沙雷氏菌脂肪酶突变体、重组表达转化子、酶制剂及应用

沙雷氏菌脂肪酶突变体、重组表达转化子、酶制剂及应用
【专利摘要】本发明涉及沙雷氏菌脂肪酶(SmL)分子改造所得的突变体、其基因和氨基酸序列，含有该突变体基因的重组表达质粒及重组表达转化子，重组酶制剂的制备方法，以及该酶制剂在地尔硫卓前体合成中的应用。与野生型沙雷氏菌脂肪酶相比，本发明的突变体活性显著提高，并保持了优异的立体选择性，在心血管病药物地尔硫卓的关键手性前体(–)?对甲氧苯基缩水甘油酸甲酯的工业生产中具有良好的应用前景。
【专利说明】
沙雷氏菌脂肪酶突变体、重组表达转化子、酶制剂及应用
技术领域
[0001] 本发明属于生物工程技术领域，具体设及一种沙雷氏菌脂肪酶的突变体、表达该 突变体的重组表达质粒及重组表达转化子、该脂肪酶突变体酶制剂的制备方法，W及该突 变体酶制剂在酶法拆分制备(-)-对甲氧苯基缩水甘油酸甲醋中的应用。
【背景技术】
[0002] 地尔硫卓是一个高选择性的巧通道阻滞剂，可W抑制巧离子通过血管平滑肌和屯、 肌细胞膜通道的运转，具有使屯、肌细胞激动一收缩解偶联和强效的扩张血管的作用。该药 具有良好的疗效，并且毒副作用小，广泛应用于屯、绞痛和高血压的长期治疗。采用化学一酶 法合成地尔硫卓可W简化合成路线、提高收率、降低成本，该法已广泛应用于工业化生产。 在该工艺中，一般采用脂肪酶选择性拆分（± )-对甲氧苯基缩水甘油酸甲醋[(± )-MPGM]获 得关键的单一构型手性中间体(-)-对甲氧苯基缩水甘油酸甲醋。
[0003] 地尔硫卓的化学-酶法生产工艺于上世纪首先在日本投产，田巧公司使用的专利 菌株为S.marcescens Sr41 8000,他们将该菌株的胞外脂肪酶LipA固定在膜反应器中用于 拆分消旋体，制备(-)-对甲氧苯基缩水甘油酸甲醋，产量为40kg(-)-MPGM/m2/年。
[0004] 本实验室W( ± )-MPGM为底物，从100多株不同微生物菌株中筛选到一株粘质沙雷 氏菌(S.marcescens 化 CU1010(中国专利化200410067046.1，保藏号 CGMCC 1219)，该菌株其 所产胞外脂肪酶能高度立体选择性水解拆分（± )-MPGM得到(2R，3S)-(-)-MPGM巧>100)。利 用PCR方法克隆了粘质沙雷氏菌CGMCC 1219胞外脂肪酶SmL基因。该基因全长1845bp，编码 614个氨基酸，与基因数据库中其它的粘质沙雷氏菌脂肪酶基因相比，在DNA水平有94%~ 96 %的同源性，在氨基酸水平有96 %~98 %的同源性。利用大肠杆菌化21 (DE3)作为宿主菌 株、pET-24a( + )作为表达载体，实现了该脂肪酶基因的表达。
[0005] 沙雷氏菌脂肪酶的应用中，由于酶的活性较低，因此酶用量大，导致反应液乳化严 重，产物分离困难。因此有必要通过蛋白质工程改造，提高沙雷氏脂肪酶的活性。

【发明内容】

[0006] 本发明的目的在于，通过蛋白质工程对沙雷氏菌脂肪酶SmL进行改造，得到活性提 高的突变体，用于拆分（±)-对甲氧苯基缩水甘油醋，制备地尔硫卓合成的关键手性前体 (-)-对甲氧苯基缩水甘油酸甲醋。与野生型沙雷氏菌脂肪酶SmL相比，通过蛋白质工程改造 得到的突变体的催化效率显著提高，从而可W减少酶蛋白的用量。
[0007] 本发明的目的可W通过W下技术方案来实现：
[000引技术方案之一:活性提高的沙雷氏菌脂肪酶突变体的获得
