一种交联卤醇脱卤酶聚集体的制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种交联卤醇脱卤酶聚集体的制备方法，属于生物化工领域。本发明在冰浴条件下，向卤醇脱卤粗酶液中添加了牛血清白蛋白制剂作为保护剂，以硫酸铵溶液为沉淀剂，戊二醛作为交联剂制备交联卤醇脱卤酶聚集体；其中卤醇脱卤粗酶液通过构建重组菌进行原核体外诱导表达制备。本发明实验操作简单，成本低廉，制备出的交联卤醇脱卤酶聚集体具有较高的机械强度、较好的耐热性并可实现重复利用，经实验证实,最优制备条件下固定化酶量可达总酶量的80％以上，交联卤醇脱卤酶聚集体酶活力为470.2U/g，与游离粗酶的酶活相比，相对酶活力可达91.36％，可广泛应用于有机卤化物等环境污染物的降解及手性药物合成过程中的催化。
【专利说明】
一种交联卤醇脱卤酶聚集体的制备方法
技术领域
[0001]本发明属于生物化工领域，具体公开了一种交联卤醇脱卤酶聚集体的制备方法。
【背景技术】
[0002]随着现代社会化工业的飞速发展，大量的工业废物不正当排出，以及人工合成卤化物在化工合成和农业上的广泛应用，使得有机卤化物成为当今重要的环境污染物之一。自然界中，有机卤化物主要存在于土壤和地下水中，具有很强的稳定性，绝大部分异生卤化物的自然降解能力很差，可在自然界中存在百年之久。传统的物理化学方法的治理效果往往较低，且容易造成二次污染，因此，应用生物降解该类化合物已成为国内外研究的热点。
[0003]生物降解是指利用微生物产生的酶对有毒污染物进行有效降解的过程。由于生物降解的方法相对传统的化学方法降解的效率增高，且引起的污染较低，已成为当今世界新一代降解有毒污染物的方法。
[0004]齒醇脱齒酶(HheC)于1999年发现于放射形土壤杆菌Agrobacterium rad1bacterADl中，参与了卤醇(ECH)，I，3_二氯-2-丙醇(I，3-DCP)等在内的许多重要环境含卤化合物的生物降解途径，在污水治理方面发挥了巨大的作用。此外，卤醇脱卤酶的另外一个应用是它可以催化邻卤醇与环氧化物之间的转化反应，而且可以高选择性地催化接受卤离子以及其它一系列非自然亲核试剂所介导的环氧化物开环反应，因此它可以用来催化合成一些具有光学纯的化学中间体，这些化合物中间体可以应用到制药和生物活性基团的合成过程中，这使得它具有很高的应用价值。
[0005]众所周知，酶应用领域存在的一个主要问题是:缺少在广泛的pH和温度范围内保持稳定，对有机溶剂具有高度耐受性的固定化酶;且固定化使用的试剂和载体成本高昂、固定效率偏低，在工业上具有应用价值的酶在真正投入工业化应用时受到了限制。此外，卤醇脱卤酶(HheC)而言存在的巨大问题是获取较难，仅由细菌培养表达纯化得到的酶量很小，所以高纯度的卤醇脱卤酶(HheC)溶液使用成本非常高。在实际应用时常常需要在反应之后将酶与反应体系分离，因此，酶的可回收性需要特别关注。综上所述，进一步开发更简便、更适用的固定化方法以提高卤醇脱卤酶(HheC)的性能以及应用范围是生物化工领域追求的目标。
[0006]目前，尚没有一种通用的方法适用于所有酶的固定，而且固定化酶对活性和稳定性的改变通常都是矛盾的，也就是说活性被提高的同时换来了较低的稳定性，且回收重复使用几乎是不可能的；相反稳定性得到改善往往活性就会受到限制。试图通过一种方法提高酶的所有性能几乎是无法做到的，因此针对酶的固定化，探索和优化固定化酶的载体和方法将一直受到重视，同时也应该根据各自不同的需要有针对性地对其中的一些性质进行改善。
