一种预防和清除哺乳动物细胞污染的试剂的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种预防和清除哺乳动物细胞污染的试剂，属于哺乳动物细胞培养中微生物污染控制领域。本发明中，一种序列为SEQ ID NO:1的多肽可用于预防和清除哺乳动物细胞污染，本发明试剂由序列为SEQ ID NO:1的多肽和氨基酸组成，不含任何抗生素成分。本发明的产品按照预防和清除污染所需浓度配制，可有效预防和清除哺乳动物细胞中的微生物污染，克服了现有产品中抗生素成分的使用限制以及处理细胞周期较长的缺陷，且该产品稳定性好，易于保存。
【专利说明】
-种预防和清除哺乳动物细胞污染的试剂
技术领域
[0001 ]本发明设及哺乳动物细胞培养中微生物污染控制领域。
【背景技术】
[0002] 细胞培养技术广泛应用于科研、教学、临床实验研究、血液制品、抗体、疫苗等生物 制品的研发和生产等领域中，细胞的质量直接影响科学研究结果及生物制品的安全和质 量。在细胞培养过程中，微生物污染的威胁无处不在，潜在污染主要来自于:细胞自身携带 潜在污染源、原辅材料污染、细胞间的交叉污染、操作污染。
[0003] 哺乳动物细胞培养中，细菌污染特征明显，培养液可在短时间内变黄，并出现明显 浑浊现象，倒置显微镜下可见培养液中有大量圆球状颗粒物漂浮。而支原体污染具有隐蔽 性，培养基一般不发生浑浊，细胞无明显变化，但支原体可引起细胞变形，影响DNA、RNA合成 及蛋白表达，抑制细胞生长，显微镜下可见细胞间出现大量黑点，细胞空泡化，呈调亡、坏死 状态。
[0004] 常用于预防和清除哺乳动物细胞污染的方法有:细胞培养环境的控制、无菌操作、 细胞培养基和器材的无菌处理、细胞交叉污染的控制、抗微生物试剂的添加。前几项控制工 作中，难免百密一疏，抗微生物试剂的添加因其便捷性而为广泛使用，市售主要抗微生物试 剂见表1: 表1市售主要抗微生物试剂
[0005] 由上表可知，市售主要抗微生物试剂大多为抗生素制剂，抗生素用于预防和清除 细胞污染虽然方便，但也存在诸多缺点：1.抗生素的使用对细胞会有不同程度的损伤(SP Langdon，Cell culture contamination: an overview[J]. Methods Mol Med, 2004,88: 309el7.)，且具有依赖性(王鸿等，细胞培养中珍贵贴壁细胞污染挽救方法的评价，首都医 科大学学报2011，3(1):129-135.):2.赖药性问题，传统抗生素的作用机理大多通过阻 碍细菌细胞壁的合成、抑制蛋白质的合成、影响核酸、叶酸的代谢等来进行抗微生物，微生 物很容易通过基因突变来改变代谢途径，进而对抗生素产生耐药性。3.支原体无细胞壁， 通常作用于细胞壁生物合成的抗生素，如内酷胺类、万古霉素等对其完全不敏感;4.《药 典》2015年版对生物制品中抗生素的使用有明确限制:除另有规定外，不得使用青霉素或其 他e-内酷胺类抗生素;生产过程中，应尽可能避免使用抗生素，必须时，使用种类不得超过1 种；成品检定中应检测并规定残留量限值；5.抗生素处理污染细胞时间较长，一般为1-2 周，处理后的细胞生理性能或有变化，进而影响试验结果或最终的生物制品质量。
[0006]抗菌肤是一类碱性多肤，一般由12~50个左右氨基酸组成，具有广谱抗菌性，对细 菌、真菌、病毒、寄生虫和肿瘤细胞有抑制或杀灭作用，可促进伤口愈合过程，调节机体免疫 系统的功能，中和细菌内毒素 LPS，降低炎性细胞因子的释放，减缓炎症反应引起的组织损 伤。相对于抗生素，抗菌肤在耐药性方面具有不可比拟的优点，抗菌肤可通过与微生物细胞 膜作用，形成孔桐，影响细胞内外渗透压，进而使细胞死亡。细菌只有改变细胞膜结构才能 产生耐药性，因此，运种物理抗菌机理不易使细菌产生耐药性。
