一种α?葡萄糖苷酶基因敲除的黑曲霉菌株及其应用

一种α?葡萄糖苷酶基因敲除的黑曲霉菌株及其应用
【专利摘要】本发明提供了一种α?葡萄糖苷酶基因敲除的黑曲霉菌株和α?葡萄糖苷酶基因敲除在提高黑曲霉糖化酶酶活中的应用。本发明还提供了一种提高黑曲霉糖化酶酶活的方法和一种制备α?葡萄糖苷酶基因敲除的黑曲霉菌株的方法。CCTCC No：M201622120160422
【专利说明】
一种α-葡萄糖苷酶基因敲除的黑曲霉菌株及其应用
技术领域
[0001] 本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种α-葡萄糖苷酶基因敲除的黑曲霉菌 株及其应用。
【背景技术】
[0002] 糖化酶是目前最重要的工业酶制剂之一，是淀粉糖化发酵生产酒精主要酶类，全 名为葡萄糖淀粉酶(Glucoamylase)。糖化酶是一种外切型糖苷酶，能从淀粉的非还原性末 端依次水解α_1，4糖苷键，水解成一个个的葡萄糖单元，并像β-淀粉酶一样，使水解下来的 葡萄糖发生构型变化，形成β-D-葡萄糖。对于支链淀粉，它可以缓慢水解a_l，6糖苷键生成 葡萄糖单糖，但水解a_l，6糖苷键的能力(kcat/Km)只有水解a_l，4糖苷键的0.2%。糖化酶 还能微弱水解a-Ι，3连接的碳链，但水解a-Ι，4糖苷键的速度最快，在工业上糖化酶用于将 淀粉转化为葡萄糖，因此被广泛地应用于食品加工业、医疗保健、酿酒、氨基酸生产以及抗 生素和有机酸等发酵工业。
[0003] 黑曲霉(Aspergillus niger)是市面上生产糖化酶的特殊菌株之一。黑曲霉的α-淀粉酶活性低，糖化酶活力强，多数黑曲霉的糖化酶能水解80 %以上的淀粉，与其他菌株相 比较利用黑曲霉生产糖化酶具备产量高，活性好，安全性高的特点。Tamayo-Ramo等研究者 运用黑曲霉产糖化酶的表达体系来表达多铜氧化酶漆酶，Krasevec N等利用黑曲霉丝状真 菌系统表达未正确折叠的分泌蛋白G-CSF，都验证了黑曲霉具有稳定的特异的高表达蛋白 酶系统。本研究选用工业上高效表达糖化酶的黑曲霉HE01作为丝状真菌表达糖化酶的表达 系统。
[0004] 糖化酶的产量活力及酶制剂的高纯度虽然在近年来取得了较大的进展。但遇到了 α_葡萄糖苷转移酶在糖化酶中表现出较高活性的难题。而黑曲霉在生产糖化酶的同时也会 伴随着α_葡萄糖苷酶(α-glucosidase)的产生，α-葡萄糖苷酶的存在会影响糖化酶制剂的 纯度。同样是支链淀粉，α-葡萄糖苷酶水解的主要是α_1，6糖苷键，生成的产物是低聚麦芽 糖和糖肽等，葡萄糖苷酶会和糖化酶竞争底物，弱化糖化酶催化淀粉水解成葡萄糖的能 力。基于传统的去除葡萄糖苷酶的工艺法如沉淀法，离子交换树脂法等不但成效低，还 影响糖化酶的活力。本发明就利用基因工程的生物技术方法敲除黑曲霉中的葡萄糖苷酶 基因，使得葡萄糖苷酶不再抑制糖化酶水解淀粉的效率，从源头上解决α-葡萄糖苷酶对 糖化酶的负影响，以期获得纯度更高的糖化酶。
[0005] 本发明涉及一种α_葡萄糖苷酶基因敲除的黑曲霉菌株，其保藏信息如下：
[0006] 保藏单位名称:中国典型培养物保藏中心
[0007] 保藏单位地址：中国武汉武汉大学
[0008] 保藏日期:2016年4月22日
[0009] 分类命名：Aspergillus niger ΗΕΟΙ-Δα-glu
[0010] 保藏编号：CCTCCN0:M2016221

【发明内容】

[0011] 本发明的一个目的是提供一种α-葡萄糖苷酶基因敲除的黑曲霉菌株，其保藏号为 CCTCC NO:Μ2016221。
[0012] 本发明的另一个目的是提供α-葡萄糖苷酶基因敲除在提高黑曲霉糖化酶酶活中 的应用。
[0013] 本发明的又一个目的是提供一种提高黑曲霉糖化酶酶活力的方法，所述方法包括 敲除黑曲霉中α-葡萄糖苷酶基因的步骤。
