一种用于鉴定麻雀性别的特定基因的引物及其应用
【专利摘要】本发明公开了一种用于鉴定麻雀性别的特定基因的引物及其应用，所述引物包括序列号为SEQ ID NO.1的KLNIPBL?i16F2和序列号为SEQ ID NO.2的KLNIPBL?i16R2。本发明利用该对引物对麻雀肉样或成年麻雀血液中提取出的基因组DNA进行扩增，并对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果表明扩增序列为NIPBL基因的目的片段，雌性和雄性麻雀电泳条带差异明显，根据条带数的不同可以明确区分麻雀的性别。本发明方法技术实用性强，重复性好，可以准确鉴别麻雀的性别。
【专利说明】
-种用于鉴定麻雀性别的特定基因的引物及其应用
技术领域
[0001] 本发明属于生物检测技术领域，具体设及一种用于鉴定麻雀性别的特定基因的引 物及其应用。
【背景技术】
[0002] 随着性别鉴定研究的兴起，鉴定方法日新月异。当前，利用分子生物学的手段进行 性别鉴定分析，已成为必要手段之一。传统形态学判断方法虽然普遍，但判断刚解出的麻雀 维鸟不管公母都一个颜色时则存在误差并不不可靠。而通过分子手段来进行性别鉴定，如 样品是麻雀幼体或缺损，腐败组织等，很难从传统形态学特征来判断麻雀的雌雄。于是出现 了利用DNA序列进行物种的鉴定的方法，它为物种性别鉴定，筛选有经济价值的品种提供了 方便，快捷，准确的手段。
[0003] 麻雀属于单态性鸟(monomo巧hie birds),即雌雄同型，无论是幼鸟还是成鸟都很 难从外观形态或其他行为上区分雌雄性别。刚解出的麻雀维鸟不管公母都一个颜色一一和 成年雌鸟颜色一样，头和背部没有酒红色的毛。雄维脸颊和吼部的毛色是淡青灰色（冷色 系），嘴下到吼部的毛根可W看到隐隐发黑，有的时候看到的黑色区域并不明显，可W通过 把鸟抓在手上，吹开喉部的羽毛，从毛根深黑转到毛尖灰色，有的毛尖会有点白岔。雌鸟脸 颊和吼部的毛色是淡黄褐色（暖色系），嘴下到吼部的毛色也是运样，同一色系连成一片或 其他常规方法来鉴定，但只能在出维之后进行。近年来发展的分子生物学方法可W将麻雀 的性别鉴定时间提早到胚胎期，而且正确率能够达到100%。
[0004] NIPBL(Nipped-B蛋白同源基因）基因在鸟类性别染色体Z和W上都有同源序列，在 新鸟下纲等鸟类中（麻雀属于新鸟下纲雀形目雀科雀属），参见Suh，A.，Kriegs，J.O.， Brosius,J.,&Schmitz,J.Retroposon insertions and the chronology of avian sex chromosome evolution.Mol Biol Evol[J] ,2011.28(11) :2993-2997.可知Z和W染色体基 因内含子片段长度不同，而在鸡雁小纲和古飄总目等几种鸟类中序列长度相似。
[0005] 故为了准确的鉴定出麻雀性别，使用便捷，准确的分子手段势在必行。但是利用分 子测序方法进行鉴定麻雀性别，需要大量成本。因此为了节约成本，本发明提供了特异性引 物，即可直观地，高效地判断出待测样本的雌雄。
[0006] 目前通过分子手段鉴定麻雀性别还没有相关应用，即现在没有报道基于NIPM^基 因（Nipped-B蛋白同源基因）的特定引物进行性别鉴定的专利，文献报导关于麻雀并获得成 功的例子也没有。
【发明内容】
[0007] 根据W上现有技术的不足，本发明所要解决的技术问题是提出一种用于鉴定麻雀 性别的特定基因的引物及其应用，目的是可W快速、可靠、准确的鉴定麻雀的性别。
[000引为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：
