一种二氟尼柳的药物组合物及其医药用图
【专利摘要】本发明公开了一种二氟尼柳的药物组合物及其医药用途，本发明提供的二氟尼柳的药物组合物中含有二氟尼柳和一种结构新颖的天然产物化合物(Ⅰ)，二氟尼柳、化合物(Ⅰ)单独作用时，可以提高CD4+细胞数及改善免疫功能调整免疫平衡，对艾滋病具有治疗作用；二氟尼柳和化合物(Ⅰ)联合作用时，治疗效果进一步提高，可以开发成治疗艾滋病的药物，与现有技术相比具有突出的实质性特点和显著的进步。
【专利说明】
一种二氟尼柳的药物组合物及其医药用途
技术领域
[0001] 本发明属于生物医药领域，涉及二氟尼柳的新用途，具体涉及二氟尼柳的药物组 合物及其在艾滋病中的应用。
【背景技术】
[0002] 二氟尼柳为水杨酸衍生物，具有解热、镇痛、抗炎作用，比阿司匹林镇痛消炎作用 强且维持时间长，胃肠道刺激小。
[0003] 迄今为止，尚未见二氟尼柳及其药物组合物与艾滋病的相关性报道。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种二氟尼柳的药物组合物，该药物组合物中含有二氟尼 柳和一种结构新颖的天然产物，二氟尼柳和该天然产物可以协同治疗艾滋病。
[0005] 本发明的上述目的是通过下面的技术方案得以实现的：
[0006] 一种具有下述结构式的化合物（I)，
[0008] -种二氟尼柳的药物组合物，包括二氟尼柳、如权利要求1所述的化合物（I)和药 学上可以接受的载体，制备成需要的剂型。
[0009] 进一步地，药学上可以接受的载体包括稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、 崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体或润滑剂。
[0010] 进一步地，所述剂型包括片剂、胶囊剂、口服液、口含剂、颗粒剂、冲剂、丸剂、散剂、 膏剂、丹剂、混悬剂、粉剂、溶液剂、注射剂、栓剂、喷雾剂、滴剂或贴剂。
[0011] 上述化合物（I)的制备方法，包含以下操作步骤：（a)将红参粉碎，用75~85%乙醇 热回流提取，合并提取液，浓缩至无醇味，依次用石油醚、乙酸乙酯和水饱和的正丁醇萃取， 分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；（b)步骤(a)中正丁醇取物用大 孔树脂除杂，先用25%乙醇洗脱8个柱体积，再用70 %乙醇洗脱12个柱体积，收集70%洗脱 液，减压浓缩得70%乙醇洗脱浓缩物；（c)步骤(b)中70%乙醇洗脱浓缩物用正相硅胶分离， 依次用体积比为85:1、45:1、25:1和15:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到4个组分；（d)步骤 (c)中组分4用正相硅胶进一步分离，依次用体积比为20:1、15:1和1:1的二氯甲烷-甲醇梯 度洗脱得到3个组分；（e)步骤(d)中组分2用十八烷基硅烷键合的反相硅胶分离，用体积百 分浓度为72 %的甲醇水溶液等度洗脱，收集10~16个柱体积洗脱液，洗脱液减压浓缩得到 化合物(I)。
[0012] 进一步地，化合物（I)的制备方法中，所述大孔树脂为D101型大孔吸附树脂。
[0013] 上述化合物(I)在制备治疗艾滋病的药物中的应用。
[0014] 上述二氟尼柳的药物组合物在制备治疗艾滋病的药物中的应用。
[0015] 本发明的优点：
[0016] 本发明提供的二氟尼柳的药物组合物中含有二氟尼柳和一种结构新颖的天然产 物，二氟尼柳、化合物（I)单独作用时，可以提高CD4+细胞数及改善免疫功能调整免疫平衡， 对艾滋病具有治疗作用；二氟尼柳和化合物（I)联合作用时，治疗效果进一步提高，可以开 发成治疗艾滋病的药物。本发明与现有技术相比具有突出的实质性特点和显著的进步。
【具体实施方式】