[0014] 本发明的再一个目的是提供一种制备α-葡萄糖苷酶基因敲除的黑曲霉菌株的方 法，包括以下步骤：
[0015] ⑴扩增或者合成黑曲霉α-葡萄糖苷酶基因上游和下游各约l〇〇〇bp的a-gluEl、a-gluE2片段，以及选择性标记抗性基因；其中所述抗性基因优选诺尔丝菌素抗性基因(N r);
[0016] (2)构建敲除表达盒a-gluEl-Nqm^-a-gli^两个融合片段；
[0017] (3)制备黑曲霉原生质体；
[0018] (4)将线性化的敲除表达盒共转化黑曲霉原生质体；
[0019] (5)培养和筛选转化后的黑曲霉原生质体获得α-葡萄糖苷酶基因敲除的阳性转化 子。
[0020] 进一步培养上述步骤所获得的阳性转化子获得α-葡萄糖苷酶基因敲除的黑曲霉 菌株。
【附图说明】
[0021] 图1是3株转化子的Ver-Ι和Ver-2片段1%琼脂糖凝胶电泳条带；
[0022] 其中，M:250bp DNA ladder Marker;l，3,5泳道分别是:第1株、第2株、第3株转化 子的Ver-l片段（1185bp); 2，4，6泳道分别是：第1株、第2株、第3株转化子的Ver-2片段 (1231bp)〇
[0023] 图2是突变株的SDS-PAGE分析图；
[0024] 其中，M:Takara High Protein Marker; 1:出发株糖化酶条带；2:突变株糖化酶条 带。
[0025]图3是出发株和突变株在察式液体培养基中的生长曲线；
[0026]其中，圆点表示出发株，正方形表示突变株。
[0027]图4是出发株和突变株在可溶性淀粉液体培养基中的生长曲线；
[0028]其中，正三角表示出发株，倒三角表示突变株。
[0029] 图5是出发株和突变株的糖化酶酶活。
[0030] 图6是出发株和突变株的α-葡萄糖苷酶酶活。
[0031 ]图7是GA基因在出发株和突变株相对表达情况。
【具体实施方式】
[0032]以下通过具体的实施例进一步对本发明进行说明，不能理解为是对本发明的限 制，实施例中使用的材料、试剂，仪器设备如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0033] 菌株和质粒
[0034] 黑曲霉HE01购自湖北立业生物公司。克隆质粒pMD19-T Simple Vector购买于 TaKaRa公司，是具有氨苄青霉素抗性(Amp.R)和TT碱基末端的线性质粒载体。
[0035] 培养基
[0036] (1)察氏培养基:鹿糖3%，硝酸钠0.2%，磷酸氢二钾0.1 %，硫酸镁0.05 %，氯化钾 0.05 %，硫酸亚铁0.001 %，固体加琼脂1.7 %，半液体加琼脂0.05 %。盐离子无机物和有机 物分开灭菌121°(：，0.110^，3〇11^11。配制时用磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液调整?!1值至5.5~ 6.0〇
[0037] (2)可溶性淀粉固体培养基:蛋白胨1%，牛肉膏0.3%，酵母粉0.2%，可溶性淀粉 3 · 0 %，氯化钠0 · 2 %，琼脂 1 · 7 % (液体为0 · 5 % )。用 lmo 1 /L NaOH和HC1 调PH至4 · 9~5 · 0，121 °C，0.1MPa，30min灭菌分装后4°C保存。
[0038] (3)Mandels培养基：用于黑曲霉HE01的液体培养。50XMandels营养盐浓缩液 20mL/L，1000XMandels微量元素浓缩液1.0mL/L，蛋白胨1.0g/L，lM柠檬酸缓冲液（pH 4.5)5〇11^凡，吐温80 1.〇-2.(^凡，无水葡萄糖1(^凡(单独配制，灭菌后混合）。用于黑曲霉 转化子的复筛培养时，可加入125yg/mL诺尔丝菌素硫酸盐抗生素。