[0009] -种用于鉴定麻雀性别的特定基因的引物，所述引物包括序列号为SEQ ID NO.1 的KLNIP化-il6F2和序列号为沈Q ID N0.2的KLNIP化-il6R2。
[0010] -种采用权利要求1所述引物鉴定麻雀性别的方法，具体包括如下步骤：
[00川步骤一，提取待测样品的总DNA;
[0012] 步骤二，采用所述引物对步骤一提取的总DNA进行PCR扩增；
[0013] 步骤S，取步骤二中得到的PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测;并通过琼脂糖 凝胶电泳图中泳道出现的条带数进行判断。步骤=中所述条带数为两条，且两条条带中所 含有的DNA片段的长度分别约为8(K)bp和6(K)bp。在得到的琼脂糖凝胶电泳图中，若得到的产 物的泳道出现两条条带，则判断所述待测样品是雌麻雀，若含有步骤二得到的产物泳道中 出现一条条带，则判断该待测样品是雄麻雀。
[0014] 其中PCR扩增采用聚合酶链式反应，是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生 物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制，PCR的最大特点，是能将微量的DNA大幅增 加。
[0015] 为了达到更好的PCR扩增效果，使得得到的琼脂糖凝胶电泳图更清晰可见，便于更 好地确定实验结果，步骤二所述PCR扩增为两次，具体方法包括先对提取的总DNA进行第一 次PCR扩增，再将第一次PCR扩增后的产物为模板，W与第一次PCR扩增相同体系、相同程序 进行第二次PCR扩增。
[0016] 步骤二中所述PCR扩增是的PCR扩增体系为基准，每条引物的浓度分别为 2.化1，总DNA的用量为化1。
[0017] PCR扩增过程中的退火过程可W为本领域所常规使用的退火方式及返火参数，较 好的是，退火溫度为51-55°C，退火时间为30s-lmin;在本发明中，为了得到更好的扩增效 果，所述退火溫度为52 °C，所述退火时间为40s。
[0018] 具体的说，采用的多重PCR反应体系:Dream-化q buffer 2.扣L，引物各2.化L，化L 的dNTPMix，0.125化的Dream-Taq酶和1化的总DNA，1化的DMS0，并用双蒸水补齐至25化。
[0019] PCR反应条件为:94°C预变性2min;然后进行35个循环，该循环包括:94°C变性30s， 52°C退火30s和72°C延伸40s;最后再作72°C延伸lOmin。在上述反应条件下进行PCR扩增。
[0020] 本发明有益效果是:本发明通过基于NIPBL(Nipped-B蛋白同源基因）基因设计的 特异性引物，利用PCR扩增的方法，对待测样品通过两次一般的PCR扩增，再通过琼脂糖凝胶 电泳图中的条带显示判定出麻雀性别，且所用的模板可从动物的毛皮、肌肉组织、内脏外壳 等组织中提取，大大降低了取样的难度，而且该方法可简便快捷地鉴定麻雀性别，从而达到 了简便易行，经济实用准确地鉴定麻雀性别目的。本发明首次利用新开发的^?^^基因作为 麻雀性别鉴定W及作为性别鉴定新的分子标记。本发明方法技术实用性强，重复性好，可W 准确的鉴定麻雀性别。
【附图说明】
[0021] 下面对本说明书附图所表达的内容及图中的标记作简要说明：
[0022] 图1是本发明的实施例1-3和对比例1-3的扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图。
[002引其中，泳道1和泳道2来自K0672肌肉样品，泳道3和泳道4来自K0673的肌肉样品，泳 道5和泳道6来自K0619的肌肉样品，泳道7和泳道8来自K0663的肌肉样品，泳道9和泳道10来 自K0617的肌肉样品，泳道11和泳道12来自K0618的肌肉样品，泳道M为分子量标记。
