狭鳕鱼骨中胶原多肽与活性钙的提取方法
【专利摘要】本发明公开了狭鳕鱼骨中胶原多肽与活性钙的提取方法，包括以下步骤：(一)原料的预处理；(二)骨胶原多肽的制备：(1)鱼骨用NaOH溶液浸泡；再进行高温高压处理；(2)骨胶原的浸提；(3)高压脉冲电场处理；(4)酶解：先加入复合胶原蛋白酶酶解，再加入风味蛋白酶酶解；脱色脱腥，喷雾干燥，即得胶原多肽；(三)鱼骨活性钙的制备：(1)果酸提取；(2)二次果酸提取；(3)合并即得。本发明的提取方法，克服了海洋源胶原多肽腥味重、有苦味和不良异味的缺点，得到了无刺激性气味、口味鲜美柔和的狭鳕鱼骨胶原多肽，同时，本发明经济、高效地利用骨渣制备了活性果酸螯合钙，提高了狭鳕鱼骨的利用率，实现了高值化利用。
【专利说明】
狭鱼雪鱼骨中胶原多化与活性巧的提取方法
技术领域
[0001] 本发明设及狭轄鱼骨中胶原多肤与活性巧的提取方法，属于鱼骨高值开发技术领 域。
【背景技术】
[0002] 轄鱼是我国远洋渔业重要捕拱对象之一，每年捕拱数10万吨。然而海洋鱼类在加 工生产过程中会产生大量的废弃物，其中鱼骨占鱼整体重量的15%左右，在生产中通常直 接丢弃，或仅作为饲料、肥料应用，造成资源的巨大浪费。鱼骨主要成分是灰分、蛋白质、水 分及脂肪，并且巧含量丰富，其中胶原成分含量高，是开发鱼骨胶原肤及其相关产品的良好 资源，对水产品综合利用和环境保护有着重要意义。
[0003] 骨胶原是典型的I型胶原蛋白，胶原纤维相互交联形成骨网，使骨骼具有弹性和初 性。I型胶原蛋白在食品营养、美容保健、生物医学材料及临床应用等方面有着广泛应用。鱼 骨中的有机组成部分，30%都是由胶原蛋白组成，并且来源于水产动物的胶原蛋白在许多 方面明显优于牛、猪皮胶原蛋白，如低过敏性、低热变性、低抗原性、分子结构较脆弱导致酶 解较容易等。因此，鱼骨被认为是除鱼皮外制备胶原蛋白和明胶的最佳选择。
[0004] 鱼骨中含有大量巧质，但鱼骨中的巧W径基憐灰石和憐酸巧的形式存在，补巧效 果不佳。需要对其进行特殊处理才可W添加到巧营养强化型的食品中，W提高人体对巧的 吸收效果。
[0005] 高压脉冲技术(PEF)是W高电压(0~50kV)、短脉冲及溫和的溫度等条件处理液态 或半固态食品。国外在高压脉冲电场方面做了比较多的研究，但大多数研究都是针对高压 脉冲电场对食品微生物和酶的影响方面。
【发明内容】
[0006] 针对上述现有技术，为实现轄鱼骨的高效率、高值化综合利用，本发明提供了一种 狭轄鱼骨中胶原蛋白与活性巧的提取方法，不仅丰富了胶原蛋白与活性巧的来源，而且提 高了海洋水产品在加工生产过程中的利用率，提高了其附加值。本发明采用高压脉冲技术， 有效地改善了胶原蛋白风味，降低了其在生产加工中腥味的限制，从而提高了其在食品、医 药及工业生产中的适用性。同时，本发明对活性巧的提取采用二次酸提法，既保证了活性巧 的提取率，又节约了酸用量，具有一定的社会经济效益，对活性巧提取技术具有一定的指导 意义。
[0007] 本发明是通过W下技术方案实现的：
[000引狭轄鱼骨中胶原多肤与活性巧的提取方法，包括W下步骤：
[0009] ( -）原料的预处理:采肉后的狭轄鱼排，进行酸处理;酸处理后，再利用动物蛋白 酶酶解的方法酶解掉鱼骨上残留的碎肉;酶解结束后，过滤，取鱼骨，清洗备用；
[0010] 进一步地，所述酸处理的具体方式为：将狭轄鱼排浸入〇.3%HCl溶液（质量百分 数）中，浸泡60min，然后用水清洗至抑6~7;
[0011] 所述动物蛋白酶可常规市场购买得到，本发明所用动物蛋白酶购自南宁庞博生物 工程有限公司。
