一株微生物采油菌w?y1及其应用
【专利摘要】本发明公开了一株微生物采油菌W?Y1及其应用。本发明的微生物采油菌W?Y1已于2016年5月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.12492。通过实验证明：本发明的微生物采油菌W?Y1不仅具有降解石油的功能，可用于石油污染的治理和修复，而且还可以用于微生物采油，提高采油率，具有很好的应用前景。CGMCC No.1249220160523
【专利说明】
一株微生物采油菌W-Y1及其应用
技术领域
[0001 ]本发明属于生物技术领域，具体涉及一株微生物采油菌W-Y1及其应用。
【背景技术】
[0002] 石油污染分布广泛，涉及采油、炼油、化工、机械等各种工业以及石油泄漏等各种 污染环境。石油烃组分复杂多样，疏水性强而难以被普通微生物所接触、所降解、所利用。
[0003] 微生物采油技术就是通过向地层中注入营养或微生物，利用油藏中微生物的生长 代谢活动，提高原油产量和采收率。传统的石油功能菌株多分离于水体和土壤中。现有的研 究表明，微生物除分别在水体和土壤外，在石油油相中也有广泛的分布，因此从石油油相中 分离相关的功能菌株对石油烃污染治理修复和微生物采油技术具有重要意义。
【发明内容】
[0004] 本发明的一个目的是提供一株根瘤菌Rhizobium sp.W-Yl。
[0005] 本发明提供的根瘤菌Rhizobium sp.W-Yl的保藏编号为CGMCC No. 12492。
[0006] 本发明的另一个目的是提供上述根瘤菌Rhizobium sp.W-Yl或其菌悬液或其培养 液或其发酵产物或含有其的菌剂的新用途。
[0007] 本发明提供了上述根瘤菌Rhizobium sp.W-Yl或其菌悬液或其培养液或其发酵产 物或含有其的菌剂在石油降解中的应用。
[0008] 本发明还提供了上述根瘤菌Rhizobium sp.W-Yl或其菌悬液或其培养液或其发酵 产物或含有其的菌剂在制备石油降解的产品中的应用。
[0009] 本发明还提供了上述根瘤菌Rhizobium sp.W-Yl或其菌悬液或其培养液或其发酵 产物或含有其的菌剂在石油污染治理和/或修复中的应用。
[0010]本发明还提供了上述根瘤菌Rhizobium sp.W-Yl或其菌悬液或其培养液或其发酵 产物或含有其的菌剂在制备石油污染治理和/或修复的产品中的应用。
[0011]本发明还提供了上述根瘤菌Rhizobium sp.W-Yl或其菌悬液或其培养液或其发酵 产物或含有其的菌剂在微生物采油中的应用。
[0012] 本发明还提供了上述根瘤菌Rhizobium sp.W-Yl或其菌悬液或其培养液或其发酵 产物或含有其的菌剂在制备微生物采油的产品中的应用。
[0013] 本发明还有一个目的是提供一种产品。
[0014] 本发明提供的产品的活性成分为上述根瘤菌Rhizobium sp.W-Yl或其菌悬液或其 培养液或其发酵产物或含有其的菌剂；
[0015] 所述产品具有如下1)-3)中任一种功能：
[0016] 1)石油降解；
[0017] 2)石油污染治理和/或修复；
[0018] 3)微生物采油。
[0019] 本发明还有一个目的是提供一种石油污染治理和/或修复的方法。
[0020]本发明提供的石油污染治理和/或修复的方法包括如下步骤：用上述根瘤菌 Rhizobium sp.W-Yl或其菌悬液处理石油污染物。
[0021 ]本发明的最后一个目的是提供一种微生物采油的方法。
[0022]本发明提供的微生物采油的方法包括如下步骤:在采油的过程中，加入上述根瘤 菌Rhizobium sp.W-Yl或其菌悬液。
[0023]本发明提供了一种微生物采油菌W-Y1，该菌株已于2016年5月23日保藏于中国微 生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No. 12492。通过实验证明：本发 明的微生物采油菌W-Y1不仅具有降解石油的功能，可用于石油污染的治理和修复，而且还 可以用于微生物采油，提高采油率，具有良好的应用前景。
【附图说明】
[0024] 图1为基于W-Y1菌株16S rDNA的系统发育树。
[0025]图2为降解石油前后全烃组分变化。
[0026]图3为物模驱油结果曲线。
[0027] 保藏说明
[0028] 菌种名称:根瘤菌
[0029] 拉丁名：Rhizobium sp ·
[0030] 菌株编号:W-Yl
[0031] 保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 [0032] 保藏机构简称:CGMCC