[0017] 下面结合实施例进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明保护范 围。尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对 本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
[0018] 实施例1:化合物(I)分离制备及结构确证
[0019] 分离方法：（a)将红参（2kg)粉碎，用80 %乙醇热回流提取（15L X 3次），合并提取 液，浓缩至无醇味（3L)，依次用石油醚（3L X 3次）、乙酸乙酯（3L X 3次）和水饱和的正丁醇 (3LX3次）萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；（b)步骤(a)中 乙酸乙酯萃取物用D101型大孔树脂除杂，先用25%乙醇洗脱8个柱体积，再用70%乙醇洗脱 12个柱体积，收集70%洗脱液，减压浓缩得70%乙醇洗脱浓缩物；（c)步骤(b)中70%乙醇洗 脱浓缩物用正相硅胶分离，依次用体积比为85:1 (10个柱体积）、45:1 (8个柱体积）、25:1 (10 个柱体积)和15:1 (8个柱体积)的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得至1」4个组分；（d)步骤(c)中组分 4用正相硅胶进一步分离，依次用体积比为20:1 (10个柱体积）、15:1 (8个柱体积)和1:1 (6个 柱体积)的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到3个组分；（e)步骤(d)中组分2用十八烷基硅烷键合 的反相硅胶分离，用体积百分浓度为72 %的甲醇水溶液等度洗脱，收集10~16个柱体积洗 脱液，洗脱液减压浓缩得到化合物（I) (HPLC归一化纯度大于98% )。
[0020] 结构确证:册431-]\^显示[]\?1]+为111/2 507.3062，结合核磁特征可得分子式为 C32H44〇5，不饱和度为 12。核磁共振氢谱数据δΗ(ppm，DMS〇-d6，600MHz): H-1 (6 · 06，d，J = 12.9Hz)，H-2(5.88，d，J=12.9Hz)，H-4(4.48，qd，J = 6.7,4.5Hz)，H-5(2.35，dd，J = 4.5， 3.3Hz)，H-6(6.52，dd，J=12.2,3.3Hz)，H-7(6.21，dd，J=12.2,3.7Hz)，H-8(2.03，d，J = 3.7Hz)，H-ll(1.50，m)，H-ll(2.10，m)，H-12(1.63，m)，H-12(1.71，m)，H-15(1.28，m)，H-15 (2.34，dd，J=14.9,7.3Hz)，H-16(5.32，m)，H-16b(2.05，s)，H-17(2.51，m)，H-18(1.08，s)， H-19(0.89，d，J = 4.3Hz)，H-19(0.98，d，J = 4.3Hz)，H-21(1.81，s)，H-22(6.61，s)，H-24a (5.85，s)，H-24a(6.04，s)，H-25(2.88，m)，H-26(1.03，d，J = 6.6Hz)，Η-27(1· ll，d，J = 6 · 6Hz)，H-28 (1 · 27，d，J = 6 · 7Hz)，H-30 (0 · 99，s);核磁共振碳谱数据心（卯m，DMS〇-d6， 150MHz):153.3(CH，l-C)，121.2(CH，2-C)，168.5(C，3-C)，79.5(CH，4-C)，44.6(CH，5-C)， 133.7(CH，6-C)，129.5(CH，7-C)，54.6(CH，8-C)，30.2(C，9-C)，37.0(C，10-C)，28.5(CH2， 11-C)，32.6(CH2，12-C)，45.2(C，13-C)，47.3(C，14-C)，46.9(CH2，15-C)，77.1(CH，16-C)， 170.2(C，16a-C)，22.3(CH 3，16b-C)，59.5(CH，17-C)，18.5(CH3，18-C)，32.5(CH2，19-C)， 162.4(C，20-C)，16.8(CH 3,21-C)，126.6(CH，22-C)，194.8(C，23-C)，154.3(C，24-C)，119.8 (CH2,24a-C)，29.5(CH，25-C)，22.1(CH 3,26-C)，21.8(CH3,27-C)，18.8(CH3,28-C)，20.1 (CH 3，30-C)。