland. 2009. TMPRSS2:ERG fusion transcripts in urine from prostate cancer patients correlate with a less favorable prognosis (前列腺癌患者尿中的TMPRSS2:ERG融合 转录物与差预后相关）.APMIS. 117:575-82. Salami, S.S., F. Schmidt, B. Laxman, M.M. Regan, D.S. Rickman, D. Scherr， G. Bueti， J. Siddiqui， S.A. Tomlins, J.T. Wei, A.M. Chinnaiyan, M.A. Rubin和 M.G. Sanda. 2011. Combining urinary detection of TMPRSS2:ERG and PCA3 with serum PSA to predict diagnosis of prostate cancer (组合TMPRSS2:ERG和PCA3的尿 检测与血清PSA以预测前列腺癌途断）.Urol Oncol. Skog， J., T. ffurdinger, S. van Rijn, D.H. Meijer， L. Gainche， M. Sena-Esteves, ff. T. Curry, Jr. , B. S. Carter, A.M. Krichevsky和X?0? Breakefield. 2008. Glioblastoma microvesicles transport RNA and proteins that promote tumour growth and provide diagnostic biomarkers (促进肿瘤生长和提供途断生物标 志物的恶性胶质瘤微泡转运RNA和蛋白）.Nat Cell Biol. 10:1470-6. Steemers， F.J., ff. Chang, G. Lee, D.L. Barker, R. Shen和K.L. Gunderson. 2006. Whole-genome genotyping with the single-base extension assay (用单喊基 延伸测定全基因组基因分型）.Nat Methods. 3:31-3. Taylor， D.D?和C. Gercel-Taylor. 2008. MicroRNA signatures of tumor-derived exosomes as diagnostic biomarkers of ovarian cancer (作为卵巢癌i衾断生 物标志物的肿瘤-衍生外来体的微小RNA特征）.Gynecol Oncol. 110:13-21. Ting, D.T., D. Lipson， S. Paul, B.ff. Brannigan， S. Akhavanfard, E.J. Coffman, G. Contino， V. Deshpande， A.J. Iafrate， S. Letovsky, M.N. Rivera, N. Bardeesy，S. Maheswaran^PD.A. Haber. 2011. Aberrant overexpression of satellite repeats in pancreatic and other epithelial cancers. Science (膜腺和 其他上皮癌中卫星重复的异常过表达）.331:593-6. Tomlins, S.A., S.M. Aubin， J. Siddiqui， R.J. Lonigro， L. Sefton-Miller， S. Miick，S. ffilliamsen, P. Hodge, J. Meinke，A. Blase, Y. Penabella，J.R. Day, R. Varambally, B. Han, D. Wood, L. Wang, M.G. Sanda, M.A. Rubin, D.R. Rhodes , B. Hollenbeck, K. Sakamoto, J.L. Silberstein，Y. Fradet，J.B. Amberson， S. Meyers, N. Palanisamy, H. Rittenhouse， J.T. Wei, J. Groskopf和 A.M. Chinnaiyan. 2011. Urine TMPRSS2:ERG Fusion Transcript Stratifies Prostate Cancer Risk in Men with Elevated Serum PSA (尿TMPRSS2:ERG融合转录物 分层血清PSA升高男性中的前列腺癌风险）.Sci Transl Med. 3:94ra72. Tomlins, S.A., D.R. Rhodes, S. Perner， S.M. Dhanasekaran， R. Mehra， X.ff. Sun, S. Varambally, X. Cao， J. Tchinda， R. Kuefer， C. Lee, J.E. Montie, R.B. Shah, K.J. Pienta，M.A. Rubin和A.M. Chinnaiyan. 2005. Recurrent fusion of TMPRSS2 and ETS transcription factor genes in prostate cancer (前列腺癌中 TMPRSS2和ETS转录因子基因的复发性融合）.Science. 310:644-8. Velculescu, V.E., L. Zhang, B. Vogelstein和K.W. Kinzler. 