多重实时荧光定量pcr对立克次体分型检测的试剂盒及方法
【专利摘要】本发明公开了采用实时荧光定量PCR对立克次体分型的检测的核酸组、试剂盒及检测方法，具体用于对贝利群立克次体、斑点热群立克次体和斑疹伤寒立克次体的测定。本发明提供的试剂盒，使用方便，所用的试剂少，成本低，检测的特异性强，灵敏度高；检测方法实现了对同一个样本，实现对立克次体的基因分型的检测，大大简化了操作过程，减少了重复操作的步骤，节省时间，减轻重复操作消耗的劳动力，并有效节约成本，实现了对立克次体基因型的快速筛查。
【专利说明】
多重实时黄光定量PCR对立克次体分型检测的试剂盒及方法
技术领域
[0001] 本发明属于生物技术检测领域，具体设及用于多重实时巧光定量PCR对立克次体 分型的检测的试剂盒及其检测方法。
【背景技术】
[0002] 立克次体病乃立克次体目中某些致病微生物所引起的多种急性感染的统称，是经 节肢动物如婢、風、圣、蛾等传播的人畜共患传染病，也可因家畜如猫、犬抓咬而发生。立克 次体病呈世界性或地方性流行，临床表现轻重不一，主要包括流行性斑疹伤寒、斑点热和战 壞热等。立克次体根据基因分析主要分为S大群，贝利群（Belli),斑点热群（Spotted fever群)和斑疹伤寒群(Typhus群）。
[0003] 立克次体病早期症状多样，无特异性临床特征，临床误诊率极高。延误治疗可引起 严重的并发症，甚至死亡。但是若能在感染早期做出正确的诊断，低廉、有效的强力霉素及 四环素即可对立克次体有效。因此快速、准确的早期诊断是控制立克次体病的关键。
[0004] 传统的立克次体检测方法主要有分离培养、PCR和免疫学诊断。但分离培养耗时 长，操作复杂;PCR和免疫学方法只能检测一种或几种病原体，不能完全满足检测种类多样 的立克次体的需要。
[0005] 现有专利公开号为CN105543346A，公开了立克次体多重巧光PCR检测方法，建立了 流行性斑疹伤寒、地方性斑疹伤寒、Q热3种病原的多重实时巧光定量PCR方法，该方法仅能 用于斑疹伤寒立克次体和已在系统分类学上不属于立克次体属的Q热的分型检测，不能系 统的将立克次体属的贝利群(Belli)，斑点热群（Spotted fever群)和斑疹伤寒群(Typhus 群)=种基因群进行分析，且从操作上，每种立克次体需要分别采用3对引物及探针，检测 体系复杂，用于对立克次体种的检测，检测灵敏度低，易发生假阴性的检测结果。
[0006] 目前对于是属于立克次体属，但具体属于哪个群的检测方法还未见到，具体区分 开是属于哪个群的立克次体，有助于针对性预防，控制，具有重要的研究意义。
【发明内容】
[0007] 本发明的一个目的是提供了一组用于多重实时巧光定量PCR对立克次体分型检测 的核酸。本发明的另一个目的是提供一种多重实时巧光定量PCR对立克次体分型检测的试 剂盒及其检测方法，具体提供了用于实时巧光定量PCR对立克次体进行分型检测的试剂及 检测方法。本发明的检测方法用于解决了检测是否属于立体次体属，具体属于贝利群，斑点 热群和斑疹伤寒群立克次体群的基因分型问题。
[000引为实现上述目的，本发明采用W下技术方案：
[0009] -组用于多重实时巧光定量PCR对立克次体分型检测的核酸，该核酸用于分型检 测立克次体的贝利群、斑点热群、斑疹伤寒群，包括立克次体巧光PCR检测的上、下游引物， 贝利群探针，斑点热群探针和斑疹伤寒群探针，其中，
[0010] 所述立克次体巧光PCR检测的上游引物序列如SEQ ID No.l所示，下游引物序列如 沈Q ID No.2所示；
[00川所述贝利群探针的序列如沈Q ID No.3所示，
[0012] 所述斑点热群探针序列如SEQ ID No.4所示，
[0013] 所述斑疹伤寒群探针序列如SEQ ID No.5所示。
[0014] 如上所述的核酸，优选地，该组核酸还包括包含立克次体巧光PCR检测的阳性扩增 产物序列，其中，
[001引所述立克次体巧光PCR检测的阳性扩增产物序列包括贝利群立克次体、斑点热群 立克次体和斑疹伤寒群立克次体的阳性扩增产物序列，
