一种能促进台湾相思营养元素吸收的混合内生真菌的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种能促进台湾相思营养元素吸收的混合内生真菌，所述混合内生真菌由台湾相思内生真菌刺盘孢属（Colletotrichum sp.）D菌株与镰刀菌属（Fusarium sp.）E菌株组成，其已于2016年1月27日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保藏，其中，D菌株保藏号为CGMCC No.11907，E菌株保藏号为CGMCC No.11909。本发明混合内生真菌中所用菌株是从台湾相思植株中分离纯化得到的，将该混合内生真菌制备成应用菌液，对台湾相思的生长具有显著促进作用，能促进植株对营养元素的吸收，可用于台湾相思苗木的根际土壤浇施与苗木直接接种。CGMCC No. 1190720160127CGMCC No. 1190920160127
【专利说明】
一种能促进台湾相思营养元素吸收的混合内生真菌
技术领域
[0001] 本发明涉及一种能促进台湾相思营养元素吸收的混合内生真菌及其应用。
【背景技术】
[0002] 植物内生菌的研究始于19世纪末，Vogl从黑麦草Lolium temulentum L.种子中分 离出第一株内生菌。但真正开始大量研究植株中的内生菌起始于上世纪八十年代，主要是 在温带地区、亚热带地区和热带地区的植被中开展研究。
[0003] 植物内生真菌的分布广、种类多，前人研究表明，绝大多数植物体内都能分离得到 内生真菌，由此可见内生真菌普遍存在于植物体内。在全世界范围内至少在80多个属290多 种的禾本科农作物中发现了内生菌。目前从植物中分离的内生菌根据其具有的独特功能可 以分为：固氮菌、固钾菌、固磷菌等植物促生菌、具有抗病虫害的生防菌和具有促进植物对 不良环境的修复能力的抗性菌。
[0004] 经查阅文献材料，目前有关内生真菌对台湾相思生长的影响研究还为空白。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种能促进台湾相思营养元素吸收的混合内生真菌，其所 用菌株是从台湾相思植株中分离纯化得到的，其制成的应用菌液对台湾相思的生长具有显 著促进作用，能促进植株对营养元素的吸收。
[0006] 为实现上述目的，本发明采用如下技术方案： 一种能促进台湾相思营养元素吸收的混合内生真菌，其由台湾相思内生真菌刺盘孢属 (CoDeioiricA? Sj〇.)D菌株和镰刀菌属（Fusarit/ffi Sj〇.)E菌株组成；所述刺盘孢属 (CoS/7. )D菌株和镜刀菌属(Ft/sai-i? S/7. )E菌株已于2016年1月27日在中国 微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保藏(地址为北京市朝阳区北辰西路1号 院3号），其中，D菌株的保藏号为CGMCCNo. 11907，E菌株的保藏号为CGMCCNo. 11909。
[0007] 所用台湾相思内生真菌的分离、纯化过程包括： A、 材料:将采集得到不同年份的根、枝茎、叶分成三个部分，用自来水清洗干净，分装到 自封袋内，于4°C冰箱保存； B、 消毒:75%酒精漂洗30s-无菌水冲洗3-4次-15%的次氯酸钠漂洗(根10min，茎5min， 叶2min)-无菌水冲洗4-5次;将样品最后一次浸洗后的水盛于灭菌的小烧杯中，在平板上 划线作为对照，以检验样品的消毒是否彻底，若干天后如有菌落生成，则表明样品表面消毒 不彻底，需继续调整消毒方法； C、 接种部位的选择:叶片：叶尖部、叶中部和叶基部3个处理;枝茎:上中下分为3部位， 其中第3部位为枝茎交接处;根部:分为根尖和根基2个部分； D、 接种:将消毒后的外植体用接种刀切开，铺放在培养基表面，于28°C恒温培养箱内培 养5-7天后观察菌落生长状况;有的菌株繁殖迅速，可先将其产生的菌株进行分离纯化;生 长缓慢且数量较少的菌株可延长观察时间，直到其生长稳定后纯化； 固体培养:使用改良马丁固体培养基，配方为蛋白胨5.Og/L、酵母浸出粉2.Og/L、葡萄 糖20 · Og/L、磷酸氢二钾1 · Og/L、硫酸镁0 · 5g/L、琼脂14 · Og/L、其它为无菌水，pH值6 · 4土 0.2，培养温度为28 °C，培养方式为平板培养，培养时间为48h; E、将分离繁殖出的不同种类的内生真菌接入平板培养基进行纯化，经过2-3次点接纯 化、转接后分别得到单一菌种的上述Co? e ?o iri cA S/7.和Fusari S/7.功能菌株。
[0008]所得能促进台湾相思营养元素吸收的混合内生真菌可制备成应用菌液，用于台湾 相思苗木的根际土壤浇施与苗木直接接种。