[0039] (4)种子培养基：用于里黑曲霉HE01及其阳性转化子的非诱导产酶培养。玉米浆 2%，糊精12%，0?103为0.075%，硫酸铵2%(单独配制，灭菌后混合）。培养条件：32°(：， 100印111，培养7(1~10(1。
[0040] (5)产酶发酵培养基：玉米淀粉26.8%，玉米浆5.36%，豆饼粉3.57%，DF103消泡 剂0.357%，耐高温α-淀粉酶5%，硫酸铵1 %和磷酸二氢钾0.9% (单独配制，灭菌后混合）。 培养条件:32 °C，1 OOrpm，培养7d~10d。
[0041]寡聚核苷酸引物 [0042]表1实施例中使用到的引物
[0043]
[0045] 注:倾斜字体为overlap PCR引物加入的反向互补碱基序列。
[0046]【实施例1】黑曲霉α-葡萄糖苷酶基因 a-gluEl、a-gluE2以及选择性标记基因的扩 增
[0047] 用OMEGA试剂盒提取黑曲霉HE01的基因组DNA，以之为模板，以GLU-1F、GLU-2R为a-葡萄糖苷酶基因（GenBank:D45356.1)上游的一对引物，以GLU-3F、GLU-4R为a-葡萄糖苷酶 基因下游的一对引物，采用TransStart?FastPfu Fly DNA Polymerase PCR体系分别扩增 α-葡萄糖苷酶基因上游约1 OOObp片段a-gluEl(SEQ ID勵.19)和€(-葡萄糖苷酶基因下游 约1 OOObp片段a-gluE2(SEQ ID ^).20)。将?0財导到的目的片段进行1%的琼脂糖凝胶电 泳，片段大小与预期相同，经DNAsist软件比对序列发现与(GenBank D45356.1)中记载的黑 曲霉α-葡萄糖苷酶基因上下游各lkb片段同源性达到100%。
[0048]由生工生物工程(上海)股份有限公司全序列人工合成如SEQ ID N0.21所示的诺 尔丝菌素抗性基因序列（Nourseothricin resistant gene，NR)，再以GLU_MkF、GLU_MkR为 引物，采用PrimeS:TAR響HS premix PCR体系扩增，得到选择性标记抗性基因一诺尔丝菌素 抗性基因 Nours.Resistant(NR)。将PCR得到的目的片段进行1 %的琼脂糖凝胶电泳，片段大 小与预期相同。
[0049] 本实施例共有三个目标片段，其中α-gluEl和a-gluE2片段由TransSlariiiFastPfu Fly DNA Polymerase扩增，Nours.Resistant片段由PrimeSTA.R?HS premix扩增，所得片 段末端不具有凸出的碱基"A"，不能直接进行ΤΑ克隆。因此需用LA酶在目的片段两端加 "A" 尾巴。加 A体系如下：
[0050]
[0051]
[0052]将反应体系放入PCR仪中，72 °C延伸15min，无需经变性、退火。经加"A"反应获得的 目的片段需进行纯化，去除LA Taq酶等，提高连接效率。然后取1~2yL进行琼脂糖凝胶电泳 定量检测。
[0053]目的片段分别与pMD 19-T_Vector(simple)连接体系如下：
[0054]
[0055]取无菌的200yL体积的PCR管，按上述连接体系加入混匀后置于16°C恒温水浴锅 中，根据片段的大小确定反应的时间（一般1~24h不等hAT连接产物直接用于转化实验或 存放于-20°C长期保存，无需再纯化。
[0056]【实施例2】敲除表达盒的构建
[0057] 本实施例需要构建的表达盒为α-gluEl-NR(SEQIDN0.22)和N R-α-gluE2(SEQID 腸.23)，上述？0?扩增到三个基因片段€(11仙1、€[11仙2、#后再分别纯化回收，通过 Overlap PCR分别得到a-gluEl-N^M-a-gli^两个融合片段，作为基因敲除的线性表达 盒，具体步骤如下：