[0016] 所述贝利群立克次体巧光PCR检测的阳性扩增产物序列，包含如SEQ ID No.6所示 的序列；
[0017] 所述斑点热群立克次体的阳性扩增产物序列，包含如SEQ IDNo.7所示的序列；
[001引所述斑疹伤寒群立克次体的阳性扩增产物序列，包含如SEQ IDNo.8所示的序列。
[0019] -种多重实时巧光定量PCR对立克次体分型检测的试剂盒，该试剂盒包括:上述核 酸，其中，上述各条探针的5 '端和3 '端分别对应标记FAM-B册1、Texred-B册2和CY5-B册3。
[0020] 如上所述的试剂盒，优选地，还包括2XPremix EX TaqTM。
[0021] -种多重实时巧光定量PCR对立克次体分型检测的方法，该方法是非诊断目的的 检测方法，用于对立克次体进行分型检测，判断是否为贝利群立克次体，斑点热群立克次体 和斑疹伤寒群立克次体，具体包括W下步骤：
[0022] (1)从样品中提取DNA;
[0023] (2)对上述提取的DNA进行巧光定量PCR扩增;其中，巧光定量PCR扩增时，在反应体 系中，采用立克次体巧光PCR检测的上、下游引物的核巧酸序列如SEQ ID No.USEQ ID No.2所示，贝利群探针的核巧酸序列如SEQ ID No.3所示，其探针5'端和3'端分别对应标记 尸八1和8朋1;斑点热群探针的核巧酸序列如569 10齡.569 10齡.4所示，其探针5'端和3' 端分别对应标记Texred和册Q2;斑疹伤寒群探针的核巧酸序列如SEQ ID No.5所示，其探针 5 '端和3 '端分别对应标记CY5和B册3;
[0024] (3)收集巧光信号，选择上述巧光基团的巧光检测模式，基线调整取3~15个循环 的巧光信号，W阔值线刚好超过正常阴性对照的最高点设定阔值线；
[0025] (4)结果判定:待测样品巧光增长曲线超过阔值线，并呈现良好的对数增长，则判 断为阳性，如无典型的扩增曲线，判断为阴性。
[0026] 如上所述的方法，优选地，所述步骤(2)中巧光定量PCR扩增的反应体系具体如下：
[0027] IX Premix EX TaqTM,
[0028] 所述立克次体巧光PCR检测的上、下游引物的终浓度为0.5皿ol/L，所述贝利群探 针的终浓度为O.lwnol/L，所述斑点热群探针的终浓度为0.1皿ol/L，所述斑疹伤寒群探针 的终浓度为0.1皿ol/L，
[0029] 所述样品的DM为化1，其余采用灭菌蒸馈水加至总体积25iU。
[0030] 如上所述的方法，优选地，同时设置无核酸酶水为阴性对照；
[0031] 同时分别设置包含如SEQ ID No.9所示的序列、SEQ ID No. 10所示的序列、SEQ ID No. 11所示的序列的基因作为阳性对照。
[0032] 如上所述的方法，优选地，所述步骤(2)中巧光定量PCR扩增的反应程序为:预变性 阶段 94°C 5min，扩增阶段 94°C 30s，48 °C 30s，72 °C 30s 扩增 45 个循环，72 °C 7min，4°C 保持。
[0033] 如上所述的方法，优选地，所述步骤(4)结果判定中，所述阔值为35,当Ct值《35 时，有明显扩增曲线为阳性结果;Ct值>40时，无明显扩增曲线为阴性结果。
[0034] 如上所述的方法，优选地，该方法还包括验证步骤，具体为将阳性样品进行普通 PCR扩增，采用立克次体常规检测的上游引物序列如SEQ ID No.1所示，下游引物序列如SEQ ID No. 2所示;并对扩增产物进行测序比对。
[0035] 本发明提供了检测立克次体的贝利群、斑点热群和斑疹伤寒群的核酸组，该组核 酸是用于立克次体的分型检测。用于同步对=种立克次体分型检测时，仅用一对引物对进 行，经过验证，相互探针之间不发生交叉反应，且其检测灵敏度高，特异性强。