IR谱图中的1715cnf1与1694cnf1吸收带表明该化合物结构中存在羰基与共辄羰 基;UV谱图中的最大吸收207nm与245nm说明结构中存在共辄双键。氢谱核磁数据表明该结 构中不饱和度是由四个C-C双键结构，三个羰基结构以及五个环状骨架组成。碳谱核磁数据 与DEPT谱数据表明该化合物结构中含有32个碳，其中有七个甲基，五个亚甲基(一个烯属亚 甲基δ〇119.8)，^^一个次甲基(五个烯属碳δ〇153.3、121.2、133.7、129.5、126.6,两个连氧碳 δ〇79.5与77.1)，九个季碳(一个酮基δ。194.8,两个酯羰基δ。168.5与170.2,两个烯属季碳 162.4与154.3)。核磁数据表明该化合物含有一个具有甲基侧链的α，β-不饱和七元内酯 环结构[3 116.06((1，了=12.9!^，!1-1)，5.88((1，了=12.9抱，!1-2)，4.48(9(1，了 = 6.7,4.5!^，!1-4)，2.35(dd，J = 4.5,3.3Hz，H-5)，1.27(3H，d，J = 6.7Hz，H-28);Sc153.3(C-l)，121.2(C- 2)，168.5(C-3)，79.5(C-4)，44.6(C-5)，37.0(C-10)，18.8(C-28)]，一个环丙烷结构[δ η0.89(d，J = 4.3Ηζ，Η-19)，0· 98(d，J = 4.3Hz，H-19);SC30.2(C-9)，37.0(010)，32.5(C-19)]，一个乙酰氧基[5 112.05(8，!1-1613,3!04。170.2((：-163)，22.3((：-1613)]，一个末端双键 [3 115.85(8，!1-24&)，6.04(8，!1-24&);3。154.3((：-24)，119.8((：-24&)]，一个顺式双键[3[ 16.52 (dd，J=12.2,3.3Hz，H-6)，6.21(dd，J=12.2,3.7Hz，H-7);S c133.7(C-6)，129.5(C-7)]，一 个三取代双键[3116.61(8，!1-22) ;3。162.4((：-20)，126.6((：-22)]。腿8(：谱中，!1-160[15.32)与 016 &说170.2)的相关性表明(：-16说77.1)位连有一个乙酰氧基。通过1^3￥谱数据解析!1-4(δΗ 4.48)、Me-28(δΗ 1.27)与H-5 (δΗ2.35)的关系可以说明28-甲基相对立体构型。综合氢 谱、碳谱、HMBC谱和N0ESY谱，以及文献关于相关类型核磁数据，可基本确定该化合物如下所 示，立体构型进一步通过ECD试验确定，理论值与实验值基本一致。该化合物化学式及碳原 子编号如下：
p
[0022] 实施例2:药理作用
[0023] 本实施例使用SIVmac病毒液静脉接种恒河猴制备艾滋病模型猴模型，观察药物提 高CD4+细胞百分数及CD 4+/CD8+比值，并促进T、B淋巴细胞增殖等方面的抗艾滋病作用。
[0024] 1、材料与方法
[0025] 1.1动物
[0026] 恒河猴5~7kg，雄性健康，感染前经PCR检测无 SIV阳性，血常规正常，由中国医学 科学院实验动物研究所提供。
[0027] 1.2试剂与样品
[0028] 二氟尼柳购自中国药品生物制品检定所。化合物（I)自制，制备方法见实施例1。单 克隆抗体，购自军事医学科学院生物制剂发展中心。AZT (叠氮胸苷)购自Burroughs。
