一种能提高重组普鲁兰酶表达量的信号肽突变体及其应用
【专利摘要】本发明公开了一种能提高重组普鲁兰酶表达量的信号肽突变体及其应用。此信号肽突变体通过对来源于短芽孢杆菌(Bacillus brevis)的ɑ?乙酰乳酸脱羧酶基因信号肽序列的N端进行饱和突变获得。突变的具体位点在将第七位的苏氨酸替换为缬氨酸。突变体信号肽与未突变信号肽相比，能提高来源于长野芽胞杆菌(Bacillus naganoensis)的重组普鲁兰酶在枯草芽孢杆菌中的胞外表达50％以上，有很好的应用价值。
【专利说明】
一种能提高重组普鲁兰酶表达量的信号肽突变体及其应用
技术领域
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体是一种能提高重组普鲁兰酶表达量的信号肽突变 体及其应用。
【背景技术】
[0002] 普鲁兰酶(Pullulanase，EC 3.2.1.41)可专一性地水解多糖的α-l，6-糖苷键，使 支链淀粉型多糖的分支链脱离主链，在淀粉加工工业中有着重要的用途。与α_淀粉酶、糖化 酶配合使用生产医用葡萄糖时，可将淀粉彻底降解为葡萄糖，并可使葡萄糖的结晶明显加 快，提高设备利用率。与淀粉酶配合使用，几乎可以将淀粉100%地转化成麦芽糖，从而得 到0.8g/ml以上的超高麦芽糖浆;在啤酒生产中添加普鲁兰酶可提高糖的利用率，缩短糖化 时间。
[0003] 来源于长野芽孢杆菌的普鲁兰酶具有较好的pH适应性，在60°C时测得最适pH为 5.0，在pH 4.5条件测得最适温度为62.5°C ;此酶热稳定性较好，在pH 4.5、60°C与淀粉水解 物共同保存232h仍有50%的残余酶活，而来源于嗜酸普鲁兰芽孢杆菌的普鲁兰酶同样条件 下保存121个小时就损失50%的活力。1999年Teague W.Martin等人克隆长野芽孢杆菌普鲁 兰酶基因，并在原核生物表达系统枯草芽孢杆菌中利用质粒重组表达，发酵113h后最高酶 活可达813U/ml，产生的重组普鲁兰酶具有很好的应用特性。2012年李晓明等在枯草芽孢杆 菌中整合表达长野芽孢杆菌普鲁兰酶基因，发酵40小时左右可得到胞外酶活接近1000U/ ml〇
[0004] 信号肽对于蛋白的分泌表达起着关键的作用。在枯草芽胞杆菌中，蛋白质分泌到 细胞膜外主要通过两种途径，Sec途径和TAT途径，其中，绝大部分蛋白质是通过Sec途径分 泌的，只有少量需要先折叠的蛋白质通过TAT途径分泌。Sec途径的信号肽虽然没有可识别 的通用序列，但它们基本都由三个部分组成：由6个氨基酸组成的带正电的N端，10-18个氨 基酸组成的疏水中间部分，以及一个亲水的C端。N端对于信号肽的识别和结合起着至关重 要的作用，因此，对N端进行饱和突变，将有可能得到分泌效果更佳的信号肽突变体。而且， 突变体信号肽有可能将蛋白的合成与运送达到一个更佳的平衡，这也能够提高表达蛋白的 总量。
[0005] 本发明利用饱和突变对来源于短芽孢杆菌(Bacillus brevis)的α_乙酰乳酸脱羧 酶基因的信号肽进行改造，提高来源于长野芽孢杆菌的普鲁兰酶在枯草芽胞杆菌中的胞外 表达量。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一种能够提高重组普鲁兰酶表达量的信号肽突变体及其应 用。具体是利用饱和突变对来源于短芽孢杆菌(Bacillus brevis)的α_乙酰乳酸脱羧酶基 因的信号肽进行改造，获得能够提高来源于长野芽孢杆菌的普鲁兰酶在枯草芽孢杆菌中表 达量的突变体.