[0036] 本发明还提供了一种用于实时巧光定量PCR立克次体分型检测的试剂盒，建立了 一种比较高效、灵敏的，可同时立克次体的贝利群、斑点热群和斑疹伤寒群的方法。该方法 能有效提高检测的灵敏度，避免假阴性。提供的检测试剂盒使用方便，操作简便，自动化程 度高，有效替代传统检测需要培养、血清分型来获得检测结果，且试剂盒所用的试剂少，成 本低，并大大简化了操作过程，减少了重复操作的过程，也就减少了在操作过程的污染，避 免重复操作而消耗过多的劳动力，节省时间，有效节约成本，实现了快速筛查，所用试剂盒 的检测效果好，特异性强，灵敏度高。
[0037] 提供的检测方法采用完全闭管操作，操作简单、方便快捷、通过直接探测PCR过程 中巧光信号的变化来获得定量的结果，不需要PCR后处理或电泳检测，克服了常规PCR技术 的易污染、出现假阳性，能有效避免非特异性扩增难题，并且适合大批量样本的筛查检测。 [003引被立克次体感染后，在潜伏期和隐性阶段，没有出现相应病理病症、疾病症状时， 一般很难发现和控制，而本发明提供的试剂盒具有较高的检测灵敏度，且对1个样本的检测 可实现对立克次体具体属于哪种基因型，即具体属于贝利群、斑点热群和斑疹伤寒群的排 查，且主要是检测待测样本中是否含有贝利群、斑点热群和斑疹伤寒群立克次体的核酸，并 不是针对疾病的诊断，疾病的诊断应对病人的病症综合评价，才能确诊，该检测方法只是检 查是否有相应立克次体的核酸，属于非诊断性的检测。通过对立克次体分型的检测，可W有 助于提前发现是否感染立克次体，或是否为立克次体隐性携带者，为能及时有效控立克次 体的传播与扩散，提供有效的技术支持。
【附图说明】
[0039] 图1为本发明的检测方法对贝利群阳性标准质粒灵敏度的扩增曲线。
[0040] 图2为本发明的检测方法对斑点热群阳性标准质粒灵敏度的扩增曲线。
[0041] 图3为本发明的检测方法对斑疹伤寒群阳性标准质粒灵敏度的扩增曲线。
[0042] 图4为本发明的检测方法对贝利群阳性标准质粒的标准曲线。
[0043] 图5为本发明的检测方法对斑点热群阳性标准质粒的标准曲线。
[0044] 图6为本发明的检测方法对斑疹伤寒群阳性标准质粒PCR的标准曲线。
[0045] 图7为本发明的检测方法对特异性检测结果图。
【具体实施方式】
[0046] W下结合具体实例对本发明做进一步详细说明，并非对本发明的限定，本发明的 实施方式并不限于此，本发明提供的核巧酸序列的互补序列也可实现本发明，如无特殊说 明，所用试剂为常规试剂，因此凡依照本公开内容所作出的本领域的等同替换，均属于本发 明的保护范围。
[0047]实施例1引物、探针的设计
[004引根据Genbank检索立克次体的贝利群、斑点热群和斑疹伤寒群S群菌株的gltA基 因片段，利用Primer Premie巧.0软件设计巧光PCR上、下游引物分别为RA-F、RA-R，探针分 另IJ为RAb-P(贝利群）、RAs-P(斑点热群）、Rat-P(斑疹伤寒群），序列如下。
[0049] 立克次体巧光PCR检测的上、下游引物(RA-F、RA-R)，具体如下：
[0050] RA-F(SEQ IDNo.1):5' -TTTATGTCYACTGCTTCTTG-3'
[0051 ] RA-R(SEQ IDNo.2):5' -TAATAGCCATAGGATGAGAAG-3'
[0052] 贝利群探针(RAb-P)，斑点热群探针(RAs-P)和斑疹伤寒群探针(RAt-P)，具体如 下：
[0053] RAb-P(SEQ IDNo.3)：
[0054] 5'-AACCTACATAGACGGTGATAAAGGAATCCTACGAC-3'
[0055] RAs-P(SEQ IDNo.4)：
[0056] 5'-CACCTATATAGACGGTGATAAAGGAATCTTGCGGC-3'
[0057] RAt-P(SEQ IDNo.5)：
[005引 日'-CACATATATAGACGGTGATAAAGGCATATTATGGT-3'。
