用于检测微量组织中p53基因突变的引物组合及其应用
【专利摘要】本发明公开了一种用于检测微量组织中P53基因突变的引物组合，其包括预扩增引物组、用于检测5号外显子突变的引物组、用于检测6号外显子突变的引物组、用于检测7号外显子突变的引物组、用于检测8号外显子突变的引物组；该方法旨在将微量的DNA通过预扩增得到较高浓度的DNA模板，结合直接测序法检测样本中P53基因的突变情况；将该引物组合应用于制备检测P53基因突变的检测试剂中，可检测样本的DNA浓度低至100pg，且可以同时检测P53基因第5、6、7和8号外显子的所有突变，本发明提供的检测方法灵敏度高，特异性强，成本低，适用于临床肿瘤患者P53基因突变的检测，具有很好的临床应用价值。
【专利说明】
用于检测微量组织中P53基因突变的引物组合及其应用
技术领域
[0001] 本发明属于生物检测技术领域，具体设及一种用于微量组织中户基因突变检测 的引物组合及其在肿瘤用药选择和疾病诊断相关方面的应用。
【背景技术】
[0002] 户5^5基因是迄今发现与人类肿瘤相关性最高的基因，有报道称甚至有50%W上的肿 瘤患者存在/7历湛因的改变。人类p53基因位于17号染色体短臂1区3.1带（17ql3.1)，全长 16-20kb，含11个外显子和10个内含子，分为野生型(wt-p53)和突变型(mt-p53)(Reich and Levine, 1982; Lane, 1984)ewt-p53作为抑癌基因，其功能的改变或缺失与大量不同种类 的人类肿瘤细胞有密切关系。wt-p53能整合各种不同的细胞紧急事件的信号，通过转录或 非转录途径对运些信号做出包括细胞生长抑制或调亡在内的不同反应，监视细胞基因组的 完整性;mt-p53则不能完成运些功能，甚至成为原癌基因（化upt S,et al, 2016)。
[0003] P53正常功能的丧失，最主要的方式是基因突变，通过肿瘤(肝癌、乳腺癌、膀脫癌、 胃癌、结肠癌、前列腺癌、软组织肉瘤、卵巢癌、脑瘤、淋己细胞肿瘤、食道癌、肺癌、成骨肉瘤 等）中大量的突变体分析，证实大部分突变集中在P53第5、6、7、8号外显子上(Ferraiuolo M, et al，2016; Kamp歷，et al，2016)。突变体失去特异位点的结合能力，此夕h突变 体还可W改变P53的球形构象。不同种类肿瘤不同，如结肠癌和乳腺癌有相似的流行病学 (包括地区分和危险因素），但巧?巧5变谱并不一致。结肠癌G:CA:T转换占79%，而且多数CpG， 二核巧酸位点，50% W上转换突变发生在第3~5结构域的CpGC位于码子175、248、273);在乳 腺癌中，只发现13%的转换在CpG位点。此外，G-T颠换在乳腺癌占1/4,但在结肠癌T分罕见。 淋己瘤和白血病的P53,突变方式与结肠癌相似，即大部分突变为CPG位点的转换，G^T颠换 较低，A: T^G: C在A: T位点突变较高。在非小细胞肺癌中G: C^T: A最普遍，食道癌颠换率很 高，与肺癌不同的是，G:C和A:T位点有似的突变率。我国东部地区50%为249癌码子的G^C、G 颠换，而南非肝癌80%为G^T颠换。骨肉瘤中户突变率为75%，主要集中在5~9外显子。
[0004] P53的异常表达与肿瘤的转移、复发及不良预后相关，因此对于肿瘤病人/^5??基因 突变情况的检测意义重大。目前针对突变的检测方法有很多，如直接测序法，该法对样 本要求较高，检测范围有限。多态性分析法(R化P)，是将PCR与限制性酶切相结合的一种方 法，此实验操作繁琐，检测周期长，成本高昂，存在第一轮酶切不完全导致的假阳性。Taqman 水解探针法，使用扩增阻滞突变系统(ARMS)与巧光探针结合来检测突变，针对该方法设计 的引物，使得突变型得到扩增，野生型无法扩增，从而增强了突变信号，便于检测。但是ARMS 技术应用最后一个碱基不匹配并不能完全阻滞野生型DM的扩增，存在假阳性的风险，且只 能针对特异性位点检测。此外，如高效液相色谱、毛细血管电泳等，需要特殊的仪器设备，且 操作复杂，不利于在临床上进行大范围的推广。核酸序列扩增法(NASBA)、自序序列复制法 (3SR)和链置换复制法(SDA)虽均为等溫扩增法，但是它们对目的序列的扩增特异性不强。
[0005] 尽管如此，/^5巧5变的检测方法仍W肿瘤组织标本检测为金标准，但是临床上常常 由于组织样本获取不足量，使其检测具有一定的局限性。因此临床上亟需一种高效准确全 面地检测微量组织中巧?堪因突变的产品及方法，w便于为肿瘤个性化治疗服务。
[0006] 为此，本发明利用恒溫扩增与直接测序相结合的方法，建立了一套针对微量组织 样本中巧基因所有突变类型检测的技术流程，该检测方法灵敏度高，特异性强，成本低，有 利于临床使用和推广。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于提供一种具有高特异性和灵敏度的检测微量组织样本中巧基 因突变的引物组合，W组织DNA为检测对象，结合恒溫预扩增技术和普通PCR技术，通过直接 测序法确定肿瘤样本中有无巧?堪因突变，可对巧?堪因的突变进行准确的检测。