[0007] 本发明解决上述技术问题的技术方案如下：
[0008] 通过饱和突变筛选获得一种来源于短芽孢杆菌(Bacillus brevis)的α-乙酰乳酸 脱羧酶基因的信号肽突变体，此突变体是第七位的苏氨酸替换为缬氨酸，其能提高重组普 鲁兰酶表达量。
[0009] 上述信号肽突变体与来源于长野芽胞杆菌(Bacillus naganoensis)的普鲁兰酶 的组合成新的氨基酸片断，其序列如下： 「00131
[0014]将能够编码上述新的氨基酸片断的DNA片断以整合到染色体或者以质粒载体的方 式转入枯草芽胞杆菌中，获得重组枯草芽胞杆菌。
[0015] 利用上述的重组枯草芽胞杆菌进行常规发酵生产普鲁兰酶。
[0016] 本发明的优点是:利用快速高效的方法获得优化的信号肽突变体，有效提高普鲁 兰酶在枯草芽胞杆菌中的胞外表达量。
【具体实施方式】
[0017] 下面结合实施例对本发明作进一步描述。但需要说明的是，实施例并不构成对本 发明要求保护范围的限制。
[0018] 实施例1
[0019] 本实施例说明获得来源于短芽孢杆菌(Baci 1 lus breviS)的α-乙酰乳酸脱羧酶基 因的信号肽突变体、以及获得包含此突变体与来源于长野芽胞杆菌（Bacillus naganoensis)的普鲁兰酶组合氨基酸的重组枯草芽孢杆菌的方法.
[0020] 1 ·构建重组质粒PMLK83-P43
[0021 ] 根据Genbank中注释的启动子P43序列，设计上游引物为5'attgctggacgcttatggac 3' 和下游引物为5 ' cgggatccattcctctcttacctataat 3 ' ICR反应体系 100ul :DNA模板(枯草 芽孢杆菌 1A751 总DNA)lul(约20ng)，5XPrimeSTAR Buffer 20ul，10pmol/ul dNTP 2ul， lOpmol/ul正反向引物各为2ul，2.5U/ul PrimeSTAR HS DNA聚合酶lul，添加 ddH20至 100111。卩〇?反应程序：941€511^11 ;941€308,601€308,72°(：111^11，30个循环；72°(：1011^11 ;4°(：保 存。PCR片段和质粒pMLK83用限制性内切酶BamH I、Hind III分别进行双酶切后用T4连接酶 进行连接，转化到大肠杆菌DH5a中，经筛选鉴定获得重组质粒pMLK83-P43。
[0022] 2 ·构建重组质粒 pMLK83-P43-bnPul
[0023] 人工合成如下DNA片断：
[0024]
[0025]
[0026] 将合成的DNA片段和质粒pMLK83-P43用限制性内切酶BamH I和Sac II进行双酶切 后用T4连接酶进行连接，转化到大肠杆菌DH5a感受态细胞中，经筛选鉴定获得重组质粒 pMLK83-p43-bnPul.
[0027] 3.利用饱和突变的方法获得来源于短芽孢杆菌(Bacillus brevis)的a-乙酰乳酸 脱羧酶基因的信号肽N端的单突变库。具体步骤如下：
[0028]合成如下引物：
[0029] PML1:GCTCTAGAGGATCCATGNNSAAAAATATCATCACTTCT
[0030] PML2:GCTCTAGAGGATCCATGAAANNSAATATCATCACTTCTATC
[0031] PML3:GCTCTAGAGGATCCATGAAAAAANNSATCATCACTTCTATCACA
[0032] PML4:GCTCTAGAGGATCCATGAAAAAAAATNNSATCACTTCTATCACATCT
[0033] PML5:GCTCTAGAGGATCCATGAAAAAAAATATCNNSACTTCTATCACATCTCTG
[0034] PML6:GCTCTAGAGGATCCATGAAAAAAAATATCATCNNSTCTATCACATCTCTGGCT
[0035] (N:dNTPs；S:dCTP and dGTP)
[0036] PMR TATGAGGTAA CAGGACAAGG
[0037] 以质粒 pMLK83-p43-bnPul 为模板，分别用 PML1/PMR，PML2/PMR，PML3/PMR，PML4/ PMR，PML5/PMR和PML6/PMR为引物进行PCR扩增，获得信号肽N端单突变PCR产物库:M1-M6。