[0007]交联酶聚集体(CLEA)是最近几年受到研究者们的关注的一种新型的无载体固定化技术。该技术采用物理方法使酶分子聚集、再经交联剂交联而成，具有操作简单、可采用多酶反应体系、具有较高的酶活回收率和生产能力及较好的稳定性等优点被广泛应用于蛋白质的分离和纯化及酶固定化等方面。
[0008]因此，使用交联酶聚集体技术对卤醇脱卤酶(HheC)及多酶体系进行固定化，并在此基础上优化固定化条件以得到稳定性好，活性保持久，回收率及回收次数高的卤醇脱卤酶的固定化酶体系具有现实意义。
【发明内容】
[0009]针对目前制备固定化卤醇脱卤酶(HheC)存在的不足，本发明公开了一种运用新型无载体固定化技术一一交联酶聚集体(CLEAs)技术对卤醇脱卤酶进行高效固定化的方法。本发明在冰浴条件(0°C)下，在卤醇脱卤酶的粗酶液中先加入牛血清白蛋白作为保护剂，混合均匀后，加入质量分数为50%?90%的饱和硫酸铵溶液进行沉淀分离形成卤醇脱卤酶聚集体，然后加入戊二醛交联固定卤醇脱卤酶聚集体。经实验证实，本发明固定化的酶量回收率达84 %以上，交联的固定化酶的酶活力回收达90 %以上。
[0010]为实现上述技术效果，本发明采用以下技术方案:
[0011]—种交联卤醇脱卤酶聚集体的制备方法，包括以下步骤:
[0012]步骤A:制备卤醇脱卤粗酶液；
[0013]步骤B:聚集体的形成;冰浴条件下，在步骤A制得的粗酶液中加入牛血清白蛋白形成混合液，然后加入质量分数为50 %?90 %的饱和硫酸铵溶液对所述混合液进行沉淀分离，得到混合体系；其中，所述牛血清白蛋白与卤醇脱卤酶的质量比为I?20:10，所述饱和硫酸铵溶液与所述混合液体积比为2.5?15:1;
[0014]步骤C:聚集体的交联;在步骤B所得混合体系中加入戊二醛交联卤醇脱卤酶，优选地，戊二醛的浓度0.1%?3.0%，交联反应时间为2?12小时;交联反应完成后进行离心处理，离心所得沉淀经磷酸盐缓冲液反复冲洗至清洗液检测不出任何酶活力，制得交联卤醇脱卤酶聚集体。
[0015]目前，野生型卤醇脱卤酶存在活性低和选择性较差的缺陷，使其应用受到限制。通过基因工程和分子定向进化技术，改造天然的卤醇脱卤酶，并在大肠杆菌表达系统中高效表达，可以提高卤醇脱卤酶的酶活性、底物选择性和产量。因此本发明所述步骤A采用构建重组大肠杆菌制备粗酶液，具体制备步骤如下:
[0016]步骤Al:将重组卤醇脱卤酶基因转入宿主细胞E.coli MC1061中，得到重组菌E.coli MC1061；
[0017]步骤A2:将步骤Al制得的重组菌E.coli MC1061进行原核体外诱导表达，得到诱导菌，对诱导菌进行离心处理，得到菌体，然后加入磷酸盐缓冲液，并进行超声破碎，再进行离心处理，收集上清，制得粗酶液。
[0018]其中，所述步骤Al可以将野生型卤醇脱卤酶的基因克隆到表达载体pBAD-TLX中，即能得到重组卤醇脱卤酶基因；
[0019]其中，所述步骤A2中重组菌E.coli MC1061进行原核体外诱导表达是通过控制菌体溶液在600nm的波长处吸光度值即0D_以调节粗酶液中卤醇脱卤酶的浓度，卤醇脱卤粗酶液的浓度优选为18?25mg/ml，具体采用如下操作步骤实现:
[0020]将重组菌E.coliMC1061单克隆接种到含有浓度为100yg/ml的氨苄青霉素的LB液体培养基中，放于温度为37 0C、转速为180rpm的摇床中过夜培养，待细菌生长至OD6qq值为1.5?2.5时，在无菌条件下取占总体积I %的菌体进行大量培养，待细菌生长至OD6qq为0.6?0.8时，加入阿拉伯糖诱导剂诱导，使其在溶液中浓度为50yg/ml，待菌体生长至OD6qq值为