[0007]目前，抗菌肤数据库（APD, http://aps.unmc.edu/AP/)收录了来自6类生物共 2722种抗菌肤，其中，272种来自细菌，4种来自古生菌，8种来自原生生物，13种来自真菌， 335种来自植物，2043种来自动物。虽然抗菌肤的种类众多，但应用于生产实践中的不多，原 因如下：1.抗菌肤分子小，分离纯化较困难，易被蛋白酶降解;2.大多数抗菌肤对微生物细 胞膜的攻击特点令其对真核细胞(如人体细胞)有毒性;3.抗菌肤的性能各异，针对特定预 期用途须做大量基础性研究工作，包括全面的药理和毒理试验，证明有足够的安全性和有 效性才能继续下去;4.抗菌肤制剂中组分的相容性问题，抗菌肤为生物活性物质，许多因素 会降低抗菌肤的活性，如高浓度的一价和二价阳离子、聚阴离子(polyanion)、血清、阿朴脂 蛋白A-I (apolipoprotein A-I )和蛋白酶等。
【发明内容】
[0008] 针对现有技术中的上述缺陷，本发明的第一个目的：提供一种不含抗生素的预防 和清除哺乳动物细胞污染的试剂及其配制和使用方法。本发明提供的试剂主要组分为多肤 和氨基酸，多肤代谢后产物为氨基酸，对细胞安全无毒性。
[0009] 本发明的第二个目的：拓展抗菌肤的应用领域。已知抗菌肤可用于各个领域，包括 农业、食品、卫生用品、医药、化妆品、生物农药、生物饲料添加剂、天然食品防腐剂、动植物 抗病基因工程领域等，但尚无报道抗菌肤在细胞污染控制领域的应用。
【申请人】发现本发明 中的多肤用于细胞污染控制领域具有预料不到的优异技术效果。
[0010] 本发明的第=个目的：提供一种相容性好、抗微生物效果佳、协同增效的抗菌肤制 剂，用于预防和清除哺乳动物细胞污染。
[0011] 本发明提供的预防和清除哺乳动物细胞污染的试剂，含有序列为SEQ ID NO: 1的 多肤，多肤含量为1.5%-15%，优选为2.5%-12.5%。试剂中还含有赖氨酸和甲硫氨酸，所述赖 氨酸含量为0.85%-2.73%，所述甲硫氨酸含量为0.09%-1.2%。
[0012] 本发明中所述多肤可通过化学合成，也可W通过基因工程技术表达、分离纯化得 質1(具体方法可参见Sambrook et al.，Molecular Cloning :A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor，NY，1989)〇
[0013] 为实现上述发明目的，本发明还提供了一种预防和清除哺乳动物细胞污染的试剂 的制备方法，如下： 先将溶剂经121°C高溫103Kpa高压灭菌，在4°C环境下冷藏备用；取多肤0.15g -1.5g， 赖氨酸0 . 〇85g -0.273g和甲硫氨酸0.009g-0.12g;将9ml溶剂加入溶解桶中，依次加入多 肤、赖氨酸和甲硫氨酸，揽拌溶解，溶剂补齐至10ml;在超净台内将上述溶液经0.22WI1-次 性滤器过滤除菌，分装，在-20°C下保存。
[0014] 上述溶剂可为纯水、PBS溶液、细胞培养基、生理盐水等。
[0015] 当本发明的产品用于预防哺乳动物细胞培养中微生物污染时，W相应细胞培养 基，将产品按照1:1000的稀释体积比例进行稀释，添加入细胞培养基中，用于细胞培养即 可，其余培养操作照常。根据细胞的周期不同，每2-4天添加1次，长期添加，W预防微生物污 染。
[0016] 当本发明的产品用于清除哺乳动物细胞培养中微生物污染时，W相应细胞培养 基，将产品按照1:1000的稀释体积比例进行稀释，添加入细胞培养基中，弃去旧的培养基， 用PBS将细胞清洗干净，再加入新鲜的含有本发明产品的培养基，1天1次，连续处理3天。
[0017] 本发明与现有技术中的细胞污染控制类产品相比，具有W下技术效果： 1. 本发明在使用1-3天后有显著微生物清除效果，而现有技术为7-14天； 2. 本发明不含有抗生素，多肤成分降解后终产物为氨基酸，符合药典中要求； 3. 本发明产品在使用浓度下对细胞基本无毒性； 4. 本发明抗菌肤制剂中，各组分相容性好，且有协同增效作用。