[0038] 分别将M1-M6用BamH I/Nco I酶切后，胶回收 1160bp片断；将pMLK83-p43-bnPul用 BamH I/Nco頂每切后，胶回收长度大约为llOOObp的片断；将两片断用T4连接酶进行连接 后，转化大肠杆菌DH5a感受态细胞。从转化子混合菌落中分别提取质粒，得到带信号肽N端 单突变库的普鲁兰酶整合表达质粒4]?0(83143-131^111-]\114]\10(83143-131^111-]\12， pMLK83-p43-bnPul-M3，pMLK83-p43-bnPul-M4，pMLK83-p43-bnPul-M5和pMLK83-p43-bnPul_M6〇
[0039] 4.将带信号肽N端单突变库的普鲁兰酶整合表达质粒转化到枯草芽孢杆菌WB600 感受态细胞中
[0040]取一满环枯草芽孢杆菌甘油菌划LB平板（LB培养基：蛋白胨1 %，酵母膏0.5 %， NaCll%，平板加1.5%Agar)，37°C培养箱培养过夜。转化前一天晚间挑单菌落至3ml LB培 养基中，37°C，250rpm摇床培养过夜，第二天上午取160μ1培养液转接至8ml SPI培养基中 (SPI培养基:SP盐加1 %体积浓度为50 % (W/V)葡萄糖溶液，1 %体积100 X CAYE溶液;SP盐溶 液：含1.968/1(順2)25〇4，13.728/11(2册〇4,5.888/11012?〇4,0.1968/1]\%5〇4.7!12〇(单独灭 菌)和0.98 g//L柠檬酸钠；100 X CAYE溶液:含20g/L酪蛋白氨基酸和100g/L酵母抽提物），37 °C，250rpm摇床培养至对数生长末期（约4~5小时）；取0.2ml生长至对数末期的培养液至 2ml SPII培养基中（SPII培养基：SPI培养基加入1%体积50mmol/L CaCl2溶液，1%体积 250mmol/L MgCl2溶液），37°C，100rpm摇床培养90分钟；在上述SPII培养基的菌体中加入 20ul 10mmol/L EGTA，再于37°C，100rpm摇床培养10分钟；将上述处理后的菌液分装成 0.5ml每管，加入5ul pMLK83-p43-bnPul-Ml质粒（50ng/ul)，再于37°C，250rpm摇床培养90 分钟，取菌液涂布新霉素(20ug/ml)LB平板，转化子库即是含来源于短芽孢杆菌(Bacillus brevis)的α-乙酰乳酸脱羧酶基因的信号肽N端ATG后第一个氨基酸突变的枯草芽孢杆菌基 因工程菌株突变库WB600[p43-bnPul-M2]。
[0041 ] 用同样方法获得枯草芽孢杆菌基因工程菌株突变库WB600[p43-bnPul-M3]，WB600
[p43-bnPul-M4]，WB600[p43-bnPul-M5]，WB600[p43-bnPul-M6]以及WB600[p43-bnPul- M7]。未突变的pMLK83-p43-bnPul质粒转化WB600获得的枯草芽孢杆菌基因工程菌株为 WB600[p43-bnPul]〇
[0042] 5.高酶活表达克隆的筛选
[0043]从上述枯草芽孢杆菌基因工程菌株突变库中，每个突变库挑选368个转化子分别 接种至每孔含lmL LB液体培养基的96孔深孔培养板中。37°C，250rpm摇床培养24小时后，测 定上清液普鲁兰酶酶活，并菌株WB600[p43-bnPul ]的表达酶活进行比较。
[0044] 普鲁兰酶酶活的测定按如下方法进行。
[0045] 取10mL具塞试管8 支，分别加入0.0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8mL葡萄糖 标准溶液(称取0. l〇〇g试剂级葡萄糖，溶于蒸馏水，定容至100mL)，然后向各管加蒸馏水使 溶液达1.0mL，再各加1. OmL DNS试剂（甲液:称取6.9g结晶酚溶于15.2mL 10 %的NaOH溶液， 用蒸馏水稀释至69mL，再加入6.9g亚硫酸氢钠；乙液:称取255g酒石酸钾钠溶于300mL 10% 的NaOH溶液，再加入880mL 1 %的3，5-二硝基水杨酸溶液；甲液和乙液混合得黄色试剂贮于 棕色瓶内，室温下避光放置7天后作标准曲线(每次配制后要重新作标准曲线）），摇匀，在沸 水浴中准确加热5min，取出，流动水冷却至室温，用蒸馏水定容至10mL，混匀，用分光光度计 在540nm波长下进行比色，记录吸光度。以吸光度为纵坐标，以葡萄糖含量(μπιο?)为横坐标， 绘制标准曲线，计算出标准曲线的斜率h。