2.2?2.9时，进行离心处理，收集菌体，采用磷酸盐缓冲液重悬菌体后进行超声破碎，进行离心处理，收集上清液，最终制得卤醇脱卤酶浓度为18?25mg/ml的粗酶液。
[0021]本发明通过将卤醇脱卤酶基因序列转入宿主细胞大肠杆菌E.coli MC1061中，得到重组菌，再通过诱导表达、超声破碎、离心处理、取上清得到粗酶液;在上述粗酶液中加入牛血清蛋白作为聚集剂及保护剂，加入硫酸铵溶液进行沉淀并聚集，形成卤醇脱卤酶酶聚集体，再加入戊二醛进行交联并保持酶聚集体的构象，从而制备得到交联卤醇脱卤酶聚集体。
[0022]与现有技术相比，本发明具有如下有益效果:
[0023]1.本发明采用联酶聚集体法(CLEAs)技术得到的交联卤醇脱卤酶聚集体，具有较高的机械强度，较好的热稳定性；由后文中实施例可以看出:最优制备条件下固定化酶(交联卤醇脱卤酶聚集体)量可达总酶量的84.29% ,交联卤醇脱卤酶聚集体酶活力为470.2U/g，与游离粗酶的酶活相比，相对酶活力可达91.36%，交联卤醇脱卤酶聚集体对I，3-二氯_
2-丙醇(I，3-DCP)的降解能力达到:Ig蛋白每分钟降解I，3-二氯-2-丙醇高达470.2ymol。
[0024]2.本发明运用交联酶聚集体法(CLEAs)技术可采用粗酶液进行固定化，并可实现反复利用，具有较高的重复利用率，本发明操作简单，成本低廉，适用于大规模工业生产。
[0025]3.由于卤醇脱卤酶(HheC)能实现将环境中有毒难降解的有机卤化物高效降解，得到毒性较低的环氧化物，或者后续再结合环氧化物水解酶(EchA)的作用，将该类有机卤化物彻底降解为无毒的甘油，因此，制备出酶活性高，稳定性高的固定化卤醇脱卤酶是对有毒的有机卤化物的处理实现新的跨越，对我们赖以生存的环境具有重大意义。
[0026]4.卤醇脱卤酶(HheC)可以用来合成光学纯的中间体，这些化合物在各类手性合成的合成领域中具有无法比拟的优越性。因此光学纯的环氧化物及其前体邻卤醇在有机合成中具有重要的应用价值，固定化卤醇脱卤酶可广泛应用于手性药物合成过程中的催化。
【附图说明】
[0027]图1是本发明中重组卤醇脱卤酶基因重组表达示意图；
[0028]图2是实验室前期工作卤醇脱卤粗酶最优条件表达图；其中，泳道1，2，3分别为:蛋白质marker，卤醇脱卤酶沉淀，卤醇脱卤酶上清；
[0029]图3是本发明一种【具体实施方式】下不同硫酸铵溶液浓度对交联卤醇脱卤酶聚集体酶活性影响图；
[0030]图4是本发明一种【具体实施方式】下不同温度对交联卤醇脱卤酶聚集体酶活性影响图；
[0031]图5是本发明一种【具体实施方式】下不同体积比的沉淀剂对交联卤醇脱卤酶聚集体酶活性影响图；
[0032]图6是本发明一种【具体实施方式】下不同牛血清蛋白(BSA)浓度对交联卤醇脱卤酶聚集体酶活性影响图；
[0033]图7是本发明一种【具体实施方式】下不同浓度的戊二醛对交联卤醇脱卤酶聚集体酶活性影响图；
[0034]图8是本发明一种【具体实施方式】下不同的交联时间对交联卤醇脱卤酶聚集体酶活性影响图；
[0035]图9是本发明一种【具体实施方式】中测定最优制备条件下交联卤醇脱卤酶聚集体的机械强度的结果图；
[0036]图10是本发明一种【具体实施方式】中测定最优制备条件下交联卤醇脱卤酶聚集体的回收率的结果图；
[0037]图11是本发明一种【具体实施方式】中测定最优制备条件下交联卤醇脱卤酶聚集体的热稳定性的结果图。
【具体实施方式】
[0038]以下结合说明书附图和实施例对本发明进行进一步说明:
[0039]实施例1:
[0040]—种交联卤醇脱卤酶聚集体的制备方法，包括以下步骤:
[0041]步骤A:制备卤醇脱卤粗酶液；具体采用采用构建重组大肠杆菌的方式制备粗酶液，其步骤如下:
[0042]Al:将重组卤醇脱卤酶基因转入宿主细胞E.coli MC1061中，得到重组菌E.col iMC1061，如图1所示为重组卤醇脱卤酶基因重组表达示意图；
[0043](I)感受态的制备:
[0044]在无菌条件下，将宿主菌E.coli MC1061在固体LB培养基上划线生长，37°C倒置过夜培养。从菌体平板上挑取一单克隆体，接种到新鲜LB液体培养基中，在温度为37°C，速率为180rpm的摇床上培养约5小时，待006()() = 0.3?0.6，取11111菌液在转速为12000印111的条件下离心I分钟，去掉离心所得上清;然后加入预冰冷的Iml浓度为0.lmol/L的CaCl2,涡旋混匀后冰浴30分钟，再在转速为12000rpm的条件下离心I分钟，去掉离心所得上清，然后加入10yL预冰冷的浓度为0.lmol/L的CaCl2，吹打悬浮细胞，制得的细胞悬浮液用于转化实验；
[0045](2)质粒的转化
[0046]向感受态细胞中加入IyL质粒，轻微混匀后冰浴30分钟，在42°C水浴热击60秒后迅速取出冰浴2?3分钟，加入900yL新鲜LB培养基，在温度为37°C，速率为180rpm的摇床上复苏I小时;复苏完成后于转速为12000rpm的条件下离心I分钟，弃掉离心所得的900yL上清，然后将余液吹打均匀；
[0047]制备含氨苄青霉素(Amp)浓度为lOOyg/ml的选择性固体培养基平板多块，吸取所述余液15yL加入选择性培养基平板上，用涂布器涂布均匀;将平板放置在37°C培养箱中倒置过夜培养，得到重组卤醇脱卤酶基因已转入宿主细胞大肠杆菌E.coli MC1061的重组菌E.coli MC1061。
[0048]A2:重组卤醇脱卤酶的诱导表达
[0049]菌体的表达主要分为小量扩增和大量表达两个步骤:
[0050](I)小量扩增:无菌条件下，从平板上挑取单克隆菌体接种到20ml含有浓度为100μg/ml的氨苄青霉素(Amp)的灭菌LB液体培养基中，在温度为37°C，速率为180rpm的摇床上过夜培养，待菌体浓度OD6qq为0.8?1.0时，取出培养基用于大量表达；
[0051 ] (2)大量表达:无菌条件下，取小量扩增菌体3ml接种到含有浓度为100yg/ml的氨苄青霉素的300ml的灭菌LB液体培养基中，根据实验室前期工作，采用优化后条件:置于温度为25°C，速率为180rpm的摇床培养。当细菌生长至OD6qq为0.8时，加入阿拉伯糖诱导剂诱导，混匀后体系中阿拉伯糖诱导剂浓度为50ug/ml;待菌体生长到OD6qq为2.5时，取出适量进行蛋白电泳的检测，如图2所示，每个样品采用30ml菌液离心得到菌体量，其表达量达到50%以上;余液在转速为4000rpm的条件下离心15分钟后保存于-40°C待用以制备卤醇脱卤酶粗酶液。
[0052]将上述离心处理后保存的菌体重悬于浓度为50mmol/L的磷酸盐缓冲液中，超声破碎直至液体透光，分装后于温度为4°C，13000rpm条件下，离心60分钟，在本实施例中，取部分上清和沉淀进行SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳以检测目的蛋白。从图2中可看出目的蛋白在28kDa左右，本实施例成功获得了可溶性目的蛋白即粗酶液。离心所得上清即为卤醇脱卤酶粗酶液，冰浴放置，待用。
[0053]步骤B:聚集体的形成;采用考马氏亮蓝法测蛋白浓度测定步骤A制得粗酶液浓度为20mg/ml，冰浴条件下，取所述粗酶液Iml，加入16mg牛血清白蛋白粉末形成混合液，冰浴条件下(0°C)搅拌15分钟，缓慢滴加7.5ml质量分数为70%的饱和硫酸铵溶液对所述混合液进行沉淀分离，搅拌I小时，形成混合体系；