[0012] (二)骨胶原多肤的制备：
[0013] (1)上述预处理所得的鱼骨，用化0田容液浸泡(优选浓度0.5mol/L，浸泡时间优选2 小时）；浸泡后取出，进行高溫高压处理（高压水蒸125°C作用下处理40min)，然后粉碎至40 目W下，得鱼骨粉；
[0014] (2)骨胶原的浸提:将上述鱼骨粉利用85~90°C热水浸提(料液比优选1:8,质量 比;浸提时间优选4小时），抽滤，得骨胶原溶液和骨渣；
[0015] (3)高压脉冲电场处理:对上述得到的骨胶原溶液进行高压脉冲电场处理，高压脉 冲电场处理的参数为：电场强度30~50KV/cm，脉冲频率200~400Hz，脉冲时间150~25化S;
[0016] (4)酶解:上述处理后，进行酶解，先加入复合胶原蛋白酶酶解，再加入风味蛋白酶 酶解;其中，复合胶原蛋白酶用量为0.1%~0.2% (20万u/ml)(W反应体系质量计），反应溫 度为55°C，pH为6~7，反应时间为3.5~4.化;风味蛋白酶用量为0.1 %~0.2% (10万u/g) (W反应体系质量计），反应溫度为53°C，pH为6~7,反应时间为30~50min;两次酶解后，将 酶解液升溫到90°C，保持lOmin进行灭酶;然后，使用娃藻±和活性炭脱色脱腥(优选的，娃 藻±和活性炭的加入量均为骨胶原质量的0.5%)，喷雾干燥，即得胶原多肤，无异味，无苦 味，风味优良；
[0017] 所述复合胶原蛋白酶和风味蛋白酶均可常规市场购买得到，本发明所用复合胶原 蛋白酶购自诺维信生物技术有限公司（中国），风味蛋白酶购自南宁庞博生物工程有限公 司；
[001引（S)鱼骨活性巧的制备：
[0019] (1)果酸提取:上述得到的骨渣，加入酸液，骨渣与酸液(酸液是由巧樣酸、苹果酸 和水混合而成)的用量比为1:6 (单位g: ml )，酸液中总酸(巧樣酸+苹果酸）的质量分数为5~ 8%，巧樣酸与苹果酸质量比为1:1，反应溫度95~100°C，反应时间60~lOOmin;反应后，离 屯、，得果酸巧馨合溶液，W及提取过一次巧的骨渣；
[0020] (2)二次果酸提取上述提取过一次巧的骨渣为原料进行第二次提取，加入酸 液，骨渣与酸液的用量比为1:6，酸液中总酸的质量分数为2~3.5%，巧樣酸与苹果酸质量 比为1:1，反应溫度95~100°C，反应时间60~1 OOmin;反应后，离屯、，得果酸巧馨合溶液；
[0021] (3)合并两次的果酸巧馨合溶液，即为活性巧。
[0022] 本发明的狭轄鱼骨中胶原多肤与活性巧的提取方法，利用高压脉冲电场技术与复 合酶解技术，克服了海洋源胶原多肤腥味重、有苦味和不良异味的缺点，得到了无刺激性气 味、口味鲜美柔和的狭轄鱼骨胶原多肤，该骨胶原多肤产品可作为一种优秀的功能性食品 基料，提升了 W鱼骨胶原多肤为原料食品的风味，降低了该类食品的调配难度。同时，本发 明经济、高效地利用提取骨胶原剩余的骨渣制备了活性果酸馨合巧，提高了狭轄鱼骨的利 用率，实现了高值化利用。
【具体实施方式】
[0023] 下面结合实施例对本发明作进一步的说明。
[0024] 下述实施例中所设及的仪器、试剂、材料等，若无特别说明，均为现有技术中已有 的常规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所设及的实验方法，检 测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法，检测方法等。
