一株从西藏灵菇中分离得到的干酪乳杆菌及其应用
【专利摘要】本发明提供一株从西藏灵菇中分离得到的干酪乳杆菌Lactobacillus casei LC577，其特征在于：其保藏编号为:CGMCC NO.12151。本发明还提供其应用。本发明的干酪乳杆菌在作为益生菌调节人体肠道菌群平衡、增强免疫功能、预防疾病等方面有着广阔的应用潜力。能够应用于制作干酪和发酵酸奶、褐色乳饮料中。CGMCC NO.1215120160219
【专利说明】
一株从西藏灵菇中分离得到的干酪乳杆菌及其应用
技术领域
[0001] 本发明涉及一株从西藏灵菇中分离得到的干酪乳杆菌。
【背景技术】
[0002] "西藏灵菇"又名"西藏雪莲"，是源自西藏雪原的特有珍稀菌种，是西藏土生土长 的有生命的菌类。西藏灵菇是由数种乳酸菌与酵母菌等微生物之间的共生作用而形成的具 有特殊粒状或片状结构的物质，是一种乳白色、胶质状的块状物，外形酷似米粒，上面栖息 着多种微生物，在牛奶中培养，个体会增大，形状如盛开的雪莲，所以又称之为西藏雪莲。将 "灵燕"做成切片后在显微镜下观察，认定"西藏灵燕"就是开菲尔的一个品系。
[0003] 十九世纪，西藏灵菇因其神秘奇异的功效而被欧洲一位医学院教授发现。据报道， 坚持饮用西藏灵菇发酵的酸奶，可以增强人体机能抵抗力、调节肠道、治疗心脏病、改善动 脉硬化、并对胆固醇水平有积极影响作用;缓解胃溃疡及十二指肠溃疡、保持血压正常；消 除疲劳，并能提供人体每日所需的维生素等。
[0004] 据研究，西藏灵菇菌是以耐热可鲁维酵母、亚罗可鲁维酵母为主体真菌；以乳酸杆 菌、嗜酸乳杆菌、短乳杆菌和乳酸链球菌等乳酸菌为主体细菌构成的块状共生菌系。
【发明内容】
[0005] 本发明提供一株从西藏灵燕中分离得到的干酪乳杆菌ZacioAaciDus casei LC577,将其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为:北京市 朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为:2016.02.19,保藏编号为:CGMCC N0.12151。
[0006] 本发明还提供上述干酪乳杆菌作为益生菌添加到各类普通食品、保健品等的应 用。
[0007] 本发明还提供上述干酪乳杆菌在制备乳制品中的应用，所述制备乳制品为制备干 酪、发酵酸奶、发酵乳饮料、饮用型酸奶或褐色益生菌乳饮料。
[0008] 在制备时，可以应用现有技术中的常用方法以干酪乳杆菌为益生菌来制备干酪、 发酵酸奶、发酵乳饮料、饮用型酸奶或褐色益生菌乳饮料，褐色益生菌乳饮料也可以以本发 明实施例4中的方法制备。
[0009] 作为优选，所述褐色益生菌乳饮料为活性褐色益生菌饮料或灭活型常温褐色乳饮 料。
[0010] 本发明还提供上述干酪乳杆菌在制备发酵果蔬制品中的应用，所述发酵果蔬制品 为发酵果汁、蔬菜汁、果蔬复合汁或发酵泡菜类食品。
[0011] 本发明还提供上述干酪乳杆菌在制备发酵肉制品或发酵茶制品中的应用。
[0012] 在制备时，可以应用现有技术中的常用方法以干酪乳杆菌为益生菌来制备发酵果 汁、蔬菜汁、果蔬复合汁或发酵泡菜类食品;或来制备发酵肉制品或发酵茶制品。
[0013] 本发明还提供一种活性褐色益生菌饮料，所述饮料中的益生菌为权利要求1所述 的干酪乳杆菌。
[0014] 本发明还提供一种灭活型常温褐色乳饮料，所述饮料中使用的菌为权利要求1所 述的干酪乳杆菌。
[0015] 本发明还提供一种活性益生菌发酵果蔬汁，所述饮料中的益生菌包括权利要求1 所述的干酪乳杆菌。
[0016]本发明的干酪乳杆菌是从藏灵燕中分离得到。干酪乳杆菌(ZacioAaciDus casei )属于乳杆菌属，兼性厌氧、不运动、无芽孢的杆菌或长杆菌，革兰氏阳性，过氧化氢酶阴性。 干酪乳杆菌具有良好的生理作用。在作为益生菌调节人体肠道菌群平衡、增强免疫功能、预 防疾病等方面有着广阔的发展前景。研究表明，干酪乳杆菌可增强宿主对微生物病原体的 非特异性抵抗力，加快肠道内病原体的清除；能够治疗肠道菌群紊乱，增强肠道通透性，从 而防止食物过敏和急性腹泻;抗低密度氧化脂抗体和CD4 T-淋巴细胞增加，粒细胞的噬菌 作用明显增强，对宿主进行免疫调节。另外，干酪乳杆菌在乳制品方面也有广泛应用，主要 应用于制作干酪和发酵酸奶、褐色乳饮料中。因此，干酪乳杆菌同时具有益生菌和发酵菌种 的双重作用。
