324aa小分子多肽及其载体和应用
【专利摘要】本发明公开了324aa小分子多肽及其载体和应用。本发明利用生物工程技术基因重组一段324个氨基酸多肽对应的DNA序列到PCMV?HA真核表达载体。细胞学实验表明此多肽具有抑制胶质瘤细胞活性和生长的重要抗癌功能。发明为肿瘤治疗开发新的靶点提供实验依据，对于应用于肿瘤的临床治疗具有十分重要的开发应用前景。
【专利说明】
324aa小分子多肽及其载体和应用
技术领域
[0001]本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及324aa小分子多肽及其载体和应用。
【背景技术】
[0002] 胶质瘤(Glioma)是中枢神经系统最常见的恶性肿瘤，其发病率约占颅内原发肿瘤 的50%，且近2/3的胶质瘤是高度恶性肿瘤，每年全球约有近60万中青年人死于该疾病。由 于胶质瘤具有发病率、复发率及死亡率高、治愈率低的特点，成为神经外科领域临床治疗的 难题之一。因此，加强治疗胶质瘤的研究，探索新的治疗途径具有十分重要的意义。
[0003] 在胶质瘤进展过程中，某些基因的表达发生变化，是胶质瘤发生发展的关键基因， 成为胶质瘤治疗的潜在靶点。目前用于胶质瘤的临床治疗的潜在靶点鲜见报道。
【发明内容】
[0004] 发明目的:针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种324aa小分子多 肽，具有抗胶质瘤的应用价值。本发明的另一目的是提供上述324aa小分子多肽的表达载 体。本发明还有一目的是提供上述324aa小分子多肽的应用。
[0005] 技术方案:为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：
[0006] 324aa小分子多肽，其氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示。
[0007] 编码所述的324aa小分子多肽的基因，其DNA序列如SEQIDN0.2所示。
[0008]含有所述的324aa小分子多肽的编码基因的DNA序列的载体。
[0009]所述的载体，将324aa小分子多肽的DNA序列连接进PCMV-HA真核表达载体，构建出 重组表达质粒。
[0010]所述的324aa小分子多肽在制备抗肿瘤药物中的应用。
[0011] 有益效果：与现有技术相比，本发明利用生物工程技术，基因重组一段324个氨基 酸(amino acid)多肽对应的DNA序列到PCMV-HA真核表达载体，经酶切和序列分析证明重组 成功后，将此真核表达重组多肽转染到胶质瘤细胞中，免疫印迹证明多肽的蛋白表达，实现 了多肽的重组，接着对多肽的抗胶质瘤功能进行了研究，细胞学实验表明此多肽具有抑制 胶质瘤细胞活性的重要抗癌功能。为肿瘤治疗开发新的靶点提供实验依据，对于应用于肿 瘤的临床治疗具有十分重要的开发应用前景。
【附图说明】
[0012] 图1是PCMV-HA真核表达载体的结构示意图；
[0013]图2是324aa多肽对应的DNA序列免疫印迹蛋白表达结果图，大小为37KD;
[0014]图3是PI染色流式细胞术检测324aa多肽抑制U251细胞增殖结果图；
[0015]图4是CCK-8实验检测324aa多肽对U251活性的抑制结果图。
【具体实施方式】
[0016] 下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。实施例中未注明具体条件的实验 方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南（第三版，J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等 译，科学出版社，2002年）中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件进行。
[0017] 实施例1 324aa多肽重组
[0018]抑制胶质瘤细胞活性的324aa多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示，编码该蛋 白的DNA序列如SEQ ID N0.2所示。本实施例的多肽重组表达质粒是将SEQ ID N0.2序列连 接进PCMV-HA真核表达载体(图1)。主要过程如下：
[0019] 1)重组肽的克隆载体构建