[0025]为得到最佳工艺参数，本发明设计了鱼骨胶原多肤风味改善实验与活性果酸馨合 巧提取试验。
[00%]实验一鱼骨胶原多肤风味改善实验
[0027] 步骤如下：
[0028] ( - )原料的预处理：
[0029] 采肉后的狭轄鱼排，先进行酸处理(将狭轄鱼排浸入0.3%肥1溶液中，浸泡60min， 然后用水清洗至pH 7);酸处理后，再利用动物蛋白酶酶解的方法酶解掉鱼骨上残留的碎 肉;酶解结束后，过滤，取鱼骨，清洗备用。
[0030] (二)骨胶原多肤的制备：
[0031] (1)将上述预处理所得的鱼骨用化0H溶液浸泡（浓度0.5mol/L，浸泡时间2小时） 后，高溫高压处理(高压水蒸125°C作用下处理40min)，粉碎至40目W下，得鱼骨粉。
[0032] (2)骨胶原的浸提:将上述鱼骨粉利用85~90°C热水浸提(浸提时间4小时），抽滤 得骨胶原溶液和骨渣。
[0033] (3)高压脉冲电场处理:各实验参数(电场强度，脉冲频率，脉冲时间)见表2。
[0034] (4)酶解:上述处理后，利用复合胶原蛋白酶酶解后再利用风味蛋白酶酶解进行风 味改善。复合胶原蛋白酶用量0.2% (20万u/ml)，反应溫度55°C，反应pH值为7,反应时间 3.5h;风味蛋白酶用量、反应时间见表2，反应溫度53°C，反应pH值为7。反应后将酶解液升溫 到90°C，保持lOmin进行灭酶。使用娃藻±和活性炭脱色脱腥后喷雾干燥。
[0035] 将喷雾干燥所得骨胶原多肤粉末用25°C的水配制成1%的水溶液，进行风味评价， 评价依据见表1。
[0036] 表1风味评定要求表
[0037]
[0038] 表2正交因素水平表
[0039]
[C
[C
[C
[0043]
[0044] 根据表3知，W风味评定总分为指标，影响鱼骨胶原多肤风味因素的主次关系为B (脉冲频率)〉D(风味酶用量)〉A(电场强度）=E(酶解时间)〉C(脉冲时间），根据因素均值，胶 原蛋白多肤风味提升的最适条件为:A2B2C2D3E2,即电场强度30KV/cm，脉冲频率200Hz，脉冲 时间150iis，风味酶用量0.15 %，酶解时间40min。
[0045] 上述正交试验后，又进行了如下试验和风味评价：
[0046] 对照：鱼骨胶原多肤不经PEF与风味酶处理，仅用复合胶原蛋白酶酶解，获得的胶 原多肤，其风味评价得分为4分，其中气味得分为2分，口感得分为2分。得到的产品在气味上 微有腥味，基本无鲜味;在口感上微有异味，苦味明显。
[0047] 最佳条件:将鱼骨胶原用上述得出的最佳工艺参数处理，得到鱼骨胶原多肤，其风 味评价得分为8.5分，其中气味得分为4分，口感得分为4.5分。得到的产品在气味上基本无 腥味，有淡淡的鲜味;在口感上无异味，基本无苦味，有较柔和的鲜味。
[004引通过W上对比，可得出PEF与风味酶的处理对鱼骨胶原多肤的风味提升有显著作 用。
[0049] 实验二活性果酸馨合巧提取试验
[0050] 应用国标方法《GB/T 5009.92-2003食品中巧的测定》测得轄鱼骨渣中的巧含量。 [0051 ]根据预实验结果，综合考虑提取效率与工业生产成本，选取工艺参数为:巧樣酸与 苹果酸复合提取，骨渣与酸液(酸液是由巧樣酸、苹果酸和水混合而成）的用量比为1:6(单 位g:ml)，酸液中总酸(巧樣酸+苹果酸)的质量分数为8%，巧樣酸与苹果酸质量比为1:1，反 应溫度95°C，反应时间lOOmin。单次果酸巧提取率为82.3%。为在酸用量不变的前提下提高 巧提取率，本发明设计果酸提取试验分两次进行，实验步骤如下：