【具体实施方式】
[0024] 下面对照附图，通过对实施例的描述，对本发明的【具体实施方式】如所设及的工艺 及操作使用方法等，作进一步详细的说明，W帮助本领域技术人员对本发明的发明构思、技 术方案有更完整、准确和深入的理解。
[0025] 需要阐明的是，所述引物均由通用生物系统（安徽）有限公司合成且引物浓度为 加 mol，本发明中使用的dNTPMix为hkara公司的市售品，Dream-taq buffe;r，Dream-taq为 biotool公司的市售品，其余所使用的化学试剂均为常规市售分析纯试剂。
[0026] 样品的取材:3只雌性麻雀，3只雄性麻雀。
[0027] 实施例1
[00%] 1)总基因组的提取:采用酪、氯仿抽提法，取约50mg编号为K0672(见下表1)的肌肉 组织样本，剪碎后置于一只已灭菌的2. OmL的EP管；
[0029] 2)在EP管中加入ImL的DNA提取液及4化20mg/mL的RNaseA(核糖核酸酶），摇匀后 置于37°C水浴锅中水浴化；
[0030] 3)取出EP管，加入扣L20mg/mL的蛋白酶K，摇匀后置于50°C水浴锅中水浴约2-化， 直至肌肉完全消化，期间每隔lOmin上下摇匀；
[0031] 4)取出EP管，待冷却至室溫后，加入等体积的饱和酪，溫和上下摇匀约7分钟直至 水相与酪相混合成乳状液；
[0032] 5)10000rfm，10°C下离屯、15min,取出上层水相至另一 20mLEP管中；
[0033] 6)重复酪提取一二次；
[0034] 7)加入等体积的CI(氯仿异戊醇），溫和上下摇匀约7min，10000巧m，10°C下离屯、 15min，取出上层水相至另一 2.0mLEP管中；
[0035] 8)再次加入等体积的CI和上下摇匀约7min, 10000;rPm, 10°C下离屯、15min，取出上 层水相至另一 1.5mL EP管中（分装到2管中，每管30化L)
[0036] 9)加入1 /5体积的3mo 1 /1化AC (醋酸钢)及2倍体积预冷的无水乙醇，室溫轻摇EP 管置于-20°C冰柜中冷冻化；
[0037] 10)从冰柜中取出EP管，1200化化，4 °C离屯、15min，并弃上清；
[003引 11)加入500化75%乙醇漂洗，12000rfm，4°C离屯、15min，并弃上清；
[0039] 12)再加入500化75%乙醇漂洗，12000计111，4°(：离屯、15111111，并弃上清，后风干沉 淀；
[0040] 13)加入 100 化 1*TE 溶解 DNA;
[0041] 14)取化LDNA溶液进行琼脂糖凝胶电泳；
[0042] 15)总DNA置于-40 °C冰柜中储存。
[0043] 向PCR仪的样品管中加入化eam-taq buffer 2.扣L，引物（下表2所示)各2.化L，化 L的dNTPMix，0.125化的化earn-化q酶和化L的总DNA，1化的DMS0(二甲基亚讽），并用双蒸水 补齐至25化。
[0044] PCR反应条件为:94°C预变性2min;然后进行35个循环，该循环包括:94°C变性30s， 52°C退火40s和72°C延伸40s;最后再作72°C延伸lOmin。在上述反应条件下进行PCR扩增。将 扩增后的产物作为模板在同样程序，同样体系进行二次扩增，再进行琼脂糖凝胶电泳，电泳 结果如图1所示(泳道编号为1)。
[0045] 实施例2
[0046] 按照实施例1的方法进行操作，不同的是，取待测样品其编号为K0673(下表1所 示），电泳结果如图1所示(泳道编号为3)。
[0047] 实施例3
[0048] 按照实施例1的方法进行操作，不同的是，取待测样品其编号为K0663(下表1所 示），电泳结果与实施例1相同（泳道编号为5)。
[0049] 对比例1