[000引本发明提供的引物组合能检测出户仿基因发生在第5号、6号、7号和8号外显子的所 有突变。
[0009] 本发明提供的用于检测户仿基因突变的引物组合包括如SEQ ID NO: 1- SEQ ID NO:18所示的预扩增引物组、如SEQ ID NO:19- SEQ ID NO:20所示的用于检测5号外显子突 变的引物组、如SEQ ID NO:21- SEQ ID NO:22所示的用于检测6号外显子突变的引物组、如 沈9 10側:23-沈9 10側:24所示的用于检测7号外显子突变的引物组、如569 10側:25- SEQ ID NO:26所示的用于检测8号外显子突变的引物组。
[0010] 本发明的另一目的是将上述引物组合应用在制备检测户庆湛因突变的检测试剂 中。
[0011] 本发明的另一目的是将上述引物组合应用于制备用于检测基因突变的检测试 剂盒中，所述试剂盒组分还包含下列常规组分中的一种或几种:聚合酶、引物组合、PCR反应 缓冲液、dNTP、BSA、去离子水。
[0012] 本发明用于检测户5?堪因突变的引物组合的检测使用方法，具体步骤如下： (1)引物稀释 将primerl-primelS分别稀释后混匀制得Primer Mix(表1)，其中primerl-primerlG引 物的终浓度为0.05-0.化M，primerl7-primerl8引物的终浓度为l-3iiM;primerl9-primer26 引物(表1)稀释至5-10咖。
[OOU] (2)预扩增 在扩增管中加入化L的10X反应缓冲液、2.5化的Primer Mix、lOO-lOOOpg微量DNA模板 (本发明采用的DNA模板来源于肺癌病人组织，并按照《分子克隆实验指南冲所述常规方法 提取组织DNA)、用去离子水补足至8.8化；混匀，98 °C预变性5-lOmin，然后置于冰上10- 20min;再加入 0.化 L dNTP (lOmM each)、0.化 L 100XBSAW 及 0.扣 L pM29 DNA 聚合酶， 30-35°C扩增过夜，65°C加热10-20min使酶失活。
[0014] (3)使用PCR纯化试剂盒纯化上述预扩增产物。
[0015] (4)户仿基因突变检测 针对户5^5基因的5号、6号、7号和8号外显子突变，分别采用如SEQ ID NO: 19- SEQ ID NO:20所示的引物组检测5号外显子突变;如SEQ ID NO:21- SEQ ID NO:22所示的引物组检 巧化号外显子突变，如SEQ ID NO:23- SEQ ID NO:24所示的引物组检测7号外显子突变，如 沈Q ID NO:25-沈Q ID NO:26所示的引物组检8号外显子突变。
[0016] 配置PCR反应总体系为25化:其中Pfu Mix混合液12.5化、所述正向引物（5-10咖） 的体积0.5-1化、反向引物（5-lOiiM)的体积0.5-化L、预扩增产物1-化L、用水补足至25化。 PCR反应条件为:①94°C，5min预变性;②94°C，30s变性;③55°C，30s退火;④72°C，35s延伸； 循环②至④35次;⑤72 °C，5min;测序检测。
[0017]本发明的检测优势在于：感本发明采用多引物组合、利用恒溫扩增及普通PCR相 结合的方法，解决了组织样本中初始DNA含量低的，无法进行户仿基因突变检测的局限性。壞 本发明中使用的试剂价格低廉，可大批量的处理样本。逗本发明方法扩增效率高，如l(K)pg 的DNA经扩增后可得到lOOOng/化;可同时检测多位点的突变情况。霞本发明方法DM扩增后 DNA忠实性好。总之，使用本发明方法可实现对微量组织样本中的户5??基因的突变情况进行 高效、准确的检测，其对于临床肿瘤早期筛查，指导临床用药，W及监测肿瘤的预后具有很 好的实际应用价值。
[001引表1:引物1-26的核巧酸序列
【附图说明】
[0019] 图1是本发明针对lOOOpg的DNA模板扩增结果;其中A图为预扩增结果(3次重复）;B 图为巧?堪因5号、6号、7号和8号外显子扩增结果； 图2是本发明针对5(K)pg的DNA模板扩增结果;其中A图为预扩增结果(3次重复）;B图为 户基因5号、6号、7号和8号外显子扩增结果； 图3是本发明针对l(K)pg的DNA模板扩增结果。A图为预扩增结果(3次重复）;B图为巧?堪 因5号、6号、7号和8号外显子扩增结果； 图4是本发明针对lOOOpg的DNA模板中户仿基因5号、6号、7号和8号外显子测序结果图； 图5是本发明针对500pg的DNA模板中户仿基因5号、6号、7号和8号外显子测序结果图； 图6是本发明针对lOOpg的DNA模板中户仿基因5号、6号、7号和8号外显子测序结果图。
【具体实施方式】