[0052] 1.果酸提取：W提取骨胶原多肤剩余的骨渣为原料提取果酸馨合巧，向骨渣中加 入酸液，反应料液比为1:6,巧樣酸与苹果酸质量比例1:1，反应溫度95°C，反应时间lOOmin， 果酸用量见表4。离屯、得果酸巧馨合溶液。
[0053] 2.二次果酸提取上述提取过一次巧的骨渣为原料进行第二次提取，向骨渣中 加入酸液，反应料液比为1: 6，巧樣酸与苹果酸质量比例1: 1，反应溫度95 °C，反应时间 lOOmin，果酸用量见表4。离屯、得果酸巧馨合溶液。合并两次的果酸巧馨合溶液，测量巧提取 率。实验结果见表4。
[0化4] 表4 「AACC1
[0056] 根据上述实验结果，在总酸用量不变(与单次提取相比）的前提下，选取两次提取 的酸质量比例为2:1，即第一次提取时总酸质量分数为5.33%，第二次提取时总酸质量分数 为2.67%，得到巧提取率为92.8%，提取率明显高于单次果酸提取实验。
[0057] 本发明根据胶原多肤的风味评定与双次果酸巧提取实验结果，得到了最优工艺参 数，下面结合具体实施例对本发明方法做进一步阐述。
[0化引实施例1狭轄鱼骨中胶原多肤与活性巧的提取 [0化9] 步骤如下：
[0060]( - )原料的预处理：
[0061 ] (1)酸处理:采肉后的狭轄鱼排化g，置于0.3%HC1溶液中浸泡60min，流动水清洗 至抑6~7。
[0062] (2)鱼骨上附着鱼肉的脱除：上述酸处理后的狭轄鱼排，加入水，料液比为1:1，再 加入0.1 %的动物蛋白酶(20万u/ml)进行酶解，反应溫度为50°C，反应抑为6.5，反应时间为 3.5h〇
[0063] (3)过滤:将上述酶解后得到的产物进行过滤，滤液为鱼肉多肤，得到鱼骨815g，清 洗备用。
[0064] (二)骨胶原多肤的制备：
[0065] (1)碱处理：将预处理所得的鱼骨浸没于0.5M化0H溶液化，流动水清洗至pH值中 性。
[0066] (2)高溫高压处理:高压水蒸125°C作用下处理40min。
[0067] (3)粉碎:将高压处理过的鱼骨粉碎至40目W下。
[0068] (4)骨胶原的浸提:将上述鱼骨粉利用85°C热水浸提地，料液比为1:8。
[0069] (5)固液分离:抽滤得骨胶原溶液和骨渣。
[0070] (6)高压脉冲电场处理：电场强度30KV/cm，脉冲频率200Hz，脉冲时间150US。
[0071 ] (7)酶解:复合胶原蛋白酶用量0.2 % (20万u/ml)，反应溫度55 °C，反应抑值为7，反 应时间3 .化;风味蛋白酶用量0.15 % (10万u/g)，反应溫度53 °C，反应pH值为7，反应时间 40min。反应后将酶解液升溫到90°C，保持lOmin进行灭酶。
[0072] (8)脱色脱腥:利用0.5%的娃藻±与0.5%的活性炭共同作用，在60°C条件下反应 30min，过程中不断揽拌。过滤后得胶原多肤滤液。
[0073] (9)喷雾干燥:入风溫度180°C，出风溫度70°C，得到骨胶原多肤90.6g。
[0074] (10)风味评价试验:风味评价得分为8.5分，其中气味得分为4分，口感得分为4.5 分。得到的产品在气味上基本无腥味，有淡淡的鲜味;在口感上无异味，基本无苦味，有较柔 和的鲜味。
[0075] (S)鱼骨活性巧的制备：
[0076] (1)果酸提取：W提取骨胶原多肤剩余的骨渣lOOg为原料提取果酸馨合巧，选用巧 樣酸与苹果酸复合提取，骨渣与酸液(酸液是由巧樣酸、苹果酸和水混合而成）的用量比为 1:6(单位g:ml)，酸液中总酸(巧樣酸+苹果酸）的质量分数为5.33%，巧樣酸与苹果酸质量 比例1:1，反应溫度95°C，反应时间lOOmin。离屯、得果酸巧馨合溶液。
