高效降解四氯愈创木酚的蜡样芽孢杆菌及其应用
【专利摘要】本发明公开了高效降解四氯愈创木酚的蜡状芽孢杆菌WTXJ1?16，所述蜡状芽孢杆菌的分类命名为蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus），已于2015年06月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌株保藏号为CGMCC No.10979。本发明还公开了蜡状芽孢杆菌WTXJ1?16在降解四氯愈创木酚中的应用。本发明提供了一株高效、快速降解四氯愈创木酚的菌株，该菌株在降解污灌苇田造纸废水具有高效的降解能力，从单因素试验初步确定了该降解菌适宜的四氯愈创木酚初始浓度、接种量、降解时间、降解温度、降解pH和转速等降解特性，响应面法获得了该优势降解菌株对四氯愈创木酚的最佳降解特性。CGMCC No.1097920150612
【专利说明】
高效降解四氯愈创木酚的蜡样芽孢杆菌及其应用
技术领域
[0001] 本发明属于环境微生物应用技术领域，涉及高效降解四氯愈创木酚的蜡状芽孢杆 菌WTXJ1-16及其应用。
【背景技术】
[0002] 目前我国造纸工业废水排放量及⑶D排放量在我国各类工业排放量中所占比例 大，造纸工业废水对水环境的污染最为严重，它不但是我国造纸工业污染防治的首要问题， 也是全国工业废水进行达标处理的首要问题之一。造纸废水的排入是芦苇湿地(苇田）生态 处理系统污染的重要来源，很容易对苇田动、植物、微生物和土壤酶的种类和数量带来较大 冲击。
[0003] 应用优势降解菌或降解酶对难降解有机污染物进行生物强化修复是提高难降解 有机物去除率行之有效的重要手段。四氯愈创木酚作为造纸废水中的一种典型污染物，其 污染面广，不易降解，具有较强的毒性，很容易穿透常规水污染控制工程屏障，能够在环境 中长期滞留，对环境造成严重的危害。在自然界自净能力的基础上，人类应该通过各种途径 促进自然界快速转化、降解积累在环境中的四氯愈创木酚。
[0004] 目前，人们已经对造纸废水中的对氯苯甲酸、3-氯邻苯二酚、4-氯邻苯二酚、3,5_ 二氯邻苯二酚、多氯联苯、氯苯、二氯苯、氯酚等有机氯的生物法处理做了大量研究，然而， 国内外关于生物法降解对四氯愈创木酚的研究报道却不多，尤其是在深入研究其降解菌及 其降解酶的性质及其应用于生物强化修复方面还处于起步阶段。
[0005] 以四氯愈创木酚为唯一碳源和能源，为今后利用该优势降解菌处理四氯愈创木酚 污染水体和土壤的工程实践提供理论依据。
[0006] 经检索有关专利文献，尚未见本发明中在应用蜡质芽孢杆菌WTXJ1-16降解四氯愈 创木酚的报道。该降解菌的发现对造纸废水中四氯愈创木酚的工程实践具有重要意义。
【发明内容】
[0007] 发明目的:针对现有技术问题，本发明的目的是提供一株高效、快速降解四氯愈创 木酚的菌株及其应用。
[0008] 技术方案:本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
[0009] 一方面，本发明提供了高效降解四氯愈创木酚的蜡状芽孢杆菌WTXJ1-16,所述蜡 状芽孢杆菌WTXJ1-16的分类命名为蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)，已于2015年06月12 日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为北京市朝阳 区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所），保藏号为CGMCC No. 10979。
[0010] 其中，上述蜡状芽孢杆菌WTXJ1-16由胜达集团江苏双灯纸业有限公司海涂生态系 统的苇田土壤中分离得到，具体分离方法如专利申请号为201410853541.9的专利申请(造 纸废水污灌苇田中典型细菌一一纺锤形赖氨酸芽孢杆菌的筛选及其用途)所述。该菌株具 有的生物学特征如图1:菌落较小，圆形，光滑，隆起，边缘整齐，在培养基正、反面颜色均为 乳白色。该菌细胞呈直杆状，直杆两端圆头，细胞大小约为1.4~2.8 X 0.5~0.8μπι，长有数 根鞭毛，端生Φ0.3~0.4μπι短圆形芽孢。革兰氏阳性，V.P试验阳性，甲基红试验阳性，Β引噪 试验阳性，能水解明胶，不能水解淀粉。
[0011]本发明还涉及所述的蜡状芽孢杆菌WTXJ1-16在降解四氯愈创木酚中的应用。
[0012] 优选的，所述降解条件为：降解温度20°C_36°C，pH 5 · 0~9 · 0，接种量4%-14%，浓 度200mg/L ~800mg/L，转速 150r/min~200r/min，降解时间 1 ~6d。