[0020] 下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。W下实施例仅用于说明本 发明而不用于限制本发明的范围，该领域的技术人员可W根据上述本
【发明内容】
对本发明做 出一些非本质的改进和调整。下述实施例中，若非特异表明，所用试剂均为分析纯，所有试 剂均可从商业渠道获得，百分比均为质量百分比。文中未注明具体条件的实验方法，通常按 照《分子克隆实验指南》中所述常规条件，或试剂制造厂商所建议的条件实施。除非另行定 义，文中所使用的所有专业和科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。
[0021] 实施例1: lOOOpg的DNA模板中户5堪因突变检测 1、实验材料 pM29 DNA聚合酶aOXreaction buffer，dNTP (lOnM)，100XBSA，1000pg的 DNA模 板，去离子水，primerl-primelS (即Primer Mix)，2XP化 Mix，p;rime;rl9-p;rimer26，PCR 仪，超薄产物纯化试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司DP203)，1%的琼脂糖凝胶，电泳仪。
[0022] 2、实验步骤及结果 2.1预扩增 (1) 引物稀释 将primerl-primelS分别稀释后混匀形成Primer Mix(表1)，其中primerl-primerlG引 物的终浓度为0.化M，primerl7-primerl8引物的终浓度为化M。配置如下体系：
(2) 将上述试剂混匀后，98°C预变性lOmin，然后迅速置于冰上20min; (3) 再加入如下体系：
将上述混合物混匀后，30-35°C扩增过夜，65°C加热10-20min使酶失活。铺1%的胶检测 (图1A)。结果显示使用地i29DNA聚合酶对lOOOpg的DNA模板扩增效果良好。
[0023] 2.2 PCR产物纯化 (1) 柱平衡步骤：向吸附柱CB1中加入500化的平衡液化，12，000巧m (~13，400 X g) 离屯、1 min,倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中； (2) 估计PCR反应液的体积，向其中加入5倍体积的结合液PB，充分混匀(无需去除石蜡 油或矿物油）； (3) 将上一步所得溶液加入一个吸附柱CB1中（吸附柱放入收集管中），室溫放置2 min， 12,000巧m(~13,400Xg)离屯、30-60S，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB1放入收集管中； (4) 向吸附柱CB1中加入6(K)化漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12， 000巧m (~13,400Xg)离屯、30-60S，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB1放入收集管中； (5) 重复操作步骤(4); (6) 12，000巧m(~13，400 X g)离屯、2 min，尽量除去漂洗液，将吸附柱置于室溫放置数 分钟，彻底地惊干，W防止残留的漂洗液影响下一步的实验； (7) 取出吸附柱CB1，放入一个干净的离屯、管中，向吸附膜中间位置悬空滴加20-5化L洗 脱缓冲液邸，室溫放置2 min。12，000巧m(~13，400 X g)离屯、2 min，收集DNA溶液。
[0024] 2.3 W堪因突变检测 (1)配置如下PCR反应体系，分别扩增伤堪因的第5号、6号、7号和8号外显子；
其中针对5号外显子突变的引物如SEQ ID NO: 19- SEQ ID N0:20所示;针对6号外显子 突变的引物如SEQ ID N0:21- SEQ ID N0:22所示;7号外显子突变的引物如56〇10^:23- 沈Q ID NO:24所示;8号外显子突变的引物如沈Q ID NO:25-沈Q ID NO:26所示。
[00巧](2)反应条件：①94。(：，5min预变性;②94。(：，30s变性;③55r，30s退火;④72r， 35s延伸；循环②至④35次；⑤72°C，5min; (3)PCR反应结束后，铺1%的胶检测（图IB)，结果显示第二轮PCR对户5堪因的第5号、6 号、7号和8号外显子均出现特异性扩增;然后送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行 测序检测。测序结果如图4所示，/均堪因第6号外显子发生错义突变C.580OT P. L194F，第 5,7和8号外显子未检测到突变。