[0050] 将表1中编号为K0617按照实施例1的方法进行扩增及琼脂凝胶电泳，电泳结果如 图1所示(泳道编号为7)。
[0化1] 对比例2
[0052]按照对比例1的方法进行操作，不同的是，待测样品编号为K0618(下表1所示），电 泳结果如图1所示(泳道编号为9)。
[0化3] 对比例3
[0054] 按照对比例1的方法进行操作，不同的是，待测样品编号为K0619(下表1所示），电 泳结果如图1所示(泳道编号为11)。
[0055] 将所得到的PCR产物送至通用生物系统(安徽)有限公司进行测序。
[0化6] 实施例1-3和对比例1-8的待测样品信息如下表1 「0化71
[0060]通过表1的样品信息和图1所示的电泳图可W看出，本发明通过基于NIPM^基因设 计的特异性引物，对待测样品通过二次普通的PCR扩增，再通过琼脂糖凝胶电泳图中的条带 显示判断出麻雀的性别，且电泳结果与样品信息完全符合，证实了该鉴定方法的可靠性，同 时，送至通用生物系统(安徽)有限公司进行测序的DNA片段的序列与数据库中己存在斑胸 草雀的化?^^^列进行比对后，得到的比对结果表明同源性在97%^上，故而也进一步证实 了麻雀的性别，而且在本实验中，所用的模板可从动物的毛皮、肌肉组织、内脏、外壳等组织 中提取，大大降低了取样的难度，而且该方法可简便快捷地，从而达到了简便易行，经济实 用准确地鉴定麻雀性别的目的。
[0061]上面结合附图对本发明进行了示例性描述，显然本发明具体实现并不受上述方式 的限制，只要采用了本发明的方法构思和技术方案进行的各种非实质性的改进，或未经改 进将本发明的构思和技术方案直接应用于其它场合的，均在本发明的保护范围之内。本发 明的保护范围应该W权利要求书所限定的保护范围为准。
【主权项】
1. 一种用于鉴定麻雀性别的特定基因的引物，其特征在于，所述引物包括序列号为SEQ ID N0.1 的KLNIPBL-il6F2和序列号为SEQ ID N0.2的KLNIPBL-il6R2。2. 采用权利要求1所述引物在麻雀性别鉴定中的应用。3. -种采用权利要求1或2所述引物鉴定麻雀性别的方法，具体包括如下步骤： 步骤一，提取待测样品的总DNA; 步骤二，采用所述引物对步骤一提取的总DNA进行PCR扩增； 步骤三，取步骤二中得到的PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测;并通过琼脂糖凝胶 电泳图中泳道出现的条带数进行判断。4. 根据权利要求3所述鉴定麻雀性别的方法，其特征在于，步骤二所述PCR扩增为两次， 具体方法包括先对提取的总DNA进行第一次PCR扩增，再将第一次PCR扩增后的产物为模板， 以与第一次PCR扩增相同体系、相同程序进行第二次PCR扩增。5. 根据权利要求3所述鉴定麻雀性别的方法，其特征在于，步骤三中所述条带数为两 条，且两条条带中所含有的DNA片段的长度分别约为800bp和600bp。6. 根据权利要求3所述鉴定麻雀性别的方法，其特征在于，步骤二中所述PCR扩增是以 25μ1的PCR扩增体系为基准，每条引物的浓度分别为2.2μ1，总DNA的用量为ΙμL。7. 根据权利要求3所述鉴定麻雀性别的方法，其特征在于，步骤二中所述PCR扩增的过 程中退火温度为51-55°(：，退火时间为3〇8-11^11。8. 根据权利要求7所述鉴定麻雀性别的方法，其特征在于，所述退火温度为52°C，所述 退火时间为40s。
【文档编号】C12Q1/68GK106048044SQ201610547230
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年7月13日
【发明人】阚显照, 王青青, 陆文康, 王萍, 蒋澜, 王莹, 章勤, 吴璇, 丁恒武
【申请人】安徽师范大学