[0058] 以a-gluE0PNR两个片段为模板，GLU_lF、GLU_MkR为上下游引物，扩增a-gluEl_N R 融合片段;〇11仙2和妒两个片段为模板，GLU_MkF、GLU-4R为上下游引物，采用G〇Taq?DNA Polymerase PCR体系，扩增NR-a-gluE2融合片段。
[0059] Overlap PCR体系：
[0060]
[0061]
[0062] 将上述PCR得到的两个融合片段a-glUEl-NqPNR-a-gl UE2进行切胶回收，并送至英 潍捷基公司测序。取1~2yL回收的DNA样品进行1 %琼脂糖凝胶电泳定量。将纯化后的a-gluEl-NqPNR-a-gluE〗融合片段分别连接至pMD19-T-Vector( simple )，然后转化大肠杆菌， 筛选重组子，对分别含有a-gluEl-Nqm^-a-gluE〗的大肠杆菌阳性转化子进行保种，以便于 后期实验需要a-gluEl-NqPN R-a-gluE2时可直接从大肠杆菌质粒中扩增得到。
[0063]【实施例3】黑曲霉ΗΕ01的原生质体转化和重组黑曲霉ΗΕ01的鉴定 [0064] 1、线性表达盒共转入黑曲霉HE01
[0065] 从大肠杆菌中提取a-gluEl-NqPNR-a-gluES两融合片段分别与pMD19-T_Vector (simple)连接上的环形克隆载体，经过PCR扩增得到大量的a-gluEl-NqnW-a-gluES片段， 线性化的表达盒有利于提高原生质体转化率。原生质体转化黑曲霉HE01再生后，将过夜生 长的原生质体菌液均勾涂布在5~6个浓度为125yg/mL的诺尔丝菌素硫酸盐的察式固体大 平板上（8.5cm)，32°C培养。线性表达盒通过与菌株基因组在细胞核内发生同源重组，使得 阳性菌株能够表现出对诺尔丝菌素硫酸盐的抗性，而阴性无抗性，因此在含有诺尔丝菌素 硫酸盐的平板上无法生长。
[0066]采用原生质体转化技术转化黑曲霉HE01时，先检测突变株分别在含50、75、100、 125yg/mL诺尔丝菌素硫酸盐平板上的菌丝生长情况，选择合适的浓度进行原生质体转化子 的平板筛选。3d后观察平板上菌落的生长情况，实验组平板上有大量凸起的白色菌丝球，阴 性对照组平板上无菌丝生长。当有白色菌丝长出时，需及时挖取菌丝球的1/4菌丝及其下方 的琼脂块一同转接至新的含相同浓度125yg/mL的诺尔丝菌素硫酸盐的察式固体小平板上， 32 °C培养3d-5d，初步筛选出有转入诺尔丝菌素硫酸盐抗性基因的转化子。将重新长出菌 丝的转化子接种至新鲜无抗性的察式液体培养基中，连续培养7-10d，至长满白色菌丝块为 止，用65%的甘油对转化子进行保种。经诺尔丝菌素硫酸盐平板复筛后共得到15株黑曲霉 突变株HE01 (△ ailu)的转化子，随机挑取3株转化子进行基因水平和蛋白水平的验证。
[0067]其中，原生质体制备操作如下：
[0068] (1)菌丝培养:将察式培养基平板(8.5cm)上长好的菌丝体(单菌落)接种至察式的 液体培养中，34°C恒温培养3-6d，至长新鲜的白色菌丝体。若菌丝生长状态不好，可再次进 行转接。
[0069] (2)收集菌丝：用灭好菌干燥后的4层纱布过滤菌液，收集菌丝体。1M山梨醇溶液洗 涤菌丝体一次，10mL 1M MgS〇4溶液洗涤两次，称取湿重[77-78]。
[0070] (3)菌丝酶解:按质量体积比1:10加入裂解酶液。称取约lOOOmg菌丝体置于锥形瓶 中，加入10mL的1M MgS〇4溶液后再加入100mg sigma纤维素酶于锥形瓶中裂解细胞壁，溶壁 酶易失活，配制时应远离酒精灯，配制好酶解液后32°C，80rpm/min，酶解3~3.5h，1.5h时开 始镜检，每〇. 5h镜检一次。