【附图说明】
[0017] 附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实 施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中： 图1为本发明的干酪乳杆菌LC577产酸曲线。
【具体实施方式】
[0018] 以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为市 售。
[0019] 实施例1 1、西藏灵菇中干酪乳杆菌的分离鉴定 (1)菌株分离 取西藏灵菇块（自西藏当雄县当曲卡镇牧民家采集），用无菌生理盐水冲洗后，接入质 量百分比为12%的脱脂奶中，室温培养至凝乳。取lmL凝乳的脱脂奶，用9mL无菌生理盐水梯 度稀释后，在MRS固体培养基中进行涂布，37°C培养3天。选择长有单菌落的MRS平板，分别挑 取大小、颜色、状态不同的菌落，接入MRS液体培养基中，37 °C培养至浑浊。将菌液在MRS固体 培养基中划线分离，如此反复3次以上，以确定分离出的菌落为纯培养物。
[0020] (2)菌株鉴定 取菌落乳白色、凸起、边缘整齐，表面光滑，并在显微镜下为杆状菌、革兰氏阳性、过氧 化氢酶阴性的菌株，进行16S rDNA、/7如5·基應定。
[0021] 2、鉴定方法： ①单菌株基因组提取:用细菌基因组提取试剂盒提取菌株的基因组。
[0022]②PCR扩增16S rDNA片段:用表1所示的引物，进行16S rDNA片段的PCR扩增。
[0023] 表1 16S rDNA扩增引物
③ 16S rDNA测序：将PCR扩增产物送上海生工生物进行基因测序，测序结果如下： TTTTGGTCACCTTAGACGGCTCGCTCCCTAGAGGGTTACGCCACCGGCTTCGGGTGTTACAAACTCTCATGGTGTGA CGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCGTGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCGACTTCGT GTAGGCGAGTTGCAGCCTACAGTCCGAACTGAGAATGGCTTTAAGAGATTAGCTTGACCTCGCGGTCTCGCAACTCG TTGTACCATCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAA.GGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCT CCGGTTTGTCACCGGCAGTCTTACTAGAGTGCCCAACTAAATGCTGGCAACTAGTCATAAGGGTTGCGCTCGTTGCG GGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACC.ATGCACCACCTGTCATTTTGCCCCCGAAGGGGAAA CCTGATCTCTCAGGTGATCAAAAGATGTCAAGACC.TGGTAAGG.TTCTTCGCGTTGCTT.CGAATTAAACCACATG CTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAACCTTGCGGTCGTACTCCCCAGGCGGAATGCTTA ATGCGTTAGCTGCGGCACTGAAGGGCGGAAACCCTCCAACACCTAGCATTCATCGTTTACGGCATGGACTACCAGGG TATCTAATCCTGTTCGCTACCCATGCTTTCGAGCCTCAGCGTCAGTTACAGACCAGACAGCCGCCTTCGCCACTGGT GTTCTTCCATATATCTACGCATTTCACCGCTACACATGGAGTTCCACTGTCCTCTTCTGCACTCAAGTTTCCCAGTT