[0033]地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号
[0034] 保藏日期：2016年5月23日
[0035] 保藏中心登记入册编号：CGMCC No .12492
【具体实施方式】
[0036] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0037] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0038] 下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
[0039] 实施例1、W_Y1菌株的分离与鉴定
[0040] 1、W_Y1菌株的分离
[00411 取lg原油（2015年3月取自克拉玛依新疆油田油井原油）加入到121°C灭菌30min的 液体无机盐培养基（5g/L NaCl、lg/L NH4H2P04、lg/L(NH4)2S04、lg/L K2HP04、3g/L ΚΝ03，ρΗ 7-8)中，37 °C、150rpm振荡培养30d后，稀释涂布在LB培养基（lOg/L NaCl、lOg/L蛋白胨、5g/ L酵母粉，pH 7-8)平板上，培养7d后，挑取单菌落划线纯化后保存，并将分离纯化获得的分 离物命名为W-Y1菌株。
[0042] 2、W_Y1菌株的分子鉴定
[0043]将W-Y1菌株接种于液体LB培养基（10g/L NaCl、10g/L蛋白胨、5g/L酵母粉，pH 7-8)中，30°C、150rpm振荡培养24h。取lml新鲜培养菌液4°C、8000rpm离心5min，收集菌体于 2ml离心管中，采用DNA提取试剂盒提取DNA。电泳检测后，采用通用引物8F/1492R进行PCR扩 增，得到含有W-Y1菌株16S rDNA保守区的PCR产物。引物序列如下：
[0044] 8F:5'-AGA GTTTGATCC TGGCTCAG-3'；
[0045] 1492R:5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'。
[0046] 电泳检测PCR产物并测序，测序结果表明：W-Y1菌株16S rDNA的核苷酸序列如序列 1所示。基于W-Y1菌株16S rDNA序列，使用软件MEGA构建系统发育树如图1所示。将序列1提 交GenBank，根据BLAST搜索和同源性分析比较的结果表明，W-Y1菌株16S rDNA序列与已知 菌种1^12〇13；[111]1161]11^6的最高相似性仅为95.73%，表明该菌是一种新发现的新菌。
[0047]综合上述鉴定结果，W-Y1菌株名称为根瘤菌，其分类命名为Rhizobium sp.，该菌 株已于2016年5月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称 CGMCC，地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保 藏号为CGMCC No .12492。
[0048] 实施例2、W_Y1菌株在石油污染治理修复中的应用
[0049] 1、W_Y1菌液的获得
[0050] 将W-Y1菌株接种于液体LB培养基（10g/L氯化钠、10g/L蛋白胨、5g/L酵母粉，pH 7-8)中，30 °C、150rpm振荡培养24h，得到W-Y1菌液(W-Y1菌液浓度为108-109CFU/ml)。
[00511 2、W_Y1菌液降解石油
[0052]将步骤1得到的W-Y1菌液按照体积分数为5%的比例接种于石油无机盐培养基 (lg/L石油、5g/L NaCl、lg/L NH4H2P〇4、lg/L(NH4)2S〇4、lg/L K2HP〇4、3g/L ΚΝ03，ρΗ 7-8)中 (W-Yl菌液的浓度为106-107CFU/ml)，30°C、150rpm振荡培养7d，得到W-Yl降解产物。
[0053] 3、按文献"原油降解菌的分离及其降解性能"中的方法测定W-Yl降解产物中的石 油残余量，并计算石油降解率。石油降解率的公式：（石油加入量-石油参与量)/石油加入 量。计算结果表明：石油的降解率为58.6 %。
[0054] 4、按行业标准SY/T5779-2008石油和沉积有机质烃类气相色谱分析方法测定W-Y1 菌液降解前后的全烃组分变化。