[0071] (4)细胞计数:血球计数板比普通载玻片厚，玻片中四条下凹的槽构成三个平台。 中间的平台较宽，其中间又被一短横槽隔为两半，每半边上面，刻有一个方格网。方格网上 刻有9个大方格，其中只有中间的一个大方格为计数室(每一个大方格由25 X 16 = 400个小 方格组成），供微生物计数用。用细胞计数板镜检原生质体时，采用血小板计数法。确定原生 质体浓度为1. 〇 X 1〇8个/mL(每个大方格里约有80个原生质体球）。
[0072] (5)原生质体过滤：将酶解好的菌丝溶液转移置灭好菌且干燥后的8层纱布中过 滤，取滤液于15°C，3 200rpm下离心20min后弃去上清液。
[0073] (6)清洗沉淀：分别用预冷的0.6M KC1和1 XSTC溶液洗涤沉淀两次，15°C，3 200rpm/min，离心 10min，弃废液。
[0074] (7)重悬：用适量配制好的1 XSTC溶液重悬沉淀，轻轻混匀，置冰浴备用。
[0075]制备好黑曲霉ΗΕ01的原生质体后可用1.5mL离心管分装放置4 °C冰箱冰浴一个星 期，或立即用于转化实验。
[0076] 转化步骤如下：
[0077] (1)取上述200yL(l~2X108个/mL)的原生质体悬浊液，48°C孵育5min后立即转移 至冰上或于4 °C冰箱冰浴30s，再室温放置5min。
[0078] (2)将原生质体与5yg DNAh-gluEl-NqPNR-a-gluES片段)混合，室温放置 15min。
[0079] (3)将溶液转移至50mL离心管中，加入2mL 60%PEG4000,轻轻混匀，室温静置 15min〇
[0080] (4)3 200rpm，离心 10min，小心弃上清液，去除Buffer。
[0081] (5)用5mL 1 XSTC重悬原生质体沉淀，轻轻混匀。27°C恒温放置一夜。
[0082] (6)将过夜培养的5mL原生质体与25mL 1 XSTC和察式再生培养基混匀后，倒入5~ 6个含诺尔丝菌素硫酸盐的抗性平板(平板上的诺尔丝菌素硫酸盐终浓度为125yg/mL)，或 者3 200rpm离心15min，去上清，再加入再生培养基重悬，取100~200yL涂布平板。
[0083] (7)32°C恒温培养观察3~5d，可做一个阴性对照(转入无菌水）。
[0084] (8)待平板上长出白色菌丝或菌丝球时(平板底部变黄），用枪头挑取单菌落菌丝， 接种至含终浓度为125yg/mL诺尔丝菌素硫酸盐的新鲜察式培养基小平板(6cm)上，32°C培 养3~5d。进行初步筛选。
[0085] (9)及时将抗性平板上长出的菌丝接种于察式液体培养基，32°C，lOOrpm恒温摇床 振荡培养7-10d。用65%的甘油对转化子进行保种后置-80°C冰箱保存。
[0086] 2、重组黑曲霉HE01的基因水平鉴定
[0087] 随机选取了3株Aspergillus niger HE01转化子进行察式液体培养，用转化子的 基因组为模板进行PCR验证。以出发菌株的基因组DNA作为阴性对照，以为上述表1中相应的 引物成功扩增得到α-gluEl片段的上下游之间约1 OOObp的验证序列Ver-Ι和a-gluE2片段 的上下游之间约l〇〇〇bp的验证序列Ver-2,且测序结果与预期相符，说明目的基因已成功整 合到黑曲霉ΗΕ01的基因组DNA中，结果如图1所示。
[0088]挑取2株经PCR鉴定中有诺尔丝菌素硫酸盐抗性基因 NR的阳性转化子黑曲霉突变 菌株进行产酶发酵，取各突变菌株第5d的粗酶液进行SDS-PAGE分析，如图2所示。黑曲霉出 发菌株（1泳道)在约120KD处有一蛋白，而突变黑曲霉(2泳道)在120KD处，蛋白条带更深于 出发菌株。糖化酶蛋白的分子量大于理论值100KD，推测其在转录后翻译时发生了糖基化修 饰。
[0089]【实施例4】突变黑曲霉的表型分析