[0029] 1.3仪器
[0030] FACS420型流式细胞仪测定(美国B.D公司KTMRMC型酶标仪。
[0031] 1.4猴分组及模型制备
[0032] SIVmac感染成功动物随机分组，分别为正常对照组、模型对照组、阳性对照组(AZT 组50mg · kg-"、二氟尼柳组（80mg · kg-1化合物（I)组（80mg · kg-1二氟尼柳与化合物 (I)组合物组【40mg · kg"1二氟尼柳+40mg · kg^1化合物（I)】。感染后2周给药，药物组每日按 照上述剂量给药;正常对照组，每日给生理盐水等量。每组每日给药一次，插胃管灌入。给药 时间为两个月一个疗程，共观察18周，然后解剖进行病理观察。
[0033] 1.5T淋巴细胞亚群测定实验
[0034]以单克隆抗体直接标记动物外周血CD4+，CD8 +细胞，按产品说明书操作，采用 FACS420型流式细胞仪测定。微机处理分析阳性率，并计算⑶4+/⑶8细胞比值。
[0035] 1 · 6MTT法观察T、B淋巴细胞增殖实验
[0036]①无菌取猴静脉血2ml，肝素抗凝，分离单个核细胞，调整细胞数IX 105/ml。②将 调整细胞悬液种植在96孔培养板内，200μ1/孔，并分别加入不同有丝分裂原诱导淋巴细胞 分化，ConA5μg/ml，LPS30μg/ml浓度，培养48h后加入MTT(5mg/ml)继续培养4h，加入酸化异 丙醇(0.04mol/L)，利用TMRMC型酶标仪检测，波长570~630nm。
[0037] 1.7统计学方法
[0038]实验数据用均数土标准差(X土s)表示，应用SPSS18.0版统计软件进行单因素方差 分析和t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。
[0039] 2、实验结果
[0040] 2 · 1对SIV感染动物⑶4+细胞的影响
[0041 ]应用单克隆抗体直接荧光标记⑶4+，CD8+细胞，流式细胞仪检测，结果表明SIVmac 感染4周时模型对照组⑶4+及⑶4+/CD8+比值下降(P<0.01);与模型对照组比较，二氟尼柳与 化合物（I)组合物组和阳性对照组⑶ 4+及⑶4+/⑶8+比值显著上升(P<〇.01);与模型对照组 比较，二氟尼柳组、化合物（I)组⑶ 4+及⑶4+/CD8+比值上升(P<0.05)。见下表。
[0042] 2.2对SIV模型动物T淋巴细胞分化增殖的影响
[0043]与正常对照组比，模型对照组在感染4周时，T细胞对ConA诱导分化增殖反应明显 下降，与感染前相比有明显差异(p〈0.01)。与模型对照组比较，二氟尼柳与化合物（I)组合 物组和阳性对照组T细胞对有丝分裂原刺激的反应能力显著提高，T细胞明显回升（P< 〇.〇1);与模型对照组比较，二氟尼柳组、化合物（I)组T细胞回升(P<0.05)。
[0044] 结果见下表。
[0045] 2.3对SIV模型动物B淋巴细胞分化增殖的影响
[0046] 与正常对照组比较，模型对照组在感染4周时，与感染前相比B细胞功能受损，增殖 反应低于感染前(P〈〇.01)。与模型对照组比较，二氟尼柳与化合物（I)组合物组和阳性对照 组B细胞增殖显著上升(P<0.01);与模型对照组比较，二氟尼柳组、化合物（I)组B细胞增殖 上升(P<0.05)。结果见下表。
[0048]艾滋病又称获得性免疫缺陷综合症，由艾滋病毒感染所致，目前国际上采用哈特 疗法(HAART)，即几种优势互补西药联合应用，是公认的高效抗逆转录病毒治疗药物，但还 是不能使病毒彻底杀灭，而且副作用多，使患者生活质量下降。猴免疫缺陷病毒(SIV)诱发 猴艾滋病（SAIDS)感染实验动物模型，是1989年经WHO专家推荐抗艾滋病药物治疗动物模 型，它在病原学，临床、病理、免疫学及发病机理等方面与人感染艾滋病极为相似，国外已较 多用于评价抗艾滋病药物的效果。