[0018] 使用本发明提供的预防和清除哺乳动物细胞培养中微生物污染的试剂，可W清除 哺乳动物细胞培养中常见的细菌和支原体污染，在1-3天后有显著清除效果，还可W用来预 防污染。经过处理的污染哺乳动物细胞，治疗周期完成后，细胞培养基澄清，细胞间无黑点， 细胞生长周期回复正常，细胞形态正常，无团聚生长。
【附图说明】
[0019] 图1是本发明提供的试剂使用后的抑菌结果。
[0020] 图2是本发明提供的试剂使用前后的细胞对照图。
[0021] A:处理前的CH0-S细胞;A' ：处理后的CH0-S细胞。
[0022] B:处理前的Vero细胞;B' ：处理后的Vero细胞。
[0023] C:处理前的NIH-3T3细胞;C' ：处理后的NIH-3T3细胞。
[0024] D:处理前的HEK293细胞;D' ：处理后的HEK293细胞。
[00巧]E:处理前的化pG2细胞;E' ：处理后的化pG2细胞。
[0026] 图3是本发明提供的试剂使用前后的巢式PCR对照图。
[0027] 图4是本发明提供的试剂的细胞毒性结果。
[0028] 图5是实施例11的打孔测活对比图。
【具体实施方式】
[0029] 实施例1 一种预防和清除哺乳动物细胞污染的试剂A及其制备方法 试剂A配方如下： 多肤:2.5% 赖氨酸:0.85〇/〇 甲硫氨酸:0. 〇9〇/〇 将纯水经12rc高溫103Kpa高压灭菌，在4°C环境下冷藏备用；取0.25g多肤，0.085g赖 氨酸，0.009g甲硫氨酸;在超净台内将9ml纯水加入溶解桶中，依次加入多肤、赖氨酸和甲硫 氨酸，揽拌溶解，纯水补齐至10ml;在超净台内将上述溶液经0.22um-次性滤器过滤除菌， 分装，在-20°C下保存，即得本发明所述试剂A。
[0030]实施例2 -种预防和清除哺乳动物细胞污染的试剂B及其制备方法 试剂B配方如下： 多肤:3.8% 赖氨酸：1.56〇/〇 甲硫氨酸:0.36〇/〇 将PBS溶液经121°C高溫103化a高压灭菌，在4°C环境下冷藏备用;取0.3始多肤，0.156g 赖氨酸，0. 〇36g甲硫氨酸;在超净台内将9mlPBS溶液加入溶解桶中，依次加入多肤，赖氨酸 和甲硫氨酸，揽拌溶解，PBS溶液补齐至10ml;在超净台内将上述溶液经0.22um-次性滤器 过滤除菌，分装，在-20°C下保存，即得本发明所述试剂B。
[0031 ]实施例3 -种预防和清除哺乳动物细胞污染的试剂C及其制备方法 试剂C配方如下： 多肤:7.3% 赖氨酸：1.82〇/〇 甲硫氨酸:0.58〇/〇 将DMEM液体培养基经121°C高溫103Kpa高压灭菌，在4°C环境下冷藏备用；取0.73g多 肤，0.18?赖氨酸，0.05始甲硫氨酸;在超净台内将9mlDMEM溶液加入溶解桶中，依次加入多 肤，赖氨酸和甲硫氨酸，揽拌溶解，DMEM补齐至10ml;在超净台内将上述溶液经0.22um-次 性滤器过滤除菌，分装，在-20°C下保存，即得本发明所述试剂C。
[0032] 实施例4 一种预防和清除哺乳动物细胞污染的试剂D及其制备方法 试剂D配方如下： 多肤：10.6〇/〇 赖氨酸:2.45〇/〇 甲硫氨酸:0.9% 将生理盐水经12TC高溫103Kpa高压灭菌，在4°C环境下冷藏备用；取1.06g多肤， 0.245g赖氨酸，0.09g甲硫氨酸;在超净台内将9ml生理盐水加入溶解桶中，依次加入多肤， 赖氨酸和甲硫氨酸，揽拌溶解，生理盐水补齐至10ml;在超净台内将上述溶液经0.22um-次 性滤器过滤除菌，分装，在-20°C下保存，即得本发明所述试剂D。
[0033] 实施例5 -种预防和清除哺乳动物细胞污染的试剂E及其制备方法 试剂E配方如下： 多肤:5% 赖氨酸：1.56〇/〇 甲硫氨酸:0.7% 将纯水经12rc高溫103化a高压灭菌，在4°C环境下冷藏备用;取0.5g多肤，0.156g赖氨 酸，0.07g甲硫氨酸;在超净台内将9ml纯水加入溶解桶中，依次加入多肤，赖氨酸和甲硫氨 酸，揽拌溶解，纯水补齐至10ml;在超净台内将上述溶液经0.22um-次性滤器过滤除菌，分 装，在-20°C下保存，即得本发明所述试剂E。