[0077] (2)二次果酸提取上述提取过一次巧的骨渣为原料进行第二次提取，骨渣与酸 液的用量比为1:6(单位g:ml)，酸液中总酸的质量分数为2.67%，巧樣酸与苹果酸质量比例 1:1，反应溫度95°C，反应时间lOOmin。离屯、得果酸巧馨合溶液。合并两次的果酸巧馨合溶 液，测得巧总提取率为92.8%。
【主权项】
1. 狭鳕鱼骨中胶原多肽与活性钙的提取方法，其特征在于:包括以下步骤： (一） 原料的预处理:采肉后的狭鳕鱼排，进行酸处理；酸处理后，再利用动物蛋白酶酶 解的方法酶解掉鱼骨上残留的碎肉;酶解结束后，过滤，取鱼骨，清洗备用； (二) 骨胶原多肽的制备： (1) 上述预处理所得的鱼骨，用NaOH溶液浸泡;浸泡后取出，进行高温高压处理，然后粉 碎至40目以下，得鱼骨粉； (2) 骨胶原的浸提:将上述鱼骨粉利用85~90°C热水浸提，抽滤，得骨胶原溶液和骨渣； (3) 高压脉冲电场处理:对上述得到的骨胶原溶液进行高压脉冲电场处理，高压脉冲电 场处理的参数为：电场强度30~50KV/cm，脉冲频率200~400Hz，脉冲时间150~250ys; (4) 酶解：上述处理后，进行酶解，先加入复合胶原蛋白酶酶解，再加入风味蛋白酶酶 解;其中，复合胶原蛋白酶用量为〇. 1 %~〇. 2 %，20万u/ml，反应温度为55 °C，pH为6~7，反 应时间为3.5~4.5h;风味蛋白酶用量为0.1 %~0.2%，10万u/g，反应温度为53°C，pH为6~ 7，反应时间为30~50min;两次酶解后，将酶解液升温到90°C，保持lOmin进行灭酶;然后，使 用硅藻土和活性炭脱色脱腥，喷雾干燥，即得胶原多肽； (三) 鱼骨活性钙的制备： (1) 果酸提取:上述得到的骨渣，加入酸液，骨渣与酸液的用量比为1:6,酸液是由柠檬 酸、苹果酸和水混合而成的，酸液中总酸的质量分数为5~8%，柠檬酸与苹果酸质量比为1: 1，反应温度95~100 °C，反应时间60~lOOmin;反应后，离心，得果酸钙螯合溶液，以及提取 过一次钙的骨渣； (2) 二次果酸提取：以上述提取过一次钙的骨渣为原料进行第二次提取，加入酸液，骨 渣与酸液的用量比为1:6，酸液中总酸的质量分数为2~3.5 %，柠檬酸与苹果酸质量比为1: 1，反应温度95~100°C，反应时间60~1 OOmin;反应后，离心，得果酸钙螯合溶液； (3) 合并两次的果酸钙螯合溶液，即得活性钙。2. 根据权利要求1所述的狭鳕鱼骨中胶原多肽与活性钙的提取方法，其特征在于:所述 步骤(一）中，所述酸处理的具体方式为:将狭鳕鱼排浸入0.3%HC1溶液中，浸泡60min，然后 用水清洗至pH 6~7。3. 根据权利要求1所述的狭鳕鱼骨中胶原多肽与活性钙的提取方法，其特征在于:所述 步骤(二）（1)中，所述NaOH溶液的浓度为0.5mol/L，浸泡时间2小时。4. 根据权利要求1所述的狭鳕鱼骨中胶原多肽与活性钙的提取方法，其特征在于:所述 步骤(二）（1)中，所述高温高压处理的具体方式为:高压水蒸125°C作用下处理40min。5. 根据权利要求1所述的狭鳕鱼骨中胶原多肽与活性钙的提取方法，其特征在于:所述 步骤(二）（2)中，鱼骨粉与热水的用量比为1:8,热水浸提的时间为4小时。6. 