[0009]本发明所述的野生型沙雷氏菌脂肪酶SmL来源于沙雷氏菌ECU 1010,该菌株已保 存于中国普通微生物菌种保藏管理中屯、，编号为CGMCC 1219,已在中国专利 化200410067046.1中公开。所述脂肪酶SmL的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。基于已报道 的沙雷氏菌脂肪酶SmL的结构，选择底物结合口袋周围的氨基酸位点，进行饱和突变，通过 大量的筛选和验证，发现在SEQ ID No.2所示氨基酸序列的基础上对第315位的亮氨酸残 基、第271位的丝氨酸残基和第311位的色氨酸残基进行单点替换后，具有较高的脂肪酶活 性，在此基础上，通过饱和突变获得活性有显著提高的突变体。
[0010] 较佳地，SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第315位的亮氨酸残基替换为丝氨酸得到 的蛋白质（命名为SmU3i5s)，第271位的丝氨酸残基替换为苯丙氨酸得到的蛋白质(命名为 SmLs27iF)，第311位的色氨酸残基替换为甲硫氨酸得到的蛋白质(命名为SmUmiM)。相对于母 本，运=个突变体活性提高较为显著。
[0011] 在此基础上，对所获得的单点突变体进行了组合，获得了活性进一步提高的组合 突变体，也就是W下四种蛋白质：
[0012] (l)SEQ ID No.2所示氨基酸序列的315位亮氨酸替换为丝氨酸，同时271位丝氨酸 替换为苯丙氨酸，命名为SmLs271F/L31日S ;或，
[0013] (2)SEQ ID No.2所示氨基酸序列的315位亮氨酸替换为丝氨酸，同时311位色氨酸 替换为甲硫氨酸，命名为SmLw311M/L315S ;或，
[0014] (3)SEQ ID No.2所示氨基酸序列的271位丝氨酸替换为苯丙氨酸，同时311位色氨 酸替换为甲硫氨酸，命名为SmLs271F/W311M;或，
[0015] (4)SEQ ID No.2所示氨基酸序列的315位亮氨酸替换为丝氨酸，同时271位丝氨酸 替换为苯丙氨酸，同时311位色氨酸替换为甲硫氨酸，命名为SmLs271F/W311M/L315S。
[0016] 其中所述脂肪酶的活性测定采用比色法进行测定。在3mL比色皿中加入2.87mL憐 酸钟缓冲液化PB，lOOmM，pH 7.0)，加入10化L适当浓度的酶液，在30°C预保溫3min后，然后 加入30化对硝基苯酪下酸醋溶液（lOOmM，溶解于DMS0中），于30°C、405nm读取水解产物对硝 基苯酪的吸光度增长速率。在上述反应条件下，每分钟生成1.0皿〇1对硝基苯酪所需要的酶 量，定义为一个酶活力单位化)。
[0017] 技术方案之二：一种分离的核酸，所述核酸编码如技术方案一所述沙雷氏菌脂肪 酶突变体
[0018] 本发明所述核酸的制备方法为本领域常规制备方法，通过基因克隆技术获得编码 沙雷氏菌脂肪酶SmL突变体的核酸分子，或通过人工全序列合成的方法得到编码沙雷氏菌 脂肪酶SmL突变体的核酸分子。
[0019] 技术方案之一种包含上述核酸的重组表达质粒
[0020] 可通过本领域常规方法将本发明的沙雷氏菌脂肪酶SmL突变体核酸序列连接到合 适的载体上构建而成，优选载体为质粒祀T28a。较佳地，可由W下操作获得上述重组表达质 粒:将PCR扩增得到的核酸产物和质粒祀T28a用限制性内切酶EcoR I和化nd III进行双酶 切，回收酶切产物，经T4连接酶连接得到重组表达质粒。
[0021 ]技术方案之四：一种包含上述重组表达质粒的重组表达转化子
[0022] 可通过将本发明的重组表达质粒转化至宿主细胞中来构建所述重组表达转化子， 所转化述宿主细胞可W是本领域的各种常规宿主微生物，前提是能使所述重组表达质粒可 W复制，且其所携带脂肪酶SmL突变体基因可被有效表达。本发明优选宿主细胞为大肠杆 菌，更优选地为大肠杆菌化21 (DE3)或大肠杆菌D册a。
[0023] 技术方案之五:一种沙雷氏菌脂肪酶突变体酶制剂的制备方法
[0024] -种沙雷氏菌脂肪酶突变体酶制剂的制备方法，所述酶制剂可W是下列形式中的 任意一种：