[0090]利用察式固体培养基和可溶性淀粉固体培养基分别培养出发菌株(ST)和突变株 (MT)，检测两种菌株在同样培养条件下的生长情况。在超净工作台内，用接种环分别从传代 次数一样的出发菌株和突变株察式液体培养基里挑取体积大小一致的单个菌丝球，分别接 种到察式培养基和可溶液淀粉培养基的中心位置，每个平板需做3个平行样。并做好标记。 将含有菌株的各个平板放置于32°C恒温培养箱中静置培养3~7天。观察每天菌株的生长情 况，待菌株长到第5天时，将各个平板置于凝胶成像仪系统载物台进行拍照。记录各个菌株 的生长速度和生长形态特征。
[0091]通过生物量的测定制作出发菌株和突变菌株的生长曲线。菌株的预培养:取传代 次数一样的出发菌株和突变株液体培养基，以相同的接种量（lmL)分别接种到新的50mL察 式液体(Sac)和可溶性淀粉液体培养基(Sol )，每个样需做3个平行样。32°C，lOOrpm，恒温摇 床培养，每48h称一次菌丝干重，分别称取第3d、第5d、第7d的干重，每次称取三个平行样，得 到出发株和突变株的生物量平均值。出发株和突变株在察式和可溶性淀粉液体培养基中的 生长曲线如图3、4所示。出发株的生物量在培养相同的时间内，比突变株增长快速且总体生 物量大于突变株，且出发株在培养过程中比突变株更容易结成菌丝球。
[0092]【实施例5】黑曲霉的酶活测定
[0093]测定酶活前分别用标准葡萄糖溶液和pNPG溶液做好糖化酶和α-葡萄糖苷酶活测 定的标准曲线，然后将成功敲除的突变黑曲霉接种到30mL察式培养基中，静置培养3~5d， 按5 %接种量接种至种子培养基中，32°C，200rpm非诱导培养5~8d。每24h取样一次，测定粗 酶液的糖化酶酶活和葡萄糖苷酶酶活，筛选出酶活最高的黑曲霉株，与出发菌株酶活进 行对比分析。测得黑曲霉ΗΕ01突变株的糖化酶酶活最高达到7 437.73U/mL，出发株为6 143.42U/mL(如图5所示）。而出发株的α-葡萄糖苷酶酶活为2 045.26U/mL，但突变株的复合 酶活最高只有24.17U/mL，几乎检测不到α-葡萄糖苷酶酶活(如图6所示）。
[0094]测定α-葡萄糖苷酶酶活的具体操作如下：
[0095] (1 )α-葡萄糖苷酶酶活测定的标准曲线制作。用0.1Μ的醋酸-醋酸钠(ρΗ5.5)缓冲 液配制200μΜ ΡΝΡ溶液，然后分别稀释成60，50，40，30，20，10，ΟμΜ。分别取种不同浓度的ΡΝΡ 溶液各lmL，加入1Μ Na2C03溶液lmL，混匀后显色5~1 Omin。在400nm下测定吸光度值，绘制标 准曲线。以PNP浓度为横坐标，以样品0D值为纵坐标，绘制XY散点图，获得葡萄糖标准曲线y =ax+b。ΡΝΡ浓度标准曲线需要测定五个点以上的值，所得方差R2多0.99。
[0096] (2)取900yL 0· 1Μ的醋酸-醋酸钠缓冲液和50yL底物pNPG(lOmM)于50°C保温10- 15min后，加入50yL经适度稀释后的待测定酶液，50°C精确计时反应15min后立即加入lmL预 冷的1M Na2C03中止反应，室温放置lOmin后显色，405nm处测定其吸光度值。
[0097] (3)另取900yL醋酸钠缓冲液（0.1mol/L，pH 5.5)和50yL底物pNPG(10mmol/L)于50 °C保温10_15min后，加入50yL去离子水(或加热失活的酶液），50°C精确计时反应15min后立 即加入lmL预冷的Na2C03溶液（lmol/L)中止反应并显色，405nm处测定其吸光度值，此吸光值 作为空白对照。
[0098] (4)酶活单位定义:上述条件下，每小时催化产生Ιμπιο? pNP的酶量为一个标准酶 活力单位。
[0099] (5)酶活计算通用公式：
[0100] Ui = CXtXNXVt/Vs
[0101] C:反应后的pNP含量 [0102] t:反应时间
[0103] N:稀释倍数 [0104] Vt:反应总体系，ml
[0105] Vs:酶液体积，ml
[0106] (6)按照公式计算出每天的酶活值，并绘制酶活差异的柱形图。
[0107] 测定糖化酶酶活的具体操作如下：