根据权利要求1所述的狭鳕鱼骨中胶原多肽与活性钙的提取方法，其特征在于:所述 步骤(二）（3)中，高压脉冲电场处理的参数为：电场强度30KV/cm，脉冲频率200Hz，脉冲时间 150us〇7. 根据权利要求1或6所述的狭鳕鱼骨中胶原多肽与活性钙的提取方法，其特征在于： 所述步骤(二）（4)中，风味蛋白酶用量为0.15%，10万11/^，反应温度为53°(：，？!1为7，反应时 间为40min。8. 根据权利要求1所述的狭鳕鱼骨中胶原多肽与活性钙的提取方法，其特征在于:所述 步骤(二）（4)中，硅藻土和活性炭的加入量均为骨胶原质量的0.5%。9. 根据权利要求1或6或7所述的狭鳕鱼骨中胶原多肽与活性钙的提取方法，其特征在 于:所述步骤(三）（1)中，酸液中总酸的质量分数为5.33%;所述步骤(三）（2)中，酸液中总 酸的质量分数为2.67 %。10. 根据权利要求1~9中任一项所述的狭鳕鱼骨中胶原多肽与活性钙的提取方法，其 特征在于:步骤如下： (一) 原料的预处理： (1) 酸处理:采肉后的狭鳕鱼排5kg，置于0.3 %HC1溶液中浸泡60min，水清洗至pH 6~ 7； (2) 鱼骨上附着鱼肉的脱除：上述酸处理后的狭鳕鱼排，加入水，料液比为1:1，再加入 〇. 1 %的动物蛋白酶进行酶解，反应温度为50 °C，反应pH为6.5，反应时间为3.5h; (3) 过滤:将上述酶解后得到的产物进行过滤，得到鱼骨，清洗备用； (二) 骨胶原多肽的制备： (1) 碱处理:将上述预处理所得的鱼骨浸没于0.5MNaOH溶液2h，水清洗至pH值中性； (2) 高温高压处理:高压水蒸125°C作用下处理40min; (3) 粉碎:将高压处理过的鱼骨粉碎至40目以下； (4) 骨胶原的浸提:将上述鱼骨粉利用85°C热水浸提4h，料液比为1:8; (5) 固液分离:抽滤得骨胶原溶液和骨渣； (6) 高压脉冲电场处理：电场强度30KV/cm，脉冲频率200Hz，脉冲时间150us; (7) 酶解:复合胶原蛋白酶用量0.2 %，20万u/ml，反应温度55°C，反应pH值为7，反应时 间3.5h;风味蛋白酶用量0.15%，10万11/^，反应温度53°(：，反应?!1值为7，反应时间4〇1^11 ;反 应后将酶解液升温到90°C，保持lOmin进行灭酶； (8) 脱色脱腥：利用0.5%的硅藻土与0.5%的活性炭共同作用，在60°C条件下反应 30min，过程中不断搅拌;过滤后得胶原多肽滤液； (9) 喷雾干燥:入风温度180°C，出风温度70°C，得到骨胶原多肽； (三) 鱼骨活性钙的制备： (1) 果酸提取：以提取骨胶原多肽剩余的骨渣l〇〇g为原料提取果酸螯合钙，选用柠檬酸 与苹果酸复合提取，骨渣与酸液的用量比为1:6，酸液中总酸的质量分数为5.33%，柠檬酸 与苹果酸质量比例1:1，反应温度95°C，反应时间lOOmin;离心得果酸钙螯合溶液； (2) 二次果酸提取：以上述提取过一次钙的骨渣为原料进行第二次提取，骨渣与酸液的 用量比为1:6,酸液中总酸的质量分数为2.67%，梓檬酸与苹果酸质量比例1:1，反应温度95 °C，反应时间lOOrnin;离心得果酸钙螯合溶液； (3) 合并上述得到的果酸钙螯合溶液。
【文档编号】C12P21/06GK106047970SQ201610457531
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年6月21日
【发明人】毛毛, 衣美艳, 郭红, 焉丽波, 郝家喜, 陈甜甜, 柳耀建, 包焕玲
【申请人】山东东方海洋科技股份有限公司