[0025] (1)培养如权利要求6所述的重组表达转化子，离屯、得到重组表达转化子细胞;或，
[0026] (2)对获得的重组表达转化子细胞进行破碎，分离得到含有如权利要求1-3中任一 项所述重组沙雷氏菌脂肪酶突变体的粗酶液;或，
[0027] (3)对粗酶液进一步纯化得到的重组沙雷氏菌脂肪酶突变体的纯酶。
[0028] 所述重组表达转化子的培养条件为本领域常规的方法和条件，可W根据宿主类型 选择适当的条件，只要可W使重组表达转化子生长并且生产所述沙雷氏菌脂肪酶突变体即 可。
[0029] 其中所述沙雷氏菌脂肪酶突变体酶制剂制备方法较佳地为:将如技术方案四所述 重组表达沙雷氏菌脂肪酶突变体的重组大肠杆菌，接种至含50yg/mL硫酸卡那霉素的培养 基（蛋白腺5~lOg/L，酵母膏2~5g/L，化C1 5~lOg/L，抑7.0)中，30~40°C，160~200rpm 振荡培养至OD600为1.0~3.0。按0.8~2 % (v/v)的接种量接入装有lOOmL LB培养基(蛋白腺 lOg/L，酵母膏5g/L，化C1 lOg/L，抑7.0)的500mLS角瓶中，置于37°C、180巧m摇床振荡培 养，当培养液的OD600达到0.6时，加入终浓度为0.05~2mmol/L的异丙基-0-D-硫代半乳糖巧 (IPTG)作为诱导剂，15~30°C诱导12~24h后，将培养液离屯、，收集细胞，并用生理盐水洗涂 两次，获得含有重组沙雷氏菌脂肪酶突变体的重组表达大肠杆菌细胞。将获得的细胞悬浮 于lOmL的缓冲液中，超声破碎，离屯、收集上清液，即得到重组沙雷氏菌脂肪酶突变体的粗酶 液。
[0030] 进而对得到的粗酶液进行纯化，可W采用儀层析柱纯化的方法。将粗酶液上样到 儀层析柱上，用结合液洗脱杂蛋白，随后用洗脱液洗脱目标蛋白，根据聚丙締酷胺凝胶电泳 检测的结果收集纯化后的蛋白质。其中，结合液的配方:20mM憐酸钢缓冲液，500mM NaCl， 10mM咪挫，pH7.4;洗脱液的配方为:20mM憐酸钢缓冲液，500mMNaCl，500mM咪挫，pH7.4。
[0031] 技术方案之六:本发明的沙雷氏菌脂肪酶突变体在酶法拆分制备(-)-对甲氧苯基 缩水甘油酸甲醋中的应用
[0032] 将技术方案之五得到的重组沙雷氏菌脂肪酶突变体酶制剂，在有机-水两相反应 体系中，酶法拆分制备(-)-对甲氧苯基缩水甘油酸甲醋。反应条件按本领域此类反应的常 规条件进行选择。其中有机-水两相体系优选为甲苯/水体系，优选体积比为1/1，反应时间 为2~24h，较佳地，反应过程中间歇取样检测剩余(-)-对甲氧苯基缩水甘油酸甲醋的对映 体过量值(ees)，待ees〉99%时终止反应。甲苯有机相中底物（±)-对甲氧苯基缩水甘油酸甲 醋的浓度为100~250g/L，酶制剂的加入量为50~250U/g底物。
[0033] 本发明的所有试剂和原料均市售可得。本发明的积极进步效果在于：与野生型的 沙雷氏菌脂肪酶相比，本发明中的脂肪酶突变体具有更高的催化活性，并且维持了高的立 体选择性。使用本发明的脂肪酶突变体催化制备地尔硫卓合成(-)-对甲氧苯基缩水甘油酸 甲醋具有酶用量少，酶制剂成本低，反应时间短，产品收率高的显著优势，具有很强的工业 应用潜力。
【具体实施方式】
[0034] 下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。
[0035] 实施例1粘质沙雷氏菌CGMCC 1219脂肪酶(SmL)基因的克隆
[0036] 将野生沙雷氏菌(菌种保藏号:CGMCC No. 1219)在LB培养基中进行培养。采用酪氯 仿法提取沙雷氏菌的基因组，具体步骤如下：