[0049] ⑶4+细胞是维护机体免疫功能的重要细胞，也是SIV破坏的主要细胞，因此⑶4+阳 性细胞数降低对免疫缺陷进展有直接关系。它的数量及功能变化是评价疾病发展和药物疗 效的重要指标。正常人体CD4+细胞与CD8+细胞相对制约维持机体的免疫平衡，由于HIVAIDS 患者⑶4+细胞数量不断减少及功能受损至使⑶4+⑶8+细胞比例倒置，CD8+细胞较⑶4+细胞相 对占优势，增强免疫抑制作用，造成免疫功能失调，如HIV进一步侵犯机体其它免疫细胞，即 会导致机体免疫功能缺陷。由于病毒在体内持续不断的复制，破坏机体免疫细胞，致使SIV 模型动物外周血CD4+细胞数量明显降低。CD4+细胞被破坏，数量减少，淋巴细胞正常功能受 到抑制，致使T淋细胞对有丝分裂原诱导反应能力降低，感染SIV动物B细胞对细菌脂多糖 LPS反应能力也下降，但不及T细胞明显，呈迟缓下降趋势。
[0050] 上述结果表明，二氟尼柳、化合物（I)单独作用时，可以提高CD4+细胞数及改善免 疫功能调整免疫平衡，对艾滋病具有治疗作用；二氟尼柳和化合物（I)联合作用时，治疗效 果进一步提高，可以开发成治疗艾滋病的药物。
[0051] 上述实施例的作用在于说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明的保护 范围。本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换， 而不脱离本发明技术方案的实质和保护范围。
【主权项】
1. 一种具有下述结构式的化合物（I)，2. -种二氟尼柳的药物组合物，其特征在于:包括二氟尼柳、如权利要求1所述的化合 物(I)和药学上可以接受的载体，制备成需要的剂型。3. 根据权利要求2所述的二氟尼柳的药物组合物，其特征在于:药学上可以接受的载体 包括稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体 或润滑剂。4. 根据权利要求2所述的二氟尼柳的药物组合物，其特征在于:所述剂型包括片剂、胶 囊剂、口服液、口含剂、颗粒剂、冲剂、丸剂、散剂、膏剂、丹剂、混悬剂、粉剂、溶液剂、注射剂、 栓剂、喷雾剂、滴剂或贴剂。5. 权利要求1所述的化合物（I)的制备方法，其特征在于，包含以下操作步骤：（a)将红 参粉碎，用75~85 %乙醇热回流提取，合并提取液，浓缩至无醇味，依次用石油醚、乙酸乙酯 和水饱和的正丁醇萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；（b)步 骤(a)中正丁醇取物用大孔树脂除杂，先用25%乙醇洗脱8个柱体积，再用70%乙醇洗脱12 个柱体积，收集70%洗脱液，减压浓缩得70%乙醇洗脱浓缩物；（c)步骤(b)中70%乙醇洗脱 浓缩物用正相硅胶分离，依次用体积比为85:1、45:1、25:1和15:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗 脱得到4个组分；（d)步骤(c)中组分4用正相硅胶进一步分离，依次用体积比为20:1、15:1和 1:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到3个组分；（e)步骤(d)中组分2用十八烷基硅烷键合的反 相硅胶分离，用体积百分浓度为72 %的甲醇水溶液等度洗脱，收集10~16个柱体积洗脱液， 洗脱液减压浓缩得到化合物(I)。6. 根据权利要求5所述的化合物（I)的制备方法，其特征在于:所述大孔树脂为D101型 大孔吸附树脂。7. 权利要求1所述的化合物（I)在制备治疗艾滋病的药物中的应用。8. 权利要求2~4任一所述的二氟尼柳的药物组合物在制备治疗艾滋病的药物中的应 用。
【文档编号】A61P31/18GK106046112SQ201610493013
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年6月24日
【发明人】胡逸穹
【申请人】胡逸穹