[0054]步骤C:聚集体的交联;在步骤B所得混合体系中加入戊二醛使得混合体系中戊二醛浓度为0.75%，交联反应6小时，形成悬液;将所述悬液在温度为4°C，转速为4000rpm的条件下离心15分钟，将离心所得沉淀重悬于20ml浓度为50mmol/L的磷酸盐(PBS)缓冲液中悬浮洗脱30分钟，反复冲洗至清洗液检测不出任何酶活力，将最终液体在温度为4°C，转速为4000rpm的条件下离心15分钟，收集所得沉淀，所述沉淀为制得的交联卤醇脱卤酶聚集体。
[0055]实施例2:
[0056]不同浓度沉淀剂(硫酸铵溶液)对交联卤醇脱卤酶聚集体的酶活影响:
[0057]本实施例采用以下反应体系，以硫酸铵溶液浓度为单一变量，完成五组固定化卤醇脱卤酶的平行实验:
[0058]在冰浴条件下，取五组浓度为20mg/ml的卤醇脱卤粗酶液Iml，均加入20mg牛血清白蛋白(BSA)粉末搅拌15分钟，在五组混合液中分别缓慢滴加5ml浓度为50 %，60 %，70 %，80% ,90%的硫酸铵溶液，然后搅拌I小时，再缓慢滴加戊二醛使得溶液中戊二醛浓度为I %，交联2小时，制得交联卤醇脱卤酶聚集体。
[0059 ]本实施例取实施例1步骤A制得待用的浓度为20mg/ml的卤醇脱卤粗酶液采用氯离子测酶活的方法测定其酶活力为514.7U/g，然后采用同样方法对上述五组平行实验制得的交联卤醇脱卤酶聚集体的酶活进行定量测定并与上述游离卤醇脱卤酶比较。(不同的是，固定化酶浓度是由粗酶液浓度与交联后离心上清液按比例计算所得酶浓度差值得到的，固定化酶测酶活需要离心取上清检测)实验结果如图3所示，结果表明:当硫酸铵溶液浓度为70 %时，交联卤醇脱卤酶聚集体的酶活为344.18U/g，交联卤醇脱卤酶聚集体相对游离粗酶的酶活可达66.87 %。
[0060]实施例3:
[0061]不同固定化温度对交联卤醇脱卤酶聚集体的酶活影响
[0062]本实施例采用以下反应体系，以固定化温度为单一变量，完成三组固定化卤醇脱卤酶的平行实验:
[0063]于O°C、15 °C和30 °C这三个温度下，分别取浓度为20mg/ml的卤醇脱卤粗酶液Iml，均加入20mg牛血清白蛋白(BSA)粉末搅拌15分钟，然后再分别缓慢滴加5ml浓度为70%的硫酸铵溶液，搅拌I小时后，再缓慢滴加戊二醛使得溶液中戊二醛浓度为1%，交联反应2小时，制得交联卤醇脱卤酶聚集体。
[0064]本实施例采用氯离子测酶活的方法测定上述制得的三组交联卤醇脱卤酶聚集体的酶活力，实验结果如图4所示，结果表明:当温度为(TC时，交联的卤醇脱卤酶活性最高。
[0065]实施例4:
[0066]不同沉淀剂(质量分数为70%的硫酸铵溶液)用量对交联卤醇脱卤酶聚集体的酶活影响:
[0067]本实施例采用以下反应体系，以沉淀剂(质量分数为70%的硫酸铵溶液)与牛血清白蛋白溶解于粗酶液形成的混合溶液的体积比(简称体积比)为单一变量，完成五组固定化卤醇脱卤酶的平行实验:
[0068]在冰浴条件下，取五组浓度为20mg/ml的卤醇脱卤粗酶液Iml，均加入20mg牛血清白蛋白(BSA)粉末搅拌15分钟，形成混合液。在五组混合液中分别缓慢滴加体积比为2.5:1，5:1，7.5:1，10:1，15:1的硫酸铵溶液，所述硫酸铵溶液的质量分数为70 %，然后搅拌I小时，再缓慢滴加戊二醛使得溶液中戊二醛浓度为I %，交联2小时，制得交联卤醇脱卤酶聚集体。[0069 ]本实施例取实施例1步骤A制得待用的浓度为20mg/ml的卤醇脱卤粗酶液采用氯离子测酶活的方法测定其酶活力为514.7U/g，然后采用同样方法对上述五组平行实验制得的交联卤醇脱卤酶聚集体的酶活进行定量测定并与上述游离卤醇脱卤酶比较。实验结果如图5所示，结果表明:当沉淀剂(质量分数为70%的硫酸铵溶液)与牛血清白蛋白溶解于粗酶液形成的混合溶液的体积比为7.5:1时，交联卤醇脱卤酶聚集体的酶活为352.31U/g，交联卤醇脱卤酶聚集体相对游离粗酶的酶活可达68.45%。