TCCGATGCGCTTCCTCGGTTAAGCCGAGGGCTTTCACATCAGACTTAAAAAACCGCCTGCGCTCGCTTTACGCCCAA TAAATCCGGATAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTGG.TTGGA TACCGTCACGCCGACAACAGTTACTCTGCCGACCATTCTTCTCCAACAACAGAGTTTTACGACCCGAAAGCCTTCTT CACTCACGCGGCGTTGCTCCATCAGACTTGCGTCCATTGTGGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTTTGG GCCGTGTCTCAGTCCCAATGTGGCCGATCAACCTCTCAGTTCGGCTACGTATCAT.CGCCTTGGTGAGCCATTACCT CACCAACTAGCTAATACGCCGCGGGTCCATCCAAAAGCGATAGCTTACGCCATCTTTCAGCCAAGAACCATGCGGTT CTTGGATCTATGCGGTATTAGCATCTGTTTCCAAATGTTATCCCCCACTTAAGGGCAGGTTACCCACGTGTTACTCA CCCGTCCGCCACTCGTTCCATGTTGAATCTCGGTGCAAGCACCGAGCATCAACGAGAACTCGTTCGACTGCATTATA GCCGCCGCCCCGGC ④ joAeS·基因鉴定： 表2冰以基因扩增引物
pAeS 基因序列:AGCAAAACCGCCGTAAACGTCAGCATCAATGTTCGCTGCCTGTAGCACATTGGGATGCA CCATGCCGGCACCTAACACTTCAATCCAACCGGTATATTTGCAAACCGGGCAACCTTTACCGCCGCAACGAAAACAG GAAACATCAACTTCAACGGATGGCTCCGTAAATGGAAAATAACTTGGCCGCAAGCGAATTGTCCGATCTTTACCAAA CACGTGTTGGCACATGGCCAACAAGGTTCCCTTTAGATCAGCCATGGTTATATGCTTGTCAATGACGAGTCCTTCCA TCTGGTGAAACTGATGGCTATGAGTAGCATCGTCGTCATCACGTCGATAAACCACCCCAGGGCTAATCATTTTCAGC GGTCCTTTGGTAAAGTCGTGCTTTTCCATTGTCCGCGCCTGCATTGGACTTGTCTGCGAGCGCATGAGTAACTCATT GGTAATATAAAAAGTCTCTTGCATATCAT 经Blast比对，确定该菌为干酪乳杆菌casei，商业编号LC577。将其保 藏于：中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏地址为:北京市朝阳区北辰西路1号院3号， 保藏日期为:2016.02.19,保藏编号为:CGMCC NO. 12151。
[0024] 实施例2菌株发酵产酸特性 取本发明的干酪乳杆菌LC577甘油保存管，液体MRS培养基中连续活化三代，按3 %接种 于蛋白质含量为3.0%的巴氏灭菌脱脂复原乳中，培养温度35°C。每隔3h记录pH值，制作产酸 曲线，如图1所示。
[0025] 从图1可以看出，本发明的干酪乳杆菌LC577有良好的产酸能力，在脱脂复原乳中 发酵9h可凝乳，发酵14h，pH值即可迅速降至4.5,能避免发酵过程中染菌风险，可满足乳品 厂家对于优良干酪乳杆菌发酵性能的要求。发酵至60h，pH降至3.7-3.8之间，也可满足乳品 厂家对发酵中止时发酵乳酸度的要求。
[0026] 实施例3本发明的干酪乳杆菌LC577的性能测试 1、酸及胆盐耐受能力测定 取实施例1得到的本发明的干酪乳杆菌LC577，使用液体MRS培养基活化三代，接种量 3%，培养条件37°(：。