[0059] 本发明中，探针的设计尤为关键，探针可W在引物扩增的片段之间进行选择，但自 身不可形成引物二聚体，否则会导致假阴性检测结果，用于多重病原菌进行检测时，不可进 行多重检测的片段之间有交叉反应，否则会导致假阳性结果。设计探针时要使哪种立体次 体群探针的报告基团的巧光发射最大波长处于不同的光谱范围，W确保巧光定量PCR仪的 检测通道能区分哪种立体次体群的探针。所W设计中，除了用软件进行评估，确保理论上的 尽可能符合多重反应W外，还应根据反应的扩增曲线进行引物和探针浓度的适当调整，直 至扩增出最佳扩增曲线。
[0060] 本发明选用的FAM、Texred和CY5^种巧光染料，其波长处于不同光谱范围，相互间 不能干扰，具有明显的区分效果和信号强度。
[0061] 经大量实验验证，采用上述引物、探针时，可单独用于检测各对应的病原菌的检 ，其探针的5'端和3'端分别可选用标记FAM-B册1、Texred-BHQ2和CY5-BHQ3。但进行同时 检测=种立克次体分型时，各探针标记则应对应标记运=种组合关系，也就是说采用FAM- B册1、Texred-B册巧日CY5-B册3分别标记贝利群探针，斑点热群探针，斑疹伤寒群探针，各探 针5/端和y端标记是不重合的，但是可随意进行组合，检测结果不受影响。
[0062] 具体在本发明中，当的探针5/巧光染料标记根据所采用的实时巧光PCR仪的配置 而定，WAB口500巧光定量PCR仪为例，第一到第S条的检测通道分别WFAM、Texred和切5标 记。第一条检测通道检测贝利群，其巧光染料的检测波长约为520nm;第二条检测通道检测 斑点热群，其巧光染料的检测波长约为580nm;第S条检测通道检测斑疹伤寒群，其巧光染 料的检测波长约为650nm。
[0063] 实施例2质粒的构建
[0064] 立克次体的阳性样本由中国检验检疫科学研究院卫生检疫研究所保存，编号为 畑38 (贝利群）、LB69 (斑点热群）、皿83 (斑疹伤寒群）。
[00化]按照Qiagen DNA提取试剂盒说明书提取上述S个阳性样本的DNA，保存于-80°C， 采用巧光PCR引物RA-F、RA-R分别扩增S个阳性样本的核酸DM，扩增体系为50山，体系中包 括lOXBuffer 5iil、dNTP化Url'aq 0.化1、上下游引物各化l、dd出037.祉1、DNA模板化1。 反应条件为94°C5min，94°C30s一48°C30s一72°C30s 35个循环，72°C7min，4°C保持。PCR产 物采用1.5%的琼脂糖凝胶电泳。取30iU的PCR产物测序，测序由英驗公司完成。室溫条件 下，按照Invitrogen TA克隆试剂盒说明书分别克隆，命名为RAb-T、RAs-T、RAt-T作为巧光 定量PCR的质粒模板标准品。
[0066] 测序的结果，RAb-T即贝利群立克次体的阳性扩增产物序列如SEQ IDNo.6所示。
[0067] SEQ IDNo.6：
[006引 TTTATGTCCACTGCTTCTTGTAGATCCACAATAACCTACATAGACGGTGATAAAGGAATCCTACGACATCGAGGATA TGATATTAAGGATTTAGCCGAGAAAAGCGATTTTTTAGAGGTAGCATATTTATTGATTTACGGAGAATTACCAAGTA GTGAGCAGTATAATAATTTTACTAAAAAAGTCGCTGTTCATTCACTAATGAATGAACGACTACATTATCTGTTTCAA ACATTTTGTAACTCTTCTCATCCTATGGCTATTA。
[0069] 斑点热群立克次体的阳性扩增产物序列如SEQ IDNo.7所示。
[0070] SEQ IDNo.7：
[0071] TTTATGTCTACTGCTTCTTGTCAGTCTACTATCACCTATATAGACGGTGATAAAGGAATCTTGCGGCATCGAGGATA TGATATTAAAGACTTAGCTGAGAAAAGTGATTTTTTAGAAGTGGCATATTTACTGATTTATGGGAAACTACCAAGTG GCGAGCAGTATAATAATTTCACTAAACAGGTTGCTCATCATTCATTAGTGAATGAAAGATTACACTATTTATTTCAA ACCTTTTGTAGCTCTTCTCATCCTATGGCTATTA。