[0037] 将培养得到的菌体离屯、，然后用生理盐水(0.85%，w/v)重悬，吸取1.5mL重悬液， 加入到1.5血EP管中，再次离屯、。加入50化L生理盐水于EP管中，加入适量陶瓷珠子(直径约 1mm，陶瓷珠总体积为溶液体积的1/3);将EP管放在振荡器上振荡5min后放在冰面上冰浴 15min，然后再在振荡器上振荡lOmin;离屯、，收集上清液；向上清液中加入50化L酪氯仿溶 液，振荡均匀后，14000巧m离屯、5min。然后吸取30化L上清液，再加入9(K)化无水乙醇，摇晃均 匀。-80°C放置20min后有DNA沉淀产生。离屯、，弃去上清液，用75% (v/v)乙醇洗涂沉淀;37°C 烘箱中放置约30min，烘干乙醇，最后将沉淀用50化TE bufferdOmM lYis-HCLlmM EDTA， pH 8.0)溶解，-20°C保存备用。
[0038] W提取的基因组作为模板，进行脂肪酶SmL基因的PCR扩增，成功得到大约1900bp 的目的片段。使用的引物如下：
[0039] 上游引物（SmkF): 5 ' -CCGGAATTCCCGCATACCAATAAC-3 ' 化 coR I)；
[0040] 下游引物（（SmkR) :5'-CCCAAGCTTTTAGGCCAACACCACC-3'（Hind III)。
[0041 ] PCR体系（50化）：Taqmix 2扣L，二甲基亚讽(DMSO)化L，基因组DNA约50ng，上游引 物化L，下游引物化L，di出0补足至50化。
[0042] PCR 反应程序：（1)94°C 预变性 6min;(2)95°C 变性 lmin;(3)58°C 退火 40sec;(4)72 。(:延伸2.5min;(5)步骤(2)~(4)共进行30个循环，最后72°C延伸10min，4°C保存PCR产物。
[0045] 37°C酶切化，酶切产物通过凝胶电泳纯化，切胶回收目的片段和质粒。[0046] 将纯化回收的PCR片段与祀T28a在16°C连接过夜。体系如下：
[0043] 将PCR扩增得到的DNA片段与质粒祀T28a用EcoR iMind III进行双酶切。体系如 下：
[0044]
[0047]
[004引取10化酶连产物用化Cl2法转化1(K)化大肠杆菌D册a感受态细胞，并均匀涂布含有 50yg/血硫酸卡那霉素的LB琼脂平板。37°C过夜培养后，菌落PC閲金证阳性克隆，挑选单克隆 送上海桑尼生物科技有限公司进行测序，得到如SEQ ID No.1所示核酸序列，其编码氨基酸 序列如SEQ ID齡.2所示。将获得的重组大肠杆菌接种至含504旨/1111^硫酸卡那霉素的1^8培养 基中，37°C振荡培养过夜，然后用质粒抽提试剂盒提取获得重组表达质粒祀T28a-SmL，进一 步转化宿主大肠杆菌化21，得到重组大肠杆菌E.coli化21/pET28a-SmL。
[0049] 实施例2脂肪酶SmL的单点饱和突变
[0050] W已经公布的沙雷氏菌脂肪酶的晶体结构(PDB:2QUA)作为模板，利用在线建模工 具Swiss-Model进行同源建模。W酶促反应底物（ + )-对甲氧苯基缩水甘油酸甲醋[( + )- MPGM]作为配体小分子，W同源建模得到的沙雷氏菌脂肪酶SmL的模型S维结构为基础，用 AutoDock软件进行分子对接。W底物为中屯、，:8A的范围内，选取18个氨基酸位点，分别为： Y29、T143、D161、G165、F166、H206、L208、A237、S238、P239、V258、A261、L262、L267、S271、 W311、L315、Y319,分别进行饱和突变。
[0051 ] W质粒pET28a作为载体，大肠杆菌化21作为宿主，构建上述位点的NNK饱和突变 库。W位点L315为例，引物设计如下：
[0化2]上游引物：5 ' -ggctgtcgcacNNKccgttcttcta-3 '
[0化3 ]下游引物：5 ' -1:agaagaacggMNNgtgcgacagcc-3 '