[0034] 实施例6 -种预防和清除哺乳动物细胞污染的试剂F及其制备方法 试剂F配方如下： 多肤：12.5〇/〇 赖氨酸:2.73〇/〇 甲硫氨酸：1.2% 将纯水经121°C高溫103Kpa高压灭菌，在4°C环境下冷藏备用；取1.25g多肤，0.27：3g赖 氨酸，0.12g甲硫氨酸;在超净台内将9ml纯水加入溶解桶中，依次加入多肤，赖氨酸和甲硫 氨酸，揽拌溶解，纯水补齐至10ml;在超净台内将上述溶液经0.22um-次性滤器过滤除菌， 分装，在-20°C下保存，即得本发明所述试剂F。
[0(X3日]实施例7抑菌试验 将C册-S(中国仓鼠卵巢细胞)细胞培养于96孔板中，密度为1.0 X 105 cell/well，将金 黄色葡萄球菌(ATCC6538)在营养琼脂培养基斜面连续传代培养2次后，取新鲜培养物，用无 菌PBS洗脱下菌苔制成菌悬液，将菌悬液于血细胞计数板计数使其菌含量为（1~5) Xl〇6 C化/mL，用PBS稀释菌液100倍，其菌含量为（1~5)X104 C化/mL，在上述培养细胞的孔中 加入菌液100化，使其最终菌浓度为(0.5~2.5) Xl〇4 C化/mL。将试剂A-F分别Wl:1000 的稀释比例稀释，加入试验组细胞培养孔中，W不加试剂的加菌CHO-S细胞为对照，W未做 任何处理的细胞作为空白，每组同时做3个复孔。将培养板置于35±2 °C培养箱，培养24 h 后观察结果，培养基的浑浊肉眼观察非常清晰，采用直接法读取结果。
[0036] 培养结果如图1所示，空白孔与试验孔4、8、(：、0、6少无菌生长，培养基澄清，未加试 剂的加菌CH0-S细胞孔(对照）培养基浑浊。结果表明，试剂A-F配制的实际使用浓度产品对 细胞培养中的细菌有较佳的抑菌作用。
[0037] 实施例8支原体清除效果的巧光检测 选用支原体污染的C册-S细胞、Vero细胞、NIH-3T3细胞、肥K293细胞、HepG2细胞作为处 理对象，使用试剂B配制的产品，产品按照1:1000的稀释体积比例，添加入细胞培养基中，弃 去旧的培养基，用PBS将细胞清洗干净，再加入新鲜的含有本发明产品的培养基，1天1次，连 续处理3天。
[0038] 应用电子天平精确称取化echst33342蓝色染料Img，溶于10ml二甲基亚讽(DMS0) 中，使之配成lOOug/ml的储备液。收集上述试剂处理3天前后的细胞，PBS洗涂后制成细胞悬 液，每个标本取200ul移入化pendorf管中，加入蓝色染料化echs口3342至终浓度lOug/ml， 37 °C下染色15min，取40ul细胞悬液迅速滴在载玻片上，加盖玻片，在巧光显微镜（日本 Olympus，CKX41)下观察结果。Hoechst33342染料能透过胞膜完整的细胞，嵌入细胞核DNA 中，使之发出明亮的蓝色巧光。支原体内含有DNA，亦能着色。
[0039] 用化echs 口 3342蓝色染料染色，处理3天前后细胞的形态如图2所示，可见支原体 污染的细胞中有颗粒状小点，散在细胞周围，或附于细胞膜表面;而本发明所述试剂B处理 后的细胞，可见细胞背景干净，细胞周围的颗粒状物质消失，结果显示完全清除了支原体污 染。
[0040] 实施例9支原体清除效果的PCR检测 W试剂C处理支原体污染的CH0-K1细胞、CH0-S细胞、H460细胞，处理方法同实施例8，W 经12 rC高溫103Kpa高压灭菌的纯水为阴性对照。
[0041 ] 取处理3天前、后的细胞培养液及对照95°C水浴加热5min，12000巧m离屯、Imin，取 上清做巢式PCR检测。
[0042]巢式PCR第一轮体系和程序 3/
b)程序