[0046]用移液管吸取9mL 1%普鲁兰糖溶液(称取1.0g试剂级普鲁兰糖，加入0.02M醋酸 盐缓冲液(PH5.0)，搅拌至溶解，定容至100mL(现配现用））到25mL具塞试管，置于60°C ±0.5 。(：（或80°C ±0.5°C )恒温水浴锅预热5min后，加入1. OmL样品溶液（用0.02M醋酸盐缓冲液 (pH5 · 0)适当倍数稀释），混匀，置于60°C ± 0 · 5°C (或80 °C ± 0 · 5 °C )恒温水浴锅准确反应 lOmin，置于冰水浴2min终止反应，混匀，吸取1. OmL溶液至10mL具塞试管，加入1. OmL DNS试 剂，摇匀，在沸水浴中准确加热5min，取出，流动水冷却至室温，用蒸馏水定容至10mL，混匀， 以空白对照调零，用分光光度计在540nm波长下进行比色，记录吸光度。空白对照由灭活后 的样品溶液代替样品溶液。
[0047]普鲁兰酶活力单位(U)定义为lml酶液在60°C，pH5.0条件下，1分钟水解1%普鲁兰 生成Ιμπιο?还原糖，即为1个酶活力单位，以U/ml表示。
[0048] 普鲁兰酶酶活力(U/mL)=EXnX 10/(10 Xh)=EXn/h
[0049] 式中：E为样品溶液的吸光度;分母的10为lOmin换算为1分钟的倍数;η为样品溶液 反应前的稀释倍数;分子10为lmL反应液换算成10mL反应液的倍数;h为标准曲线的斜率。
[0050] 确定高活力的菌落后，提取菌落总DNA，用PCR方法扩增包含突变区域的片段，然后 测序确定突变的位点。测序结果表明具有最高胞外表达活力的突变体是信号肽第七位的苏 氨酸替换为缬氨酸，带有此突变体的枯草芽孢杆菌基因工程菌株命名为：WB600[p43-bnPul-T7V]〇
[0051 ] 实施例2
[0052]本实施例说明利用实施例1所述的重组枯草芽胞杆菌生产普鲁兰酶的方法。
[0053] 操作步骤如下：
[0054] 1)一级种的制备:将上述枯草芽孢杆菌基因工程菌株单菌落在4ml LB液体培养基 37°C、220rpm摇床培养过夜，所得的菌种为一级种。
[0055] 2)二级种的制备:一级种接种于800ml LB液体培养基，于37°C，220rpm摇床培养至 0D600为0.6左右(约4~5小时）。
[0056] 3)三级种的制备:将二级种接种到80L LB液体发酵罐中，温度控制在37°C，以柠檬 酸、NaOH控pH 7.0,通风搅拌5~6小时，溶氧控制在20~30%，培养至0D600为0.6左右（约5 ~6小时）。
[0057] 4)生产罐发酵:将三级种接种到3T发酵罐中，LB液体培养基，36~38°C，通风搅拌， 溶氧控制在20~30 %，以柠檬酸、NaOH控pH 6~8,培养约26小时，10000g离心力离心除菌， 用截留分子量5000~10000超滤膜浓缩上清液后，即得普鲁兰酶浓缩原液。
[0058]经测定，发酵原液离心后，各枯草芽孢杆菌基因工程菌株发酵表达的最高酶活见 表1。
[0059] 表 1
[0060]
【主权项】
1. 一种来源于短芽抱杆菌(Bacillus brevis)的α-乙酷乳酸脱簇酶基因的信号肤突变 体，其特征在于，第屯位的苏氨酸替换为鄉氨酸。2. 如权利要求1所述的信号肤突变体与来源于长野芽胞杆菌(Bacillus naganoensis) 的普鲁兰酶组合成的氨基酸片断，其特征在于，其序列如下：3. -种枯草芽胞杆菌，其特征在于，其细胞中包含能够编码权利要求2所述的组合氨基 酸片断的DNA片断。4. 一种重组普鲁兰酶的生产方法，其特征在于，利用权利要求3所述的枯草芽胞杆菌进 行常规发酵生产普鲁兰酶。
【文档编号】C07K14/00GK106084016SQ201610125646
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年3月7日 公开号201610125646.1, CN 106084016 A, CN 106084016A, CN 201610125646, CN-A-106084016, CN106084016 A, CN106084016A, CN201610125646, CN201610125646.1
【发明人】李晓明, 黄日波, 廖东庆, 梁莲华, 李丛, 韦旭钦, 王青艳, 蒙健宗
【申请人】南宁邦尔克生物技术有限责任公司