[0108] 本黑曲霉糖化酶酶活测定采用DNS法，DNS与还原糖能发生显色反应，加热后，溶液 呈现红棕色，颜色越深则表示酶活越高。根据540nm波长下DNS与还原糖显色反应的吸光度 值确定还原糖的量与光吸收值关系。然后根据含糖量计算出糖化酶活力。
[0109] (1)葡萄糖标准溶液的配制。准确称取80°C烘干恒重的无水葡萄糖100mg，溶于去 离子水并定容至l〇〇mL，该溶液即为葡萄糖标准溶液(见表2)。
[0110]表2葡萄糖浓度标准曲线的测定方法 [0111]
[0112] (2)0D值测定:取10mL比色管若干，标号后按表2加入试剂，各浓度葡萄糖各设3管 平行样，以求平均0D值。加好后将各管置于沸水浴lOmin，取出冷却后以去离子水定容至 10mL，以0号管调零，波长540nm处测定0D值。
[0113] (3)标准曲线绘制:将上述各管平均0D值和葡萄糖试剂含量输入表格，以葡萄糖含 量为横坐标，0D值为纵坐标绘制XY散点图并添加趋势线，即可获得线性回归方程，要求标准 差 R2 彡 0.99。
[0114] (4)制备待测酶液:在超净工作台内取lmL发酵液，离心后取上清液，根据发酵浓度 将酶液稀释至一定的倍数。
[0115] (5)酶活测定:取4支10mL比色管。标上编号A，B，C，D，每只管加上20g/L的可溶性淀 粉溶液5mL及缓冲液lmL，摇匀后于40 ± 0.2 °C恒温水浴中预热5min。在A，B，C (样品管）中加 入待测稀释酶液〇. 4mL，立刻摇匀，在此温度下准确反应30min，立即各加200g/L NaOH溶液 0.04mL，将各管取出迅速冷却，并于D管(空白对照）中补加去离子水或无菌的发酵培养上清 液0·4mL。
[0116] (6)显色:从反应后的样品管及对照管中分别取lmL的反应液置于另外干净的10mL 比色管中，向各管中加入2mL DNS显色剂，混匀后沸水浴10min显色，冷却后补加去了离子水 至1 OmL，以空白对照组调零，在波长为540nm处比色测定吸光度(0D)值。
[0117] (7)计算酶活力:求测得的各平行样0D值的均值，根据公式计算出发酵液中糖化酶 的酶活力(Uo)。
[0118] Uo = AXKX2X6.44X10XN/0.4
[0119] Α:样品 0D 值
[0120] K:比色常数
[0121] Ν:为稀释倍数
[0122] 6.44:反应总体积，mL
[0123] 0.4:待测酶液体积，mL
[0124] 2:将30min的反应时间换算成一个小时
[0125] 10: lmL稀释液的总酶活
[0126] (8)按照公式计算出每天的酶活值，并绘制酶活差异的柱形图。
[0127] 【实施例6】突变黑曲霉HE01总RNA的反转录实时荧光定量PCR
[0128] 首先提取出发株和突变株的总RNA，取相同培养条件下第7天的黑曲霉HE01出发株 和突变株各三株，真空抽滤后取干燥菌丝备用，分别采用Trizol法提取黑曲霉RNA，试剂盒 购买于北京全式金公司。然后进行反转录PCR，采用一步法合成第一链cDNA和去除gDNA。所 用试剂盒购买于全式金公司。将提取的RNA按照下列反转录PCR的体系进行：
[0129]
[0130] 将各组分轻轻混匀后，于PCR仪器中25°C孵育lOmin后再于42°C孵育反转录15min， 产物用于qPCR。反应完毕后于85°C加热5s失活TVims'Scr/^KT/RI Enzyme Mix和gDNA Remover。将产物用于下一步实验或于_20°C长期保存。然后进行荧光定量PCR(qPCR)，采用 SYBR Green I荧光染料和相对双标准曲线法对目的基因 GA(糖化酶基因）的表达进行实时 定量，具体步骤如下：
[0131 ] (1)以反转录好的出发株的cDNA链为模板，利用普通PCR技术分别扩增出内参基 因6六?0!1、|3-&(^11、188巧财和糖化酶基因64-31'各约20(^的目的条带。检测引物的特异 性，以没有出现引物二聚体的条带视为标准条带，可进行下一步实验。