[0054] 其中:N代表核巧酸A/T/C/G;K代表核巧酸C/G;M代表核巧酸G/C;
[0055] 其他所有位点的引物序列见表一。
[0056] 表一突变位点的引物序列
[0化7]
[005引 PCR反应体系（50化）如下：Prime STAR?HS 2扣L，DMSO化L，重组质粒祀T28a-SmL 约50ng，P;rimer F 化UPrimer R 化L，di出0补足至50化。
[0059] PCR 反应程序：（1)94。(：预变性6111111;(2)98。(：变性1〇36。；（3)58。(：退火1〇36。；（4)72 °C延伸7min;(5)步骤(2)~(4)共进行30个循环，最后72°C延伸lOmin。
[0060] 将PCR产物用限内酶化n I在37°C消化处理化后，转化E.coli化21感受态细胞，并 均匀涂布含有50yg/mL硫酸卡那霉素的琼脂转化平板，37°C过夜培养。在96孔深孔板的每个 孔中加入40化L新鲜LB培养基。将转化平板上的转化子用牙签挑入96孔深孔板中，于37°C， 22化pm摇床中培养过夜。然后将一级板中的50化菌液接入二级96孔深孔板，于37°C，22化pm 摇床中再培养2~化后，加入IPTG(终浓度0.5mM)进行诱导，然后16°C继续培养1她。之后4 °C、400化pm离屯、15min，弃去培养基，放入-70°C冰箱冷冻。从冰箱中拿出菌体冻融后，加入 200化溶菌液(750mg溶菌酶溶解于1L BES缓冲液(5mM，pH 7.2)中），縱满振荡混匀，37 °C静 置化。4°C、400化pm再次离屯、20min，获得的细胞破碎上清液进行活力测定分析。
[0061] 用标准底物对硝基苯酪下酸醋(pNPB)对饱和突变库进行初筛，筛选反应体系为： 170化KPB缓冲液（100mM，pH 7.0)，加20化酶液，再加10化底物（lOOmM P肥B的DMS0溶液）， 震荡混匀，读取405nm处吸光值的增长。筛选活性有明显提高的克隆子，经复筛比较，对活性 最高的S个克隆进行测序，确定突变为5271。、13155、胖31謹。将获得的^个单点突变体分别 命名为 SmLs27iF，SmU315 S，SmLw311M。
[0062] 实施例3SmL单点突变体重组表达转化子细胞W及粗酶的制备
[0063] 将含有单点突变重组表达质粒的重组大肠杆菌，接种至含50yg/mL硫酸卡那霉素 的LB培养基中，37°C振荡培养至OD600达到1.2，按1 % (v/v)的接种量接入装有lOOmL LB培养 基的500mLS角瓶中，置于37°C、ISOrpm摇床振荡培养，当培养液的0〇6日日达到0.8时，加入终 浓度为〇.5mmol/L的异丙基-0-D-硫代半乳糖巧（IPTG)作为诱导剂，16°C诱导1她。培养液 400化pm离屯、20min，并用生理盐水洗涂两次，获得静息细胞，即为沙雷氏菌脂肪酶SmL单点 突变体的重组表达转化子细胞。将获得的细胞悬浮于10血的KPB缓冲液（1 OOmM，pH 8.0)中， 超声破碎，1200化pm离屯、收集上清液，即得到重组沙雷氏菌脂肪酶SmL单点突变体的粗酶 液，对粗酶液进行脂肪酶活力测定，结果见表二，与母本SmL相比，单点突变体的粗酶液活力 有显著提局。
[0064] 表二单点突巧体与野牛脂肪酶对dWB的谢酶活力比较
[00 化]
[0066]
[0067] 实施例4沙雷氏菌脂肪酶SmL的组合突变
[0068] 在单点饱和突变获得突变点S271F、L315S和W311M的基础上，分别将L315S、S271F 和胖31道运立个突变位点进行组合，进一步得到组合突变体SmLs271F/W311M、SmLs271F/L315S、 SmLw311M/L315S 和 SmLs271F/W311M/L3化S。