[0070]实施例5:
[0071]牛血清白蛋白(BSA)添加量对交联卤醇脱卤酶聚集体的酶活影响
[0072]本实施例采用以下反应体系，以牛血清白蛋白(BSA)与卤醇脱卤粗酶的质量比为单一变量，完成七组固定化卤醇脱卤酶的平行实验:
[0073]在冰浴条件下，取七组浓度为20mg/ml的卤醇脱卤粗酶液lml，分别加入质量为Omg，2mg，4mg，8mg，12mg，16mg，20mg牛血清白蛋白(BSA)粉末搅拌15分钟，形成七组混合液。在七组混合液中缓慢滴加7.5ml质量分数为70%的硫酸铵溶液，然后搅拌I小时，再缓慢滴加戊二醛使得溶液中戊二醛浓度为I %，交联2小时，制得交联卤醇脱卤酶聚集体。
[0074]本实施例取实施例1步骤A制得待用的浓度为20mg/ml的卤醇脱卤粗酶液采用氯离子测酶活的方法测定其酶活力为514.7U/g，然后采用同样方法对上述五组平行实验制得的交联卤醇脱卤酶聚集体的酶活进行定量测定并与上述游离卤醇脱卤酶比较。实验结果如图6所示，结果表明:当牛血清白蛋白(BSA)与卤醇脱卤粗酶的质量比为0.8:1时，交联卤醇脱卤酶聚集体的酶活为384.89U/g，交联卤醇脱卤酶聚集体相对游离粗酶的酶活可达74.78%。
[0075]实施例6:
[0076]戊二醛浓度对交联卤醇脱卤酶聚集体的酶活影响
[0077]本实施例采用以下反应体系，以戊二醛最终浓度为单一变量，完成六组固定化卤醇脱卤酶的平行实验:
[0078]在冰浴条件下，取六组浓度为20mg/ml的卤醇脱卤粗酶液lml，加入16mg牛血清白蛋白(BSA)粉末搅拌15分钟，形成六组混合液。在六组混合液中缓慢滴加7.5ml质量分数为70 %的硫酸铵溶液，然后搅拌I小时，在六组中均缓慢滴加戊二醛，使得六组溶液中戊二醛浓度为分别为0.1 %,0.25%,0.5%,0.75% ,1.00% ,1.5%,交联反应2小时，制得交联卤醇脱卤酶聚集体。
[0079 ]本实施例取实施例1步骤A制得待用的浓度为20mg/ml的卤醇脱卤粗酶液采用氯离子测酶活的方法测定其酶活力为514.7U/g，然后采用同样方法对上述六组平行实验制得的交联卤醇脱卤酶聚集体的酶活进行定量测定并与上述游离卤醇脱卤酶比较。实验结果如图7所示，结果表明:当溶液中戊二醛浓度为0.75%，交联卤醇脱卤酶聚集体的酶活为405.64U/g，交联卤醇脱卤酶聚集体相对游离粗酶的酶活可达78.81 %。
[0080] 实施例7:
[0081 ]交联时间对交联卤醇脱卤酶聚集体的酶活影响:
[0082]本实施例采用以下反应体系，以交联反应时间为单一变量，完成六组固定化卤醇脱卤酶的平行实验:
[0083]在冰浴条件下，取六组浓度为20mg/ml的卤醇脱卤粗酶液lml，加入质量为16mg牛血清白蛋白(BSA)粉末搅拌15分钟，形成六组混合液。在六组混合液中缓慢滴加7.5ml质量分数为70 %的硫酸铵溶液，然后搅拌I小时，再缓慢滴加戊二醛使得溶液中戊二醛浓度为
0.75%，六组交联反应分别为2小时，4小时，6小时，8小时，10小时，12小时，最终制得交联卤醇脱卤酶聚集体。