[0072] 斑疹伤寒群立克次体的阳性扩增产物序列，如SEQ IDNo.8所示。
[0073] 沈Q IDNo.8:
[0074] TTTATGTCTACTGCTTCTTGTCAATCTACTATCACATATATAGACGGTGATAAAGGCATATTATGGTATCGAGGATA TGATATTAAAGACTTAGCTGAGAAAAGTGATTTTTTAGAAGTGGCATATTTGATGATTTATGGGGAGCTACCAAGTA GTGATCAGTATTGTAATTTTACTAAAAAGGTTGCTCATCATTCATTAGTGAATGAAAGATTACACTATTTATTTCAA ACCTTTTGTAGTTCTTCTCATCCTATGGCTATTA。
[0075] 实施例3多重实时巧光定量PCR对立克次体分型检测的方法
[0076] 本发明建立的方法中为了避免所用试剂失效或受到污染，设置有作为阳性对照及 阴性对照试剂，阴性对照采用无核酸酶水；
[0077] 阳性对照采用携带有扩增产物的质粒DNA，所述扩增产物的核巧酸序列分别含有 如沈9 10齡.6、569 10齡.7、569 10齡.8所示的序列。
[0078] 阴性对照的设计能有效验证所用试剂是否受到污染，避免假阳性发生，阳性对照 的设计能有效验证受用试剂的有效性，避免假阴性的发生。
[0079] 巧光扩增试剂可购自辉眷生物科技有限公司；引物、探针、质粒委托英潍捷基（上 海）贸易有限公司合成，其中RAb-P的5 '端和3 '端分别对应标记FAM-B册1，RAs-P的5 '端和3 ' 端分别对应标记Texred-B册2，RAt-P的5 '端和3 '端分别对应标记CY5-B册3。
[0080]经过多次优化实验，确定采用W下方法进行检测。
[0081 ]采用实时巧光定量PCR对立克次体分型检测的方法包括W下步骤：
[00剧 （1)样品0臟提取
[0083] 样品DNA提取可选用QiagenDNA提取试剂(如可购Qiagen试剂公司）进行提取。
[0084] (2)巧光定量PCR扩增
[0085] 采用反应体系：RA-F、RA-R的终浓度为0.5皿〇1/1，3413斗、1?43斗、1?41斗探针各 的终浓度为0.1皿〇l/L，lXPremix EX haTM，样品DNA为化1，其余用d地2〇补足总体积25y 1〇
[0086] 设置阳性对照时，分别采用含有立克次体分型的阳性扩增序列的质粒，即立克次 体的贝利群、斑点热群和斑疹伤寒群的阳性扩增序列的质粒替换样本DNA，设置阴性对照 时，采用无核酸酶水替换样本DNA。
[0087] 扩增条件:优选W下扩增条件：
[0088] 预变性阶段 94°C5min，扩增阶段 941：3〇3,481：3〇3,721：3〇3扩增45个循环，721： 7min，4°C 保持。
[0089] (3)收集巧光信号信号，分别选择FAM、Texred、切5的巧光检测模式，基线调整取3 ~15个循环的巧光信号，W阔值线刚好超过正常阴性对照的最高点设定阔值线；
[0090] (4)结果判定:待测样品巧光增长曲线超过阔值线，并呈现良好的对数增长，则判 断为阳性，如无典型的扩增曲线，判断为阴性。
[0091] 具体在本实施例中，阔值为35,当Ct值《35,有明显扩增曲线为阳性结果;抗值> 40无明显扩增曲线为阴性结果。
[0092] 实施例4本发明检测方法的灵敏度
[0093] 将实施例2中制备的RAb-T、RAs-T、RAt-T质粒模板标准品，即阳性质粒标准品作 10^1~梯度倍比稀释，采用实施例3中的多重实时巧光定量PCR对立克次体分型检测的 方法来验证该方法的灵敏度，对每一个浓度的样本，都做3个重复试验，通过计算Ct值的差 异来验证方法的重现性，并建立标准曲线。