[0069] 将含有组合突变重组表达质粒的重组大肠杆菌，接种至含50iig/mL硫酸卡那霉素 的LB培养基中，37°C振荡培养至OD600达到1.2，按1 % (v/v)的接种量接入装有lOOmL LB培养 基的500mLS角瓶中，置于37°C、180巧m摇床振荡培养，当培养液的0〇6日日达到0.別寸，加入终 浓度为〇.5mmol/L的异丙基-0-D-硫代半乳糖巧（IPTG)作为诱导剂，16°C诱导1她。培养液 400化pm离屯、20min，并用生理盐水洗涂两次，获得静息细胞，即为沙雷氏菌脂肪酶SmL组合 突变体的重组表达转化子细胞。将获得的细胞悬浮于10血的KPB缓冲液（1 OOmM，pH 8.0)中， 超声破碎，12000rpm离屯、收集上清液，即得到重组沙雷氏菌脂肪酶SmL组合突变体的粗酶 液，对粗酶液进行脂肪酶活力测定，结果见表=，组合突变体的粗酶液活力提高更显著。
[0070] 表S组合突变体与野生脂肪酶SmL对pWB的粗酶活力比较
[0071]
[0072] 头砸例的少'亩氏菌化肋踞細L天雙体的鄉踞制爸
[0073] 对实施例3和4中得到的粗酶进行纯化，具体方法如下：纯化所用的儀柱(柱体积 5血)预先用缓冲液A(20mM憐酸钢，500mM化CiaOmM咪挫，pH 7.4)平衡，流速设为511117111111， 待平衡后上样，用6倍柱体积(30mL)的结合液洗脱亲和柱中的未结合蛋白，再用20倍柱体积 (lOOmL)的缓冲液B (20mM憐酸钢，500mM化C1，500mM咪挫，pH 7.4)进行梯度洗脱。收集含目 的蛋白的洗脱液，透析过夜去除其中的咪挫。然后用截留分子量为lOkDa的超滤管离屯、进行 蛋白浓缩，所得蛋白质浓缩液加入终浓度为10% (w/v)的甘油，分装后于-80°C环境中长期 保存，备用。对野生型脂肪酶SmL和突变体的纯酶进行比活力测定，结果如表四所示。与母本 SmL相比，突变体的比活显著提高。
[0074] 表四：突变体与野生脂肪酶对pWB的纯酶活力比较
[0075]
[0076] 实施例6-12重组脂肪酶SmL突变体纯酶拆分（± )-MPGM
[0077] 反应体系：甲苯相(底物浓度500mM) 5mL
[0078] 水相（Tris-HCl，100mM，pH8.0，含l%Tween-80) 5mL
[0079] 反应器中依次加入5mL溶有500mM(±)-MPGM的甲苯，5血Tris-HCl缓冲液（lOOmM, pH 8.0)，30°C保溫lOmin。之后分别加入0.5mg如实施例5制备的纯酶，30°C磁力揽拌反应， pH控制在8.0左右（用2M氨水进行抑调节），每半小时取样。反应液高速离屯、3min，取上清lOii L，用乙酸乙醋稀释100倍，加入无水硫酸钢干燥，过滤去除蛋白，采用HPLC检测反应的转化 率和对映体过量值，色谱柱为OJ-H柱，流动相为：正己烧/异丙醇=60:40，流速0.8ml/min， 紫外检测，检测波长为254nm。结果如表五。
[0080]表五:沙雷氏菌脂肪酶突变体拆分（±)-MPGM
[。0531 1
[C
[0083] 实施例13重组突变体SmLs27iF/miM/L3i5s整细胞用于拆分（± )-MPGM
[0084] 反应体系：甲苯相(底物浓度500mM) 5mL
[0085] 水相（Tris-HCl，100mM，pH8.0，含l%Tween-80) 5mL
[0086] 反应器中依次加入5mL溶有500mM(±)-MPGM的甲苯，5血Tris-HCl缓冲液（lOOmM, pH 8.0)，30°C保溫1 Omin，之后加入20mg湿细胞(2.抓/mg湿细胞），30°C磁力揽拌反应，pH控 制在7.0左右（用2M氨水进行抑调节），每半小时取样。反应液高速离屯、3min，取上清10化，用 乙酸乙醋稀释100倍，加入无水硫酸钢干燥，过滤去除蛋白，采用HPLC检测反应的转化率和 对映体过量值，色谱柱为0J-H柱，流动相为:正己烧/异丙醇=60:40，流速0.8ml/min，紫外 检测，检测波长为254nm。反应lOh后，反应转化率为50.1%，剩余(-)-1?61的光学纯度超过 99%。