由于PCR反应中的引物来自支原体的保守16S-23S rRNA序列，因此，可根据1%琼脂糖凝 胶电泳检测PCR结果判定支原体是否被清除，检测结果如图3,其中，泳道1为阴性对照，泳 道2、3分别为W试剂C处理3天前、后的C册-K1细胞培养液，泳道4、5分别为W试剂C处理3天 前、后的CHO-S细胞培养液，6、7泳道分别为W试剂C处理3天前、后的H460细胞培养液，M代表 Marker。图帥，经试剂C处理3天后的C册-K1细胞、CHO-S细胞、H460细胞无支原体特异性条 带，证明支原体已被清除。
[0043] 实施例10细胞毒性试验 用3-(4,5-二甲基-2-嚷挫)-2,5-二苯基漠化四挫即M1T法对肥K-293T细胞活力进行计 量。将肥K-293T细胞培养于96孔板中，密度为1.5 X 1〇5 cell/well，W未做任何处理的细胞 作为空白对照，将试剂A、B、C、DWl :1000的稀释比例稀释，分别加入试验组细胞培养孔中， 每组做S个平行样。样品解育化，1化，1她，24h后，向各孔中各加的MTT溶液，解育4h 后，各加入15化1 DMS0充分溶解，振荡10分钟，使结晶充分溶解，最后在570nm下测吸光度。
[0044] MTT试验结果见图4,试剂A、B、C、D的实际使用浓度对HEK-293T细胞基本无毒性。
[0045] 实施例11比较试验 采用琼脂糖孔穴扩散法比较试剂A中各组分及其组合对大肠杆菌E.coli K12D31的抑 菌活性。接种K12D31于液体LB培养基，37°C 20化pm培养至对数生长期，按1%菌量加至融化 的LB琼脂糖培养基中巧5-60°C)，混匀后按15ml/皿铺于灭菌平皿。凝固后，在无菌条件下打 孔，按照20iU/孔的量加入待测的样品。置于37°C培养箱8小时，观察抑菌活性。结果见图5， 其中，孔1为空白对照，加入的是无菌水，孔2为2.5%的多肤溶液，孔3为0.85%的赖氨酸溶液， 孔4为0.09%的甲硫氨酸溶液，孔5为混合溶液(含2.5%的多肤和0.85%的赖氨酸），孔6为混合 溶液(含2.5%的多肤和0.09%的甲硫氨酸），孔7为试剂A。图5显示，试剂A中巧中组分的混合液 抑菌效果最佳。
[0046] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的 限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化， 均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种序列为SEQ ID NO: 1的多肽用于预防和清除哺乳动物细胞污染的用途。2. -种预防和清除哺乳动物细胞污染的试剂，其特征在于：所述试剂含有序列为SEQ ID NO: 1的多肽。3. 如权利要求2所述的试剂，其特征在于:所述的多肽含量为1.5%-15%。4. 如权利要求2所述的试剂，其特征在于:所述的多肽含量为2.5%-12.5%。5. 如权利要求2-4任一所述的试剂，还含有赖氨酸和甲硫氨酸。6. 如权利要求5所述的试剂，其特征在于:所述赖氨酸含量为0.85%-2.73%，所述甲硫氨 酸含量为〇·〇9%-1·2%。7. 如权利要求2-4、6所述的试剂用于清除和预防哺乳动物细胞培养中的支原体生长的 用途。8. 如权利要求5所述的试剂用于清除和预防哺乳动物细胞培养中的支原体生长的用 途。
【文档编号】C12N5/071GK106047796SQ201610672152
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年8月15日 公开号201610672152.5, CN 106047796 A, CN 106047796A, CN 201610672152, CN-A-106047796, CN106047796 A, CN106047796A, CN201610672152, CN201610672152.5
【发明人】凌建群, 余海, 赵玲
【申请人】江苏吉锐生物技术有限公司