[0094] 实施例2中制备的原质粒标准品RAb-T、RAs-T、RAt-T的浓度分别为274ngAU、 264ngA^l、270ngA^l，按照拷贝数copies/山 = (ng/山X 10-9)X(6.02X 1023V(660XDNA长 度）公式计算，原质粒标准品RAb-T、RAs-T、RAt-T的拷贝数分别为6.0Xl〇WcopiesAU、 5.78X l〇Wcopies/]il、5.85X 10…copies/山。
[00M]采用多重巧光定量PCR方法的灵敏度测试结果见图1、图2、图3，其中：该方法检测 S种立克次体质粒标准品RAb-T、RAs-T、RAt-T的灵敏度分别为60copiesAil、58copiesAU 和 58copies/]il。
[0096] 标准曲线如图4、图5、图6，S个标准曲线相关值(r2)分别为0.998、0.990、0.999， 呈明显的线性相关，7个浓度梯度各组内Ct值基本保持一致，说明本发明建立的方法体系的 重复性佳。
[0097] 实施例5本发明特异性的检测
[0098] 参照Qiagen DNA提取试剂盒的说明书提取S种立克次体群阳性样本的DNA，并用 优化好的多重PCR检测体系和条件即实施例3来评价该检测方法的特异性，对伯氏疏螺旋 体、贝氏柯克斯体(Q热）、±拉菌、=种立克次体群阳性样本进行检测，检测结果见图7所示， 对伯氏疏螺旋体、贝氏柯克斯体(Q热）、±拉菌的检测均为阴性，说明本发明建立的方法即 采用的引物及探针的特性强，可同时检测=种立克次体，与其他病原不发生交叉反应。
[0099] 实施例6:对实际样品进行检测
[0100] 采用黑龙江采集的100只婢作为检测样本来进行立克次体分型检测，按照Qiagen DNA提取说明书提取婢的基因组DM,作为模板用实施例3的多重PCR检测方法进行检测，发 现3个斑点热群立克次体阳性，2个贝利立克次体阳性。为了验证检测样品的准确性，对阳性 样品还进行了常规立克次体的检测，采用的立克次体常规检测的上游引物序列如SEQ ID No.9所示，下游引物序列如SEQ ID No. 10所示;进行PCR扩增，扩增体系其它试剂可采用实 施例2中的扩增体系，扩增条件采用:预变性阶段95°C，5min;扩增阶段94°C，15sec;60°C， 30sec; 72°C，Imin，45个循环;72°C，lOmin; 4°C保溫。对扩增产物进行测序分析，与多重实时 巧光定量PCR方法检测的结果一致，证明该方法具有可行性、科学性、应用性。
[0101] 其中；
[0102] 沈Q IDNo. 9: 5^GGGGGCCTGCTCACGGCGG-3'
[0103] SEQ IDNo.10:5' -ATTGCAAAAAGTACAGTGAACA-3'。
[0104] 采用的立克次体常规检测的上、下游引物序列对阳性样品的验证，有效避免假阳 性结果的出现。
【主权项】
1. 一组用于多重实时荧光定量PCR对立克次体分型检测的核酸，其特征在于，该核酸用 于分型检测立克次体的贝利群、斑点热群、斑疹伤寒群，包括立克次体荧光PCR检测的上、下 游引物，贝利群探针，斑点热群探针和斑疹伤寒群探针，其中， 所述立克次体荧光PCR检测的上游引物序列如SEQ ID No. 1所示，下游引物序列如SEQ ID No.2所示； 所述贝利群探针的序列如SEQ ID No.3所示， 所述斑点热群探针序列如SEQ ID No.4所示， 所述斑疹伤寒群探针序列如SEQ ID No.5所示。2. 如权利要求1所述的核酸，其特征在于，该组核酸还包括包含立克次体荧光PCR检测 的阳性扩增产物序列，其中， 所述立克次体荧光PCR检测的阳性扩增产物序列包括贝利群立克次体、斑点热群立克 次体和斑疹伤寒群立克次体的阳性扩增产物序列， 所述贝利群立克次体荧光PCR检测的阳性扩增产物序列，包含如SEQ ID No.6所示的序 列； 所述斑点热群立克次体的阳性扩增产物序列，包含如SEQ IDNo.7所示的序列； 所述斑疹伤寒群立克次体的阳性扩增产物序列，包含如SEQ IDNo. 8所示的序列。