[0132] (2)双标准曲线的制作：以PCR产物为模板，β-actin和18s rRNA的PCR产物以稀释 1〇5为第一个浓度梯度，以10为基数往后稀释4个浓度梯度。GATOH和GA-ST的PCR产物以稀释 1〇 4为第一个浓度梯度，以10为基数往后稀释4个浓度梯度。以稀释后的各浓度为模板，每个 模板做3个平行样，按照下列反应体系进行qPCR扩增。qPCR试剂盒购买于Promega公司。
[0133] qPCR反应体系如下：
[0134]
[0135] (3)本实验采用两步法快速PCR扩增程序。在加好各反应组分于96孔板后，按照以 下条件进行qPCR扩增，要求qPCR后得到的各个样品浓度的Ct值范围在15~35之间。
[0136] qPCR反应参数设置：
[0137] 第一步:95° 预变性 2min;
[0138] 第二步：热循环。95°反应3s，60°反应30s;
[0139] 第三步:熔解曲线。95°反应158,60°反应11^11，95°反应158。
[0140] (4)根据设置的qPCR反应参数精确反应63min后，根据样品稀释的5个浓度梯度的3 个平行样的(^值分别绘制6六?0!1、|3-&(^11、188冰嫩和64-31'基因表达量的双标准曲线 7 = kx+b。要求R2>0 · 98，扩增效率大于90 %，小于110 %。
[0141] (5)样品qPCR:以反转录得到的各个cDNA样品稀释10倍后为模板，以与上相同的 qPCR条件进行反应。得到所有样品的Ct值。
[0142] (6)基因表达差异计算公式及数据处理。本实验运用Vandesompele Method相对 定量方法分析基因的表达差异，结果用相对表达量值表示，通过目的基因的表达量与内参 基因表达量的比值得到糖化酶的相对表达量值。
[0143] 计算公式为：
[0144]
[0145] Ratio:比例，目的基因相对表达量值
[0146] E:扩增效率
[0147] Δ Ct:对照组与实验组的Ct差值
[0148] Ref η:内参基因个数
[0149] (7)将Ct值输入到WPS Excel 2016中，按照公式计算出目的基因相对表达量，并绘 制基因表达差异的柱形图。
[0150] 对糖化酶基因在出发株和突变株的基因表达水平进行检测，突变株糖化酶的相对 表达量如图7所示，显示黑曲霉ΗΕ01突变株的GA基因相对出发株的表达量上调，说明α-葡萄 糖苷酶基因敲除后，糖化酶基因在转录水平上有所增长。与上述酶活实验达成正相关性，由 此说明，α-葡萄糖苷酶的敲除有利于糖化酶表达量的增加。
【主权项】
1. 一种α-葡萄糖苷酶基因敲除的黑曲霉菌株，其保藏号为CCTCC N0:M2016221。2. α_葡萄糖苷酶基因敲除在提高黑曲霉糖化酶酶活中的应用。3. -种提高黑曲霉糖化酶酶活的方法，其特征在于，所述方法包括敲除黑曲霉中α-葡 萄糖苷酶基因的步骤。4. 一种制备α-葡萄糖苷酶基因敲除的黑曲霉菌株的方法，包括以下步骤： (1) 分别扩增黑曲霉葡萄糖苷酶基因上游的α-gluEl和下游的a-gluE2片段，以及选 择性标记抗性基因 NR; (2) 构建敲除表达盒a-gluEl-N^PW-a-gluE〗两个融合片段； (3) 制备黑曲霉原生质体； (4) 将线性化的敲除表达盒共转化黑曲霉原生质体； (5) 培养和筛选转化后的黑曲霉原生质体获得α-葡萄糖苷酶基因敲除的黑曲霉菌株。
【文档编号】C12N9/34GK106085887SQ201610436727
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年6月17日
【发明人】余少文, 杨丽娟, 胡萍, 谢宁, 汤新
【申请人】深圳大学