[0027] (1)模拟胃酸耐受性试验 取活化第三代的种子培养液(培养时间18h)，以接种量3 %接入pH3.0的液体MRS培养 基。在培养的〇h、4h分别进行活菌计数。计数平板37°C培养。
[0028] 对酸的耐受性以存活率表示，存活率越高，表明对酸的耐受能力越强。
[0029] 存活率=(4h活菌数/Oh活菌数）X 100%。
[0030] 结果如下： 表2模拟胃酸耐受性试验结果
实验结果表明，本发明的干酪乳杆菌Lpc577的耐酸性优于上述商业菌株。
[0031] (2)胆盐耐受性试验 取活化第三代的种子培养液(培养时间18h)，以接种量3%接入含0.3%牛胆盐(sigma)的 MRS培养基中，在第Oh、4h分别进行活菌计数。计数平板37 °C培养。
[0032] 对胆盐的耐受性以存活率表示，存活率越高，表明对胆盐的耐受能力越强。
[0033] 存活率=(4h活菌数/Oh活菌数）X 100%。
[0034] (3)结果如下： 表3胆盐耐受性实验结果
实验结果表明，LC577的胆盐耐受性优于上述商业菌株。
[0035]众所周知，益生菌在被摄取后需经受消化液的考验才能到达肠道，本实验结果证 明了 LC577具备较高的胃肠道生存率，也显示了该菌株作为益生菌开发的潜力。
[0036]实施例4本发明的干酪乳杆菌LC577作为发酵菌株的应用 用于长时发酵的褐色乳饮料发酵剂。以脱脂牛奶和葡萄糖为原料，经热处理发生美拉 德反应，再通过菌种长时间发酵，与稳定剂、白砂糖、水等混合制得一种养乐多风味的褐色 益生菌乳饮料。
[0037] 一、制作活性褐色乳饮料 (1) 菌种活化:将本发明的干酪乳杆菌Lpc577用MRS培养基在35 °C下连续活化三代，每 代16-18h; (2) 发酵基料配制：取120g脱脂奶，80g葡萄糖，用800ml的55°C纯水溶解后，均质，在95 °(：持续加热1.5小时进行美拉德反应，降温至35°C备用； (3) 接种发酵:按1%_3%接种量接入活化三代的Lpc577，35 °C发酵72h，得到发酵基料； (4) 稳定剂辅料准备：取适量稳定剂、12%白砂糖、3000ml纯化水，在85 °C下搅拌化料 20min。混合均勾后降温至35°C备用； (5 )基料、辅料混合:发酵结束后，取1重量份发酵基料，3重量份稳定剂辅料，搅拌均匀， 用柠檬酸调节pH至3.7，加入适量养乐多味香精； (6)均质、灌装。
[0038] (7)品尝口感特征：与市售同类饮料相比，口感清爽自然，略带涩感，酸甜适中，有 浓郁的酪香风味。
[0039]二、制作灭活型常温褐色乳饮料 (1) 菌种活化:将本发明的干酪乳杆菌Lpc577用MRS培养基35 °C下连续活化三代，每代 16-18h； (2) 发酵基料配制：取120g脱脂奶，60g葡萄糖，用800ml的55°C纯水溶解后，均质，在95 °(：持续加热2小时进行美拉德反应，降温至35°C备用； (3 )接种发酵:按1%_3%接种量接入活化三代的Lpc577，35 °C发酵80h，得到发酵基料； (4) 稳定剂辅料准备：取适量稳定剂、12%白砂糖、3000ml纯化水，在85 °C下搅拌化料 20min。混合均勾后降温至35°C备用； (5) 基料、辅料混合:发酵结束后，取1重量份发酵基料，3.5重量份稳定剂辅料，搅拌均 匀，用柠檬酸调节pH至3.7，加入适量果味香精； (6) 均质； (7) 灭菌:85°C下加热15min进行灭菌处理； (8) 灌装。
[0040] (9)品尝口感特征:与市售同类饮料相比，与果味香精结合自然，口感清爽，落口酸 感柔和，酪香风味突出。
[0041] 实施例5本发明的干酪乳杆菌LC577作为发酵菌株的应用 在发酵果蔬汁中的应用 干酪乳杆菌作为乳酸菌的一种，不具备分解纤维素和水解蛋白质的酶系统，所以在发 酵果蔬的过程中既不破坏植物细胞的组织，也不会降低果蔬原料的营养价值，相反，乳酸菌 利用原料中的可溶性物质代谢产生的多种氨基酸、维生素和酶提高发酵制品的营养价值。 [0042] 一、制作发酵胡萝卜汁 (1) 菌种活化:将本发明的干酪乳杆菌Lpc577用MRS培养基35 °C下连续活化三代，每代 16-18h； (2) 发酵基料配制:市售浓缩胡萝卜汁； (3) 配料：向浓缩胡萝卜汁中按6% -10%的重量比添加蔗糖，用食品级酸碱调节剂将pH调 至6.0-7.0; (4) 灭菌:将胡萝卜汁在90-95 °C灭菌15_20min; (5) 降温、接种发酵:按1%-3%接种量接入活化三代的Lpc577,35-37°C发酵16-24h，pH降 至3.8-4.2即可； (6) 稳定剂辅料准备:取适量稳定剂，用纯化水在85°C下搅拌化料20min，混合均匀后降 温至35 °C备用； (7) 基料、辅料混合:发酵结束后，取1重量份发酵基料，2-4重量份稳定剂辅料，搅拌均 匀； (8) 均质； (9) 灌装。