[0009]所述应用菌液的制备方法是分别将刺盘孢属（CoDeioiricA? S/7. )D菌株和镰刀 菌属印.）E菌株接入液体培养基，摇床振荡培养，培养温度为28°C，培养时间48~ 72h，利用血球计数板计算菌液浓度，然后将菌液用超纯水稀释成5.5 X 106cfu/mL，再按体 积比1:1将两种菌液混合制得;所述液体培养基为改良马丁培养基，其中蛋白胨5.Og/L、酵 母浸出粉2. Og/L、葡萄糖20.0 g/L、磷酸氢二钾1. Og/L、硫酸镁0.5g/L、其它为无菌水、pH值 6·4±0·2〇
[0010] 该应用菌液的使用方法是按每株100mL将所得应用菌液浇施于台湾相思苗的根 际。
[0011] 本发明所用菌株是从台湾相思植株中分离纯化得到的，其可促进植株对碳、氮、 磷、钾等营养元素的吸收。
[0012] 将该混合内生真菌制备的应用菌液通过浇施的方法接种于台湾相思幼苗，测定接 种60天后的台湾相思中碳、氮、磷、钾等营养元素的含量。结果显示，台湾相思内生真菌DE所 处理的植株与对照植株的碳、氮、磷、钾元素含量差异显著，其地上部分与地下部分碳含量 分别比对照提高了 16.6%和7.6%;地上部分氮含量比对照提高了 33.9%;地上部分与地下部 分磷含量分别比对照提高了 78.3%和13.4%;地上部分与地下部分钾含量分别比对照提高了 49.2%和34.1%，证明该混合内生真菌DE可促进台湾相思对营养元素的吸收。
【附图说明】
[0013] 图1为不同处理对台湾相思幼苗碳含量的影响。
[0014]图2为不同处理对台湾相思幼苗氮含量的影响。
[0015]图3为不同处理对台湾相思幼苗磷含量的影响。
[0016]图4为不同处理对台湾相思幼苗钾含量的影响。
【具体实施方式】
[0017] -种能促进台湾相思营养元素吸收的混合内生真菌，其由台湾相思内生真菌刺盘 孢属（CoDeioiricA? S/7. )D菌株和镰刀菌属（Fusari? S/7. )E菌株组成；所述刺盘孢属 (CoS/7. )D菌株和镜刀菌属(Ft/sai-i? S/7. )E菌株已于2016年1月27日在中国 微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保藏，其中，D菌株的保藏号为CGMCC No. 11907，E菌株的保藏号为CGMCC No. 11909。
[0018] 所述能促进台湾相思营养元素吸收的混合内生真菌可制备成应用菌液，用于台湾 相思苗木的根际土壤浇施与苗木直接接种。
[00?9]所述应用菌液的制备方法是分别将刺盘孢属（CoDe?ο iricA? S/7. )D菌株和镰刀 菌属(/^sari? s/7. )E菌株接入液体培养基，摇床振荡培养，培养温度为28°C，培养时间48~ 72h，利用血球计数板计算菌液浓度，然后将菌液用超纯水稀释成5.5 X 106cfu/mL，再按体 积比1:1将两种菌液混合制得;所述液体培养基为改良马丁培养基，其中蛋白胨5.Og/L、酵 母浸出粉2. Og/L、葡萄糖20.0 g/L、磷酸氢二钾1. Og/L、硫酸镁0.5g/L、其它为无菌水、pH值 6·4±0·2〇
[0020]为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合【具体实施方式】对本发明所述的 技术方案做进一步的说明，但是本发明不仅限于此。
[0021 ]根际土壤浇施与苗木直接接种应用 本试验采用土培盆栽试验，试验所用材料为福建省漳州市市林业局提供的台湾相思一 年生苗。选择长势一致的台湾相思苗木定植于直径15cm、高10cm的塑料盆中。所用土壤是严 格经过熏蒸消毒的黄心土。经过混匀称量，每盆放入3kg 土壤。经过一个月的恢复性生长后， 连续三天于台湾相思根际施入100mL浓度为5.5 X 106cfu/mL的菌液DE，另用蒸馏水溶液浇 施作为空白对照CK。
[0022]菌液制备:将供试菌株分别接入40mL液体培养基，培养基为改良马丁培养基，其中 蛋白胨5.0g/L、酵母浸出粉2.0g/L、葡萄糖20.0g/L、磷酸氢二钾1.0g/L、硫酸镁0.5g/L、其 它为无菌水、pH值6.4±0.2;在恒温振荡培养箱中经过72h的培养，用无菌生理盐水按十倍 稀释法将菌液稀释，利用血球计数板计算菌液浓度，然后将菌液用超纯水稀释成5.5 X 106cfu/mL，再按体积比1:1将两种菌液混合制得。
[0023] 接种60天后进行碳、氮、磷、钾等指标的测定，检测方法如下： 1)植株碳含量:采用重铬酸钾氧化-外加热法测定植株全碳(即有机质)含量，每个样品 做三个重复。
[0024] 计算公式：
式中：为有机碳含量，g/kg;〇.8000为重铬酸钾标准溶液的浓度，mol/L;5.0为重 铬酸钾标准溶液的体积，mL;》|为空白标定用去硫酸亚铁溶液体积，mL;V为测定土样用去 硫酸亚铁溶液体积，mL; 0.003为1/4碳原子的摩尔质量，g/mmol; 1.1为氧化校正系数;mi为 风干土样质量，g;K2为风干土换算到烘干的水分换算系数。