1995. Serial analysis of gene expression (基因表达的系列分析）? Science. 270:484-7. Went， P.T.， A. Lugli， S. Meier， M. Bundi， M. Mirlacher， G. Sauter和S. Dirnhofer. 2004. Frequent EpCam protein expression in human carcinomas (人类 癌中常见的EpCam蛋白表达）.Hum Pathol. 35:122-8. Wong，M.L?和J.F. Medrano. 2005. Real-time PCR for mRNA quantitation (用于 mRNA定量的实时PCR). Biotechniques. 39:75-85. Zhang, M., D.E. Latham, M.A. Delaney和A. Chakravarti. 2005. Survivin mediates resistance to antiandrogen therapy in prostate cancer (存活素介导对
【主权项】
1. 用于有需要的受试者中前列腺癌的诊断、预后、监测或治疗选择的方法，所述方法包 括以下步骤： a. 从受试者获得随机尿样品； b. 从样品提取一种或多种mRNA; c. 检测PCA3和ERG的mRNA表达水平； d. 将PCA3和ERG的mRNA表达水平归一化至SPDEF; e. 使用式： 't- 计算归一化的PCA3和ERG的mRNA表达水平的输出值以产生ΕΧ0106分数;和 f. 比较EX0106分数与使用基于PCA3和ERG的组合产生的ROC曲线测定的预定截断值以 区分处于高前列腺癌风险的受试者与具有低前列腺癌风险的受试者。2. 权利要求1的方法，其中所述随机尿样品为从膀胱中排出的第一个40 mL。3. 权利要求1的方法，其中所述随机尿样品为从膀胱中排出的第一个20 mL。4. 权利要求1的方法，其中所述预定截断值为EX0106分数10,其中10或更高的EX0106分 数表明受试者处于高前列腺癌风险。5. 权利要求1-4中任一项的方法，其中步骤(a)进一步包括从随机尿样品分离微泡部分 并从微泡部分提取一种或多种核酸。6. 权利要求5的方法，其中分离微泡部分的步骤包括处理样品以去除细胞及细胞碎片 和通过将微泡部分暴露于超滤或过滤浓缩器而浓缩微泡部分，和洗涤微泡部分，然后从微 泡部分提取一种或多种核酸。7. 权利要求6的方法，其中所述方法进一步包括从微泡部分提取一种或多种核酸之前 向微泡部分加入RNA酶抑制剂。8. 权利要求1-7中任一项的方法，进一步包括在步骤（d)中检测选自AMACR、BIRC5、 H0XC6和SPARCL1的一种或多种基因的表达水平。9. 权利要求1-8中任一项的方法，其中在步骤(b)之前向尿样品中加入已知量的Q-β颗 粒，并且其中在步骤(c)中检测Q-β靶基因的表达水平，并且其中将检测到的表达水平与已 知量比较。10. 权利要求1-9中任一项的方法，其中所述癌症为侵袭性癌症。11. 用于有需要的受试者中Gleason分数大于6的高Gleason分数前列腺癌的诊断、预 后、监测或治疗选择的方法，所述方法包括以下步骤： a. 从受试者获得随机尿样品； b. 从样品提取一种或多种mRNA; c ·检测PCA3和ERG的mRNA表达水平； d. 将PCA3和ERG的mRNA表达水平归一化至SPDEF; e. 使用式： Il ：1 ：) , , ： tissp.： fi? lilt. 5 , ,.,. '' A u 、、、、 'r 、 、 计算归一化的PCA3和ERG的mRNA表达水平的输出值以产生EX0106分数;和 f.比较EX0106分数与使用基于PCA3和ERG的组合产生的ROC曲线测定的预定截断值以 区分处于Gleason分数大于6的高Gleason分数前列腺癌的高风险的受试者与具有Gleason 分数大于6的高Gleason分数前列腺癌的低风险的受试者。12. 权利要求11的方法，其中所述随机尿样品为从膀胱中排出的第一个40 mL。13. 权利要求11的方法，其中所述随机尿样品为从膀胱中排出的第一个20 mL。14. 权利要求11的方法，其中所述预定截断值为EX0106分数10,其中10或更高的EX0106 分数表明受试者处于Gleason分数大于6的高Gleason前列腺癌的高风险。15. 权利要求11-14中任一项的方法，其中步骤(a)进一步包括从随机尿样品分离微泡 部分并从微泡部分提取一种或多种核酸。16. 权利要求15的方法，其中所述分离微泡部分的步骤包括处理样品以去除细胞及细 胞碎片和通过将微泡部分暴露于超滤或过滤浓缩器而浓缩微泡部分，和洗涤微泡部分，然 后从微泡部分提取一种或多种核酸。17. 权利要求16的方法，其中所述方法进一步包括从微泡部分提取一种或多种核酸之 前向微泡部分加入RNA酶抑制剂。18. 权利要求11-17中任一项的方法，进一步包括在步骤(d)中检测选自AMACR、BIRC5、 H0XC6和SPARCL1的一种或多种基因的表达水平。19. 权利要求11-18中任一项的方法，其中在步骤(b)之前向尿样品中加入已知量的Q-β 颗粒，并且其中在步骤(c)中检测Q-β靶基因的表达水平，并且其中将检测到的表达水平与 已知量比较。20. 权利要求11-19中任一项的方法，其中所述癌症为侵袭性癌症。
【文档编号】C12Q1/68GK106029900SQ201480054985
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2014年8月6日
【发明人】J.K.O.斯科格, M.诺尔霍尔姆
【申请人】外来体诊断公司