[0026]实施例2:50化g的DNA模板中户历疆因突变检测 1、实验材料 pM29 DNA聚合酶aOXreaction buffer，dNTP (lOnM)，100XBSA，1000pg的 DNA模 板，去离子水，primerl-primelS (即Primer Mix)，2XP化 Mix，p;rime;rl9-p;rimer26，PCR 仪，超薄产物纯化试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司DP203)，1%的琼脂糖凝胶，电泳仪。 [0027] 2、实验步骤 2.1预扩增 (1)引物稀释。将primerl-primelS分别稀释后混匀形成Primer Mix(表1)，其中 primer l-primerie引物的终浓度为0.1測，口1'；[11161'17-口1'；[11161'18引物的终浓度为2111。配置如 下体系：
i于冰上20min。
[00 将上述混合物混匀后，30-35°C扩增过夜，65°C加热10-20min使酶失活。铺1%的胶检测 (图2A)。结果显示使用地i29DNA聚合酶对5(K)pg的DNA模板扩增效果良好。
[00巧]2.2 PCR产物纯化 (1)柱平衡步骤：向吸附柱CB1中加入500化的平衡液化，12,000巧m (~13,400Xg) 离屯、1 min,倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
[0030] (2 )估计PCR反应液的体积，向其中加入5倍体积的结合液PB，充分混匀(无需去除 石蜡油或矿物油）。
[0031] (3)将上一步所得溶液加入一个吸附柱CB1中（吸附柱放入收集管中），室溫放置2 min，12,000 rpm(~13,400Xg)离屯、30-60 sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CBl放入收 集管中。
[0032] (4)向吸附柱CB1中加入600化漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇）， 12,000巧m (~13,400Xg)离屯、30-60 sec,倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB1放入收集管 中。
[0033] (5)重复操作步骤4。
[0034] (6)12,000 rpm(~13,400Xg)离屯、2 min,尽量除去漂洗液。将吸附柱置于室溫放 置数分钟，彻底地惊干，W防止残留的漂洗液影响下一步的实验。
[0035] (7)取出吸附柱CB1，放入一个干净的离屯、管中，向吸附膜中间位置悬空滴加20-50 化洗脱缓冲液邸，室溫放置2 min。12，000巧m(~13，400Xg)离屯、2 min，收集DM溶液。
[0036] 2.3户仿基因突变检测 (1)配置如下PCR反应体系，分别扩增伤堪因的第5号、6号、7号和8号外显子。
[0037]
其中针对5号外显子突变的引物如SEQ ID NO: 19- SEQ ID N0:20所示;针对6号外显子 突变的引物如SEQ ID N0:21- SEQ ID N0:22所示;7号外显子突变的引物如56〇10^:23- 沈Q ID NO:24所示;8号外显子突变的引物如沈Q ID NO:25-沈Q ID NO:26所示。
[0038] (2)反应条件：①94°C，5min预变性;②94°C，30s变性;③55°C，30s退火;④72°C， 35s延伸；循环②至④35次；⑤72°C，5min; (3)PCR反应结束后，铺1%的胶检测（图2B)，结果显示第二轮PCR对伤堪因的第5号、6 号、7号和8号外显子均出现特异性扩增;然后送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行 测序检测。测序结果如图5所示，/均堪因第6号外显子发生错义突变C.580OT P. L194F，第 5,7和8号外显子未检测到突变。
[0039] 实施例3: lOOpg的DNA模板中户历疆因突变检测 1、实验材料 pM29 DNA聚合酶aOXreaction buffer，dNTP (lOnM)，100XBSA，1000pg的 DNA模 板，去离子水，primerl-primelS (即Primer Mix)，2XP化 Mix，p;rime;rl9-p;rimer26，PCR 仪，超薄产物纯化试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司DP203)，1%的琼脂糖凝胶，电泳仪。
[0040] 2、实验步骤 2.1预扩增 (1) 引物稀释。将primerl-primelS分别稀释后混匀形成Primer Mix(表1)，其中 口1'；[11161'1-口1'；[11161'16引物的终浓度为0.1咖，口1'；[11161'17-口1'；[11161'18引物的终浓度为2咖。
[00411 耐晋fm下化态.