[0020] 提取人的mRNA，逆转录为cDNA，以cDNA为模板，上游引物为5'-CGGAATTCGGGTGAGGAGCAGGCAAATGT (含EcoRl 酶切位点）；下游引物为5 ' -GGGGTACCTGTGATGGAAGGGGGGGA(含Kpnl酶切位点），应用PCR技术成功扩增出324aa对应的 972bp的mRNA序列。扩增得到的片段与PCMV-HA载体连接，将连接产物转入感受态大肠杆菌 DH5a中，在含Amp+琼脂平板上挑选克隆，以碱裂解法小提重组质粒后，以EC0R1酶切鉴定。主 要步骤如下：
[0021] (1)在冰浴中，将以下各成分加入一无菌0.2mL离心管中。
[0022] 总体积50uL:5uL lOXPfu Buffer，4uL dNTP(2mM)，luL模板，luL上游引物，luL下 游引物，〇.5uL Pfu酶，37.5uL ddH20。
[0023] (2)将上述混合液稍加离心，立即置PCR仪上，执行扩增。一般：在93°C预变性3-5min，进入循环扩增阶段:93°C30s-58°C30s-72°C30s，循环30次，最后在72°C保温7min。
[0024] (3)结束反应，PCR产物放置于4 °C待电泳检测或-20 °C长期保存。
[0025] (4)PCR的电泳检测:取PCR产物加6 X上样缓冲液，电泳检测。
[0026] 2)重组肽的真核表达载体构建及其表达鉴定
[0027]将含有324aa多肽核酸片段的PCMV-HA质粒经EC0R1酶切后，利用回收试剂盒获得 该片段，同时用相同的酶处理质粒PCMV-HA，然后将回收多肽核酸片段和经酶切的载体 pcDNA3.1在T4DNA连接酶作用下于16°C连接过夜。酶切鉴定重组体。将正确连接的324aa多 肽真核表达载体转染U251细胞，48小时后搜集样品，RIPA细胞裂解液裂解，免疫印迹结果证 明了多肽的表达，如图2所示。
[0028]实施例2重组肽抗胶质瘤功能的检测
[0029] 1)PI染色流式细胞术实验证明重组肽细胞水平的抗胶质瘤效应 [0030] PI染色流式细胞分析术检测细胞周期：在U251细胞中，转染野生型、324aa片段截 短的MDM2载体48h后，胰酶消化细胞，完全培养基终止消化并收集到5mL EP管中离心后弃掉 培养基，用预冷的细胞PBS重悬洗涤3次，离心，弃掉PBS，用70 %乙醇重悬，置于-20 °C固定至 少24h。检测前，离心收集的细胞，弃乙醇，用roS洗涤3次，并用含l%Triton X-100的roS，4 。(:通透，每管200yL。后加入RNaseA，避光4°C反应，每管300-400yL。加入200yL PI染色剂，避 光4°C染色20min，每管200yL，流式细胞仪检测。结果如图3,324aa多肽能够抑制胶质瘤细胞 增殖。
[0031] 2)CCK-8实验证明重组肽细胞水平的抗胶质瘤效应
[0032] CCK-8细胞增殖实验:在U251细胞中，转染野生型，324aa片段截短的MDM2载体48h 后收集细胞，每孔5000个细胞接种到96孔板，每孔体积100yL。待细胞完全贴壁后(根据实验 目的和实际情况决定培养时间），每孔换液(CCK-8与培养液的比例为1:10)，37°C孵育2h，终 止培养，酶标仪以490nm波长测量各孔的吸光度值，每组设四复孔。每24h测定各组CCK-8吸 光度值一次，共检测5天，以时间为横坐标，吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。结果如图4， 324aa多肽能够抑制胶质瘤细胞的活性。
【主权项】
1.324aa小分子多肽，其氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示。2. 编码权利要求l所述的324aa小分子多肽的基因，其DNA序列如SEQIDN0.2所示。3. 含有权利要求2所述的324aa小分子多肽的编码基因的DNA序列的载体。4. 根据权利要求3所述的载体，其特征在于：将324aa小分子多肽的DNA序列连接进 PCMV-HA真核表达载体，构建出重组表达质粒。5. 权利要求1所述的324aa小分子多肽在制备抗肿瘤药物中的应用。
【文档编号】C12N15/12GK106084028SQ201610514367
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年6月30日
【发明人】沈爱国, 王燏婵, 王东林, 许 鹏
【申请人】南通大学