3. -种多重实时荧光定量PCR对立克次体分型检测的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包 括：如权利要求1或2所述的核酸，其中，所述各条探针的5'端和3'端分别对应标记FAM-BHQ1、Texred-BHQ2和CY5-BHQ3〇4. 如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，还包括2 XPremix EX TaqTM。5. -种多重实时荧光定量PCR对立克次体分型检测的方法，其特征在于，该方法是非诊 断目的的检测方法，用于对立克次体进行分型检测，判断是否为贝利群立克次体，斑点热群 立克次体和斑疹伤寒群立克次体，具体包括以下步骤： (1) 从样品中提取DNA; (2) 对所述述提取的DNA进行荧光定量PCR扩增;其中，荧光定量PCR扩增时，在反应体系 中，采用立克次体荧光PCR检测的上、下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 1、SEQ ID No.2 所示，贝利群探针的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，其探针5'端和3'端分别对应标记FAM 和BHQ1;斑点热群探针的核苷酸序列如SEQ ID No. SEQ ID No.4所示，其探针5'端和3'端分 别对应标记Texred和BHQ2;斑疹伤寒群探针的核苷酸序列如SEQ ID No. 5所示，其探针5 '端 和3 '端分别对应标记CY5和BHQ3; (3) 收集荧光信号，选择上述荧光基团的荧光检测模式，基线调整取3~15个循环的荧 光信号，以阈值线刚好超过正常阴性对照的最高点设定阈值线； (4) 结果判定:待测样品荧光增长曲线超过阈值线，并呈现良好的对数增长，则判断为 阳性，如无典型的扩增曲线，判断为阴性。6. 如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中荧光定量PCR扩增的反应体系 具体如下： lXPremix EX TaqTM， 所述立克次体荧光PCR检测的上、下游引物的终浓度为0.5ymol/L，所述贝利群探针的 终浓度为O.lymol/L，所述斑点热群探针的终浓度为O.lymol/L，所述斑疹伤寒群探针的终 浓度为0. lymol/L， 所述样品的DNA为ΙμL，其余采用灭菌蒸馏水加至总体积25μ1。7. 如权利要求5所述的方法，其特征在于，该方法同时设置无核酸酶水为阴性对照； 同时分别设置包含如SEQ ID No.9所示的序列、SEQ ID No. 10所示的序列、SEQ ID No. 11所示的序列的基因作为阳性对照。8. 如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中荧光定量PCR扩增的反应程序 为：预变性阶段 94°C5min，扩增阶段 941€3〇8,481€3〇8,721€3〇8扩增45个循环，72 1€71^11，4 °C保持。9. 如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)结果判定中，所述阈值为35,当 Ct值<35时，有明显扩增曲线为阳性结果;Ct值>40时，无明显扩增曲线为阴性结果。10. 如权利要求5-9任一所述的方法，其特征在于，该方法还包括验证步骤，具体为将阳 性样品进行普通PCR扩增，采用立克次体常规检测的上游引物序列如SEQ ID No. 1所示，下 游引物序列如SEQ ID No.2所示;并对扩增产物进行测序比对。
【文档编号】C12R1/01GK106048026SQ201610461678
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年6月23日
【发明人】杨宇, 方志强, 王建成, 徐宝梁, 赵婷婷, 富英群, 侯咏
【申请人】中国检验检疫科学研究院