[0087] 实施例14突变体SmLs27iF/w3iiM/L3i日S的粗酶液用于拆分（± )-MPGM
[008引反应体系：甲苯相(底物浓度500mM) 5mL
[0089] 水相（Tris-HCl，100mM,pH 8.0,含l%Tween-80) 5mL
[0090] 反应器中依次加入5mL溶有500mM(±)-MPGM的甲苯，5血Tris-HCl缓冲液（lOOmM, pH 8.0)，30°C保溫lOmin。之后加入1血如实施例4制备的突变体S血S271F/W311M/L31日S的粗酶液， 30°C磁力揽拌反应，pH控制在9.0左右（用2M氨水进行pH调节），每半小时取样。反应液高速 离屯、3min，取上清10化，用乙酸乙醋稀释100倍，加入无水硫酸钢干燥，过滤去除蛋白，采用 HPLC检测反应的转化率和对映体过量值，色谱柱为0J-H柱，流动相为:正己烧/异丙醇=60: 40，流速0.8ml/min，紫外检测，检测波长为254加1。反应化后，反应转化率为49.8 %，剩余 (-)-MPGM的光学纯度超过99%。
[0091] 实施例15突变体SmLs27iF/miM/L3i5s用于制备光学纯的(-)-MPGM
[0092] 在化S口烧瓶中，加入104. lg( ± )-MPGM和甲苯1.化，机械揽拌至底物完全溶解。 然后加入900mL Tris-HCl缓冲液（100mM，pH 8.0)和lOOmL如实施例4制备的突变体 SmLs27iF/w3iiM/L3i日s的粗酶液，30°C保溫lOmin。开动机械揽拌，揽拌转速20化pm，用自动电位滴 定仪滴加1.0M的NaO田容液，控制抑8.0左右。反应化后，反应转化率50.4%，终止反应，用分 液漏斗分离有机相，水相用500mL甲苯萃取两次。合并有机相，依次用500mL的5 %亚硫酸氨 钢溶液、5 %碳酸氨钢溶液、饱和食盐水洗涂，然后用无水硫酸儀干燥。抽滤，滤液旋转蒸发 回收甲苯，得到微黄色固体50.4g，然后在甲醇中重结晶得到46.Og光学纯的无色晶体，收率 为 44.2%。
[0093] 对比例1重组脂肪酶SmL纯酶拆分（± )-MPGM
[0094] 反应体系W及酶的用量同实施例6-12。反应器中依次加入5mL溶有500mM(±)- MPGM的甲苯，5mL lOOmM lYis-HCl缓冲液(pH 8.0)，30°C保溫lOmin。之后加入0.5mg如实施 例5制备的重组脂肪酶SmL的纯酶，30°C磁力揽拌反应，抑控制在8.0左右（用2M氨水进行pH 调节），每隔二小时取样。反应液高速离屯、3min，取上清10化，用乙酸乙醋稀释100倍，加入无 水硫酸钢干燥，过滤去除蛋白，采用HPLC检测反应的转化率和对映体过量值，色谱柱为0J-H 柱，流动相为：正己烧/异丙醇=60:40，流速0.81111/1]1；[]1，紫外检测，检测波长为254皿。反应 1化后，反应转化率仅为30%，剩余(-)-MPGM的光学纯度仅有41%。
[0095] 与实施例6-12相比，本发明所述沙雷氏菌脂肪酶SmL的突变体催化拆分（± )-MPGM 的效果显著好于母本。使用突变体酶在较短时间内，反应的转化率即可达到50%左右，获得 接近光学纯的剩余底物，而相同蛋白浓度的条件下，母本酶由于活性低，因此转化率低，剩 余底物的光学纯度差，达不到应用要求。