[0025] 2)植株氮含量:采用凯氏定氮法进行测定，每个样品做三个重复。
[0026]计算公式：
式中：WN为氮含量，g/kg; V为测定样品用去盐酸标准溶液体积，mL; Vo为滴定试剂空白 试验用去盐酸标准溶液体积，mL; c为盐酸标准溶液的浓度，mol/L; 0.014为氮原子的摩尔质 量，g/mmol ;m为烘干样品质量，g。
[0027] 3)植株磷含量:采用钼锑抗比色法进行测定，每个样品做三个重复。
[0028]计算公式：
式中:WP为磷含量，g/kg;c为从工作曲线上查得显色液磷(P)的浓度，yg/mL;V为显色液 体积，50mL; m为烘干样品质量，g; ts为分取倍数。
[0029] 4)植株钾含量:采用原子吸收分光光度法测定，每个样品做三个重复。
[0030] 计算公式：
式中:WK为磷含量，g/kg;c为从工作曲线上查得显色液钾(K)的浓度，yg/mL;V为显色液 体积，50mL; m为烘干样品质量，g; ts为分取倍数。
[0031] 注:本试验中提到的地上部分为地面以上的主要是茎和叶；地下部分为地面以下 的主要是根系。
[0032] 试验通过浇施的方法将菌液接种于台湾相思幼苗，接种60天后台湾相思中碳、氮、 磷、钾元素含量结果如下： 图1为不同处理对台湾相思幼苗碳含量的影响。如图1所示，菌株DE处理后的台湾相思 幼苗地上部分碳含量显著高于对照组(sig=〇.011，显著水平为0.05)，地下部分碳含量显著 高于对照组(sig=0.027，显著水平为0.05)。
[0033]图2为不同处理对台湾相思幼苗氮含量的影响。如图2所示，菌株DE处理后的台湾 相思幼苗地上部分氮含量高于对照组，但差异不显著（sig=0.075，显著水平为0.05)，地下 部分氮含量低于对照组。
[0034]图3为不同处理对台湾相思幼苗磷含量的影响。如图3所示，菌株DE处理后的台湾 相思幼苗地上部分磷含量极显著高于对照组(sig=0.002,显著水平为0.01)，地下部分磷含 量高于对照组。
[0035]图4为不同处理对台湾相思幼苗钾含量的影响。如图4所示，菌株DE处理后的台湾 相思幼苗地上部分钾含量显著高于对照组(sig=0.010,显著水平为0.05)，地下部分钾含量 极显著高于对照组(sig=0.005，显著水平为0.01)。
[0036] 综上所述，施浇本发明混合内生真菌应用菌液的台湾相思幼苗中碳、氮、磷、钾等 营养元素明显高于对照组，说明其可促进台湾相思幼苗对碳、氮、磷、钾等营养元素的吸收。
[0037] 以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与 修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
【主权项】
1. 一种能促进台湾相思营养元素吸收的混合内生真菌，其特征在于：该混合内生真菌 由台湾相思内生真菌刺盘孢属（CoDeioiricA? S/7. )D菌株和镰刀菌属(Fusari? S/7. )E 菌株组成;所述刺盘孢属（CoDeioiricA? SjO. )D菌株和镰刀菌属(Fusari? SjO. )E菌株已 于2016年1月27日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保藏，其中，D菌 株的保藏号为CGMCC No. 11907，E菌株的保藏号为CGMCC No. 11909。2. -种如权利要求1所述能促进台湾相思营养元素吸收的混合内生真菌的应用，其特 征在于:将所述混合内生真菌制备成应用菌液，用于台湾相思苗木的根际土壤浇施与苗木 直接接种。3. 根据权利要求2所述能促进台湾相思营养元素吸收的混合内生真菌的应用，其特征 在于:所述应用菌液的制备方法是分别将刺盘孢属（CoDeioiricA? S/7. )D菌株和镰刀菌 属)E菌株接入液体培养基，摇床振荡培养，培养温度为28°C，培养时间48~ 72h，利用血球计数板计算菌液浓度，然后将菌液用超纯水稀释成5.5 X 106cfu/mL，再按体 积比1:1将两种菌液混合制得； 所述液体培养基为改良马丁培养基，其中蛋白胨5.Og/L、酵母浸出粉2.Og/L、葡萄糖 20 · Og/L、磷酸氢二钾1 · Og/L、硫酸镁0 · 5g/L、其它为无菌水、pH值6 · 4 ± 0 · 2。
【文档编号】C12R1/77GK106085872SQ201610452321
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年6月22日
【发明人】林晗, 范海兰, 洪滔, 周艳芬, 吴承祯, 陈灿
【申请人】福建农林大学