[0055] 结果如图2所示，其中，黑色图谱为降解前石油烃组分，红色图谱为降解后石油烃 组分。从图2可以看出，经过W-Y1作用后，石油烃组分显著降低，说明W-Y1菌株具有降解石油 的功能，可用于石油污染的治理和修复。
[0056] 实施例3、W_Y1菌株在微生物采油技术中的应用
[0057]通过室内物模驱油实验评价微生物菌种的采油效果，具体实验方法如下：
[0058] 1、按照油藏区块渗透率(600μπι2)，采用高压模型管（规格025x500mm，购至海安 石油科研仪器有限公司）内填装不同目数的石英砂制作为填砂模型管；
[0059] 2、采用渗透率测量装置测量模型管渗透率，选择符合的模型管，模型管填砂参数 如表1所示；
[0060] 表1、模型管填砂参数
[0061]
[0062] 3、抽真空饱和地层水，计算孔隙度；
[0063] 4、油驱水建立束缚水，测量原始含油饱和度;并在油藏温度(37 °C)下老化3天；
[0064] 5、用注入水进行驱油，至出口产出液达到极限含水率(98%)停止水驱，计算水驱 米收率；
[0065] 6、将W-Y1菌株接种于液体LB培养基（1 Og/L氯化钠、10g/L蛋白胨、5g/L酵母粉，pH 7-8)中，30°C、150rpm振荡培养24h，得到W-Y1菌液(W-Y1菌液的浓度为108-109CFU/ml)。在注 入水中加入NH4H 2P〇4、(NH4) 2S〇4、K2HP〇4、kn〇3、蛋白胨、酵母粉和W-Y1菌液，混匀，得到含W-Y1 的混合液，使各组分在含W-Y1的混合液中的浓度分别为1 g/L NH4H2P〇4、1 g/L(NH4) 2S〇4、1 g/L K2HP〇4、3g/L KN〇3、2g/L蛋白胨、1 g/L酵母粉、5 % (体积分数)W-Yl菌液。W-Yl的混合液中W-Y1 的浓度为 l〇6_l〇7CFU/ml。
[0066] 7、按0.5PV注入量将上述含W-Y1的混合液注入模型管中；在油藏温度（37°C )下培 养15天；
[0067] 8、二次水驱，水驱至含水98%以上，分别计算注微生物(含W-Y1的混合液)过程中、 微生物(含W-Y1的混合液)作用后续水驱的采收率和W-Y1菌株提高采收率。
[0068] 水驱、注微生物过程中、微生物作用后续水驱等不同阶段的采收率的结果如表2所 示。对水驱、注微生物过程中、微生物作用后续水驱等不同阶段的采收率进行了对比发现： 使用W-Y1菌株进行采油，采收率提高了 6.05%。物模驱油结果曲线如图3所示。
[0069] 表2、水驱、注微生物过程中、微生物作用后续水驱等不同阶段的采收率
[0070]
【主权项】
1. 一株根瘤菌Rhizobium sp.W-Yl，其保藏编号为CGMCC No.12492。2. 权利要求1所述的根瘤菌Rhizobium sp.W-Yl或其菌悬液或其培养液或其发酵产物 或含有其的菌剂在石油降解中的应用。3. 权利要求1所述的根瘤菌Rhizobium sp.W-Yl或其菌悬液或其培养液或其发酵产物 或含有其的菌剂在制备石油降解的产品中的应用。4. 权利要求1所述的根瘤菌Rhizobium sp.W-Yl或其菌悬液或其培养液或其发酵产物 或含有其的菌剂在石油污染治理和/或修复中的应用。5. 权利要求1所述的根瘤菌Rhizobium sp.W-Yl或其菌悬液或其培养液或其发酵产物 或含有其的菌剂在制备石油污染治理和/或修复的产品中的应用。6. 权利要求1所述的根瘤菌Rhizobium sp.W-Yl或其菌悬液或其培养液或其发酵产物 或含有其的菌剂在微生物采油中的应用。7. 权利要求1所述的根瘤菌Rhizobium sp.W-Yl或其菌悬液或其培养液或其发酵产物 或含有其的菌剂在制备微生物采油的产品中的应用。8. -种产品，其活性成分为权利要求1所述的根瘤菌Rhizobium sp.W-Yl或其菌悬液或 其培养液或其发酵产物或含有其的菌剂； 所述产品具有如下1)_3)中任一种功能： 1) 石油降解； 2) 石油污染治理和/或修复； 3) 微生物采油。9. 一种石油污染治理和/或修复的方法，包括如下步骤：用权利要求1所述的根瘤菌 Rhizobium sp.W-Yl或其菌悬液处理石油污染物。10. -种微生物采油的方法，包括如下步骤:在采油的过程中，加入权利要求1所述的根 瘤菌Rhizobium sp.W-Yl或其菌悬液。
【文档编号】C02F101/32GK106085902SQ201610403981
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年6月8日
【发明人】池昌桥, 吴晓笃, 刘泽汉
【申请人】北京润世科技有限公司