[0096] 上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。 熟悉本领域技术的人员显然可W容易地对运些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般 原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领 域技术人员根据本发明的掲示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的 保护范围之内。




【主权项】
1. 一种活性提高的沙雷氏菌脂肪酶突变体，其特征在于，其是对如SEQ ID No.2所示氨 基酸序列的第271位、第311位、第315位氨基酸经过一个或多个氨基酸替换后形成的新氨基 酸序列构成的蛋白质。2. 根据权利要求1所述的一种沙雷氏菌脂肪酶突变体，其特征在于，其是对如SEQ ID No. 2所示氨基酸序列的第271位、第311位、第315位氨基酸经过一个氨基酸替换后形成的新 氣基酸序列的蛋白质，具有如下序列： (1) SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第271位丝氨酸替换为苯丙氨酸;或， (2) SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第311位色氨酸替换为甲硫氨酸;或， (3) SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第315位亮氨酸替换为丝氨酸。3. 根据权利要求1所述的一种沙雷氏菌脂肪酶突变体，其特征在于，其是对如SEQ ID No. 2所示氨基酸序列的第271位、第311位、第315位氨基酸经过多个氨基酸替换后形成的新 氣基酸序列的蛋白质，具有如下序列： (1) SEQ ID No.2所示氨基酸序列的315位亮氨酸替换为丝氨酸，同时271位丝氨酸替换 为苯丙氨酸;或， (2) SEQ ID No.2所示氨基酸序列的315位亮氨酸替换为丝氨酸，同时311位色氨酸替换 为甲硫氨酸;或， (3) SEQ ID No.2所示氨基酸序列的271位丝氨酸替换为苯丙氨酸，同时311位色氨酸替 换为甲硫氨酸;或， (4) SEQ ID No.2所示氨基酸序列的315位亮氨酸替换为丝氨酸，同时271位丝氨酸替换 为苯丙氨酸，同时311位色氨酸替换为甲硫氨酸。4. 一种分离的核酸，其特征在于，所述的核酸是编码如权利要求1-3中任一项所述的沙 雷氏菌脂肪酶突变体的核酸分子。5. -种重组表达质粒，其特征在于，含有如权利要求4所述的核酸。6. -种重组表达转化子，其特征在于，含有如权利要求5所述的重组表达质粒。7. -种重组沙雷氏菌脂肪酶制剂，其特征在于，所述酶制剂是下列形式中的任意一种： (1) 培养如权利要求6所述的重组表达转化子，离心得到重组表达转化子细胞;或， (2) 对获得的重组表达转化子细胞进行破碎，分离得到含有如权利要求1-3中任一项所 述重组沙雷氏菌脂肪酶突变体的粗酶液;或， (3) 对粗酶液进一步纯化得到的重组沙雷氏菌脂肪酶突变体的纯酶。8. -种如权利要求1-3中任一项所述重组沙雷氏菌脂肪酶突变体在制备(-)-对甲氧苯 基缩水甘油酸甲酯中的应用，其特征在于，使用如权利要求7所述重组沙雷氏菌脂肪酶突变 体酶制剂在有机溶剂和水相缓冲液构成的两相体系中催化（± )_对甲氧苯基缩水甘油酸甲 酯的酶法拆分，然后从反应混合物中分离剩余的高光学纯度的(-)_对甲氧苯基缩水甘油酸 甲醋。9. 根据权利要求8所述重组沙雷氏菌脂肪酶突变体的应用，其特征在于，所述的有机溶 剂为甲苯，所述水相缓冲液的pH为7.0~9.0。
【文档编号】C12N15/55GK106047837SQ201610379653
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年6月1日
【发明人】许建和, 陈科材, 李春秀, 陈琦, 潘江
【申请人】华东理工大学