[0084]本实施例取实施例1步骤A制得待用的浓度为mg/ml的卤醇脱卤粗酶液采用氯离子测酶活的方法测定其酶活力为514.7U/g，然后采用同样方法对上述五组平行实验制得的交联卤醇脱卤酶聚集体的酶活进行定量测定并与上述游离卤醇脱卤酶比较。实验结果如图8所示，结果表明:当交联反应时间为6小时，交联卤醇脱卤酶聚集体的酶活为470.23U/g，交联卤醇脱卤酶聚集体相对游离粗酶酶活可达91.36%。
[0085]根据实施例2?7的单因素实验得出交联卤醇脱卤酶聚集体制备的最优条件，经测定本实施例固定化的酶量为总酶量的84.29% ,且最优条件下交联卤醇脱卤酶聚集体对I，
3-二氯-2-丙醇(I，3-DCP)的降解能力达到:Ig蛋白每分钟可降解470.23ymol I，3-DCP。
[0086]实施例8:
[0087]本实施例测定最优制备条件下交联卤醇脱卤酶聚集体的机械强度:
[0088]在冰浴条件下，取浓度为20mg/ml的卤醇脱卤粗酶液lml，加入质量为16mg牛血清白蛋白(BSA)粉末，搅拌15分钟，形成混合液;在所述混合液中缓慢滴加7.5ml质量分数为70 %的硫酸铵溶液，搅拌I小时，然后缓慢滴加戊二醛使得溶液中戊二醛浓度为0.75 %，交联反应分别为6小时，最终制得交联卤醇脱卤酶聚集体。
[0089]将上述制得的交联卤醇脱卤酶聚集体保存于1ml浓度为50mmol/L的PBS缓冲液中，用以后续酶活检测。称取适量交联卤醇脱卤酶聚集体在同样实验条件下反复冲洗十次，每次冲洗后进行离心处理后，混匀于缓冲液中再测定酶活性，所得实验结果如图9所示。
[0090]图9结果表明:反复冲洗10次后，固定化酶保留初始酶活的90%以上。因此，本实施例中可以得出交联卤醇脱卤酶聚集体具有较好的机械稳定性。
[0091]实施例9:
[0092]本实施例测定最优制备条件下交联卤醇脱卤酶聚集体的回收率:
[0093]在冰浴条件下，取浓度为20mg/ml的卤醇脱卤粗酶液lml，加入质量为16mg牛血清白蛋白(BSA)粉末，搅拌15分钟，形成混合液;在所述混合液中缓慢滴加7.5ml质量分数为70 %的硫酸铵溶液，搅拌I小时，然后缓慢滴加戊二醛使得溶液中戊二醛浓度为0.75 %，交联反应分别为6小时，最终制得交联卤醇脱卤酶聚集体。
[0094]将上述制得的交联卤醇脱卤酶聚集体置于PBS缓冲液中，加入30ml的1,3-二氯-2-丙醇(1，3-DCP)，使得溶液中1，3_ 二氯-2-丙醇浓度为5mmol/L;然后在温度为25°C的条件下磁力搅拌，每次反应30分钟，反应后进行离心处理并除去上清，然后用30ml浓度5mmol/L的PBS缓冲液反复冲洗，离心处理两次后将沉淀保存于PBS缓冲液中，并采用氯离子测酶活的方式测定酶活，结果如图10所示。
[0095]图10结果表明:交联卤醇脱卤酶聚集体在反应5次后相较初始酶的相对酶活为58.25%。说明交联卤醇脱卤酶聚集体可以多次反复利用并具有较高的重复利用率。
[0096]实施例10:
[0097]本实施例测定最优制备条件下交联卤醇脱卤酶聚集体的热稳定性:
[0098]在冰浴条件下，取浓度为20mg/ml的卤醇脱卤粗酶液lml，加入质量为16mg牛血清白蛋白(BSA)粉末，搅拌15分钟，形成混合液;在所述混合液中缓慢滴加7.5ml质量分数为70 %的硫酸铵溶液，搅拌I小时，然后缓慢滴加戊二醛使得溶液中戊二醛浓度为0.75 %，交联反应分别为6小时，最终制得交联卤醇脱卤酶聚集体。
[0099]将上述制得的交联卤醇脱卤酶聚集体(固定化酶)分别置于30°C、4(TC、5(rC水浴条件下保存，采用氯离子测酶活的方式，每隔固定的时间间隔取出反应体系用于检测酶活，实验结果如图11所示。