[0043] (10)品尝口感特征：与市售同类饮料相比，发酵后胡萝卜汁为天然的橙红色，状态 均匀，口感酸甜柔和，具有胡萝卜的特征香味。
[0044] 二、制作发酵芒果汁 (1) 菌种活化:将本发明的干酪乳杆菌Lpc577用MRS培养基35 °C下连续活化三代，每代 16-18h； (2) 发酵基料配制:市售浓缩芒果汁，按1:0.5-1:3加纯化水，稀释； (3) 配料：向浓缩芒果汁中按6% -10%的重量比添加蔗糖，用食品级酸碱调节剂将pH调 至6.0-7.0; (4) 灭菌:将浓缩芒果汁在90-95°C灭菌15-20min; (5) 降温、接种发酵:按1%-3%接种量接入活化三代的Lpc577,35-37°C发酵16-24h，pH降 至3.8-4.2即可； (6) 稳定剂辅料准备:取适量稳定剂，用纯化水在85°C下搅拌化料20min，混合均匀后降 温至35 °C备用； (7) 基料、辅料混合:发酵结束后，取1重量份发酵基料，2-4重量份稳定剂辅料，搅拌均 匀； (8) 均质； (9) 灌装。
[0045] (10)品尝口感特征：与市售同类饮料相比，发酵后芒果汁为天然的黄色，状态均 匀，酸甜适中，芒果特有的风味得到加强。
[0046] 最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明， 尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可 以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。 凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的 保护范围之内。
【主权项】
1. 一株从西藏灵燕中分离得到的干酪乳杆菌ZacioAaciDus casei LC577,其特征在 于:其保藏编号为:CGMCC NO. 12151。2. 权利要求1所述的干酪乳杆菌作为益生菌添加到各类普通食品、保健品等的应用。3. 权利要求1所述的干酪乳杆菌在制备乳制品中的应用，所述制备乳制品为制备干酪、 发酵酸奶、发酵乳饮料、饮用型酸奶或褐色益生菌乳饮料。4. 根据权利要求3所述的应用，其特征在于:所述褐色益生菌乳饮料为活性褐色益生菌 饮料或灭活型常温褐色乳饮料。5. 权利要求1所述的干酪乳杆菌在制备发酵果蔬制品中的应用，所述发酵果蔬制品为 发酵果汁、蔬菜汁、果蔬复合汁或发酵泡菜类食品。6. 权利要求1所述的干酪乳杆菌在制备发酵肉制品或发酵茶制品中的应用。7. -种灭活型常温褐色乳饮料，其特征在于:所述饮料中使用的菌包括权利要求1所述 的干酪乳杆菌。8. -种活性褐色益生菌饮料，其特征在于:所述饮料中的益生菌包括权利要求1所述的 干酪乳杆菌。9. 一种活性益生菌发酵果蔬汁，其特征在于:所述饮料中的益生菌包括权利要求1所述 的干酪乳杆菌。
【文档编号】A23L19/20GK106085904SQ201610420440
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年6月15日 公开号201610420440.1, CN 106085904 A, CN 106085904A, CN 201610420440, CN-A-106085904, CN106085904 A, CN106085904A, CN201610420440, CN201610420440.1
【发明人】赵林森, 齐世华, 马新颖, 崔文静, 刘明月
【申请人】河北一然生物科技有限公司