(2) 将上述试剂混匀后，98 °C预变性8min，然后迅速置于冰上20min。
[0042] (3)再加入如下体系：
将上述混合物混匀后，30-35°C扩增过夜，65°C加热10-20min使酶失活。铺1%的胶检测 (图3A)。结果显示使用地i29DNA聚合酶对l(K)pg的DNA模板扩增效果良好。
[0043] 2.2 PCR产物纯化 (1)柱平衡步骤：向吸附柱CB1中加入500化的平衡液化，12,000巧m (~13,400Xg) 离屯、1 min,倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
[0044] (2 )估计PCR反应液的体积，向其中加入5倍体积的结合液PB，充分混匀(无需去除 石蜡油或矿物油）。
[0045] (3)将上一步所得溶液加入一个吸附柱CB1中（吸附柱放入收集管中），室溫放置2 min，12,000 rpm(~13,400Xg)离屯、30-60 sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CBl放入收 集管中。
[0046] (4)向吸附柱CB1中加入600 yL漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙 醇），12,000巧m (~13,400Xg)离屯、30-60 sec,倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB1放入 收集管中。
[0047] (5)重复操作步骤4。
[004引（6)12,000 rpm(~13,400Xg)离屯、2 min,尽量除去漂洗液。将吸附柱置于室溫放 置数分钟，彻底地惊干，W防止残留的漂洗液影响下一步的实验。
[0049] (7)取出吸附柱CB1，放入一个干净的离屯、管中，向吸附膜中间位置悬空滴加20-50 yL洗脱缓冲液邸，室溫放置2 min。12，000巧m(~13，400Xg)离屯、2 min，收集DNA溶液。
[0化0] 2.3户仿基因突变检测 (1)配置如下PCR反应体系，分别扩增伤堪因的第5号、6号、7号和8号外显子。
[0化1 ]
其中针对5号外显子突变的引物如SEQ ID NO: 19- SEQ ID N0:20所示;针对6号外显子 突变的引物如SEQ ID N0:21- SEQ ID N0:22所示;7号外显子突变的引物如56〇10^:23- 沈Q ID NO:24所示;8号外显子突变的引物如沈Q ID NO:25-沈Q ID NO:26所示。
[0052] (2)反应条件：①94°C，5min预变性;②94°C，30s变性;③55r，30s退火;④72r， 35s延伸；循环②至④35次；⑤72°C，5min; (3)PCR反应结束后，铺1%的胶检测（图3B)，结果显示第二轮PCR对伤堪因的第5号、6 号、7号和8号外显子均出现特异性扩增;然后送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行 测序检测。测序结果如图6所示，/均堪因第6号外显子发生错义突变C.580OT p. L194F，第 5,7和8号外显子未检测到突变。
[0053] W上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技 术人员来说，本发明可W有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修 改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 用于检测微量组织中基因突变的引物组合，其特征在于：包括如SEQ ID NO: 1-SEQ ID NO: 18所示的预扩增引物组、如SEQ ID NO: 19- SEQ ID NO:20所示的用于检测5号 外显子突变的引物组、如SEQ ID N0:21- SEQ ID N0:22所示的用于检测6号外显子突变的 引物组、如SEQ ID N0:23- SEQ ID N0:24所示的用于检测7号外显子突变的引物组、如SEQ ID NO:25- SEQ ID NO:26所示的用于检测8号外显子突变的引物组。2. 权利要求1所述的引物组合在制备检测基因突变的检测试剂中的应用。3. 权利要求1所述的引物组合在制备检测基因突变的检测试剂盒中的应用。
【文档编号】C12N15/11GK106048021SQ201610418005
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年6月15日
【发明人】盛苗苗, 罗瑛, 唐文如, 李珊珊, 王芳, 赵月光, 张继虹, 贾舒婷, 吴晓明, 刘静, 周若宇, 旦菊花
【申请人】昆明理工大学