[0100]由于有文献报道，游离酶具有较差的温度耐受性，30°C以上很容易失活，而图11结果表明:300C条件下，8小时后固定化酶的酶活达初始酶活95%以上;40°C条件下，8小时后固定化酶的酶活达初始酶活87%以上；50°C条件下，8小时后固定化酶的酶活达初始酶活60%以上。因此，本实施例可以说明交联卤醇脱卤酶聚集体具有较好的热稳定性。
[0101]尽管上面对本发明说明性的【具体实施方式】进行了描述，以便于本技术领域的技术人员理解本发明，但应该清楚，本发明不限于【具体实施方式】的范围，对本技术领域的普通技术人员来讲，只要各种变化在所附的权利要求限定和确定的本发明的精神和范围内，这些变化是显而易见的，一切利用本发明构思的发明创造均在保护之列。
【主权项】
1.一种交联卤醇脱卤酶聚集体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤: A:制备卤醇脱卤粗酶液； B:聚集体的形成；冰浴条件下，在步骤A制得的粗酶液中加入牛血清白蛋白形成混合液，然后加入质量分数为50 %?90 %的饱和硫酸铵溶液对所述混合液进行沉淀分离，形成卤醇脱卤酶聚集体;其中，所述牛血清白蛋白与卤醇脱卤粗酶的质量比为I?20:10，所述饱和硫酸铵溶液与所述混合液体积比为2.5?15:1; C:聚集体的交联;在步骤B所得体系中加入戊二醛交联卤醇脱卤酶，交联反应完成后进行离心处理，离心所得沉淀经磷酸盐缓冲液反复冲洗至清洗液检测不出任何酶活力，制得交联卤醇脱卤酶聚集体。2.根据权利要求1所述的一种交联卤醇脱卤酶聚集体的制备方法，其特征在于，所述步骤A中制备粗酶液的具体步骤为: Al:将重组卤醇脱卤酶基因转入宿主细胞E.coli MC1061中，得到重组菌E.coliMC1061； A2:将步骤Al制得的重组菌E.coli MC1061进行原核体外诱导表达，得到诱导菌，对诱导菌进行离心处理，获得菌体，然后加入磷酸盐缓冲液，并进行超声破碎，再进行离心处理，收集上清，制得粗酶液。3.根据权利要求2所述的一种交联卤醇脱卤酶聚集体的制备方法，其特征在于，所述步骤Al中重组卤醇脱卤酶基因的步骤具体为:将野生型卤醇脱卤酶的基因克隆到表达载体pBAD-TLX中，得到重组卤醇脱卤酶基因。4.根据权利要求1所述的一种交联卤醇脱卤酶聚集体的制备方法，其特征在于，所述步骤C中戊二醛的浓度0.1 %?3.0%，交联反应时间为2?12小时。5.根据权利要求1至4任一项所述的一种交联卤醇脱卤酶聚集体的制备方法，其特征在于，所述步骤A中卤醇脱卤粗酶液的浓度为18?25mg/ml。6.根据权利要求5所述的一种交联卤醇脱卤酶聚集体的制备方法，其特征在于，所述步骤A2中具体为:将重组菌E.coli MC1061单克隆接种到含有浓度为100yg/mL的氨苄青霉素的LB液体培养基中，放于温度为37°C、转速为180rpm的摇床中过夜培养，待细菌生长至OD600值为0.8?1.0时，在无菌条件下取占总体积I %的菌体进行大量培养，待细菌生长至OD600为.0.6?0.8时，加入阿拉伯糖诱导剂并使其在溶液中的浓度为50yg/ml，待菌体生长至OD600值为2.2?2.9时，进行离心处理，收集菌体，采用磷酸盐缓冲液重悬菌体后进行超声破碎，进行离心处理，收集上清液，最终制得卤醇脱卤酶浓度为18?25mg/ml的粗酶液。
【文档编号】C12N11/02GK106047848SQ201610556615
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年7月15日
【发明人】汤丽霞, 廖茜, 冯娟, 仝亚沛, 邓文凤, 辛东民
【申请人】电子科技大学