[0013]更为优选的，所述降解条件为：降解温度29°C，pH 7 · 3，接种量8 · 0 %，浓度156mg/ L，转速160r/min，降解时间5d下进行。
[0014]该蜡状芽孢杆菌WTXJ1-16适合培养条件为:培养基添加200mg/L~800mg//L四氯愈 创木酚，〖2冊〇41.78/1，1012?〇44.358/1，]\^5〇4.7!12〇0.28/1，冊4腸31.058/1，]\1115〇4.112〇 0.05g/L，FeS〇4.7H 20 0.01g/L，pH 7.0~7.2。
[0015] 上述的蜡状芽孢杆菌WTXJ1-16在制备四氯愈创木酚的生物降解剂中的用途。
[0016] 上述的蜡状芽孢杆菌WTXJ1-16在构建用于处理四氯愈创木酚的工程菌中的用途。
[0017] 本发明菌株在纯培养条件下，应用响应面分析法对重要单因素进行分析，在四氯 愈创木酚初始浓度为200mg/L的下，降解效率为35.96%，实测为36.01 %，两者十分接近，响 应面优化的模型和方程在分析和预测四氯愈创木酚具有很好的应用。
[0018] 有益效果:本发明的有益效果主要体现在:提供了一株高效、快速降解四氯愈创木 酚的菌株，该菌株对四氯愈创木酚具有更高效的降解能力，制备四氯愈创木酚的生物降解 剂中和构建用于处理四氯愈创木酚的工程菌中的用途具有很好的应用前景。
【附图说明】
[0019] 图1 SEM电镜下的WTXJ1-16菌株的鞭毛（X26500)和芽孢（X18500);
[0020] 图2不同温度下蜡状芽孢杆菌WTXJ1-16生长对四氯愈创木酚的降解曲线；
[0021] 图3不同pH下蜡状芽孢杆菌WTXJ1-16生长对四氯愈创木酚的降解曲线；
[0022] 图4不同接种量下蜡状芽孢杆菌WTXJ1-16生长对四氯愈创木酚的降解曲线；
[0023] 图5不同浓度下蜡状芽孢杆菌WTXJ1-16生长对四氯愈创木酚的降解曲线；
[0024] 图6不同时间下蜡状芽孢杆菌WTXJ1-16生长对四氯愈创木酚的降解曲线；
[0025] 图7温度与pH对降解率的响应面关系图；
[0026] 图8温度与浓度对降解率的响应面关系图；
[0027]图9 pH与时间对降解率的响应面关系图。
【具体实施方式】
[0028] 下面通过具体的实施例对本发明进一步说明，应当指出，对于本领域的普通技术 人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干变型和改进，这些也应视为属于 本发明的保护范围。
[0029] 实施例1:蜡状芽孢杆菌WTXJ1-16对四氯愈创木酚的生物降解性能检测
[0030] 1.不同温度下蜡状芽孢杆菌WTXJ1-16对四氯愈创木酚的生物降解特性
[0031] 在不同温度下实施蜡状芽孢杆菌WTXJ1-16对四氯愈创木酚的降解实验，发现其在 20°C_36°C具有较高的降解四氯愈创木酚的能力，从实际应用角度看，28.6Γ为最佳温度， 此时去除率最尚，具体实施步骤如下：
[0032] 分别取无机培养基（K2HP〇4l .7g/L，KH2P〇44.35g/L，MgS〇4 · 7H20 0.2g/L， NH4N〇3l.05g/L，MnS〇4.H20 0.05g/L，FeS〇4.7H20 0.01g/L，调pH 7.0~7.2)。取实验室-70 °C保藏的WTXJ1 -16，立即在40 °C水中适当快速摇动，使其完全解冻。开启塑料冻存管，将菌 液移至细菌培养基上进行两次活化，用无菌水分别制成含菌量约为1 .〇 X l〇8cfu/ml的菌悬 液。将含菌量约为1.0X108cfu/ml的优势降解菌悬液以10%的接种量接种于5ml的发酵培 养基中（四氯愈创木酚初始浓度为200mg/L，pH 7.0)，置于150r/min的水浴恒温振荡器中， 在不同温度下26°C、28°C、30°C、32°C、34°C、36°C )培养至第4d，取样测定四氯愈创木酚降解 率和含菌量。
[0033] 结果如图2所示，随着温度的升高，四氯愈创木酚降解率先变大后持续减小，减少 的幅度较小，含菌量先增多后持续减少。在28°C时，四氯愈创木酚降解达最大，菌株在28°C 时也达到最大，说明适当的温度有利于该菌的生长和四氯愈创木酚的降解。因此，28°C左 右是四氯愈创木酚的适宜降解温度。
[0034] 2.不同pH下蜡状芽孢杆菌WTXJ1-16对四氯愈创木酚的降解特性
[0035]在不同pH下实施蜡状芽孢杆菌WTXJ1-16对四氯愈创木酚的降解实验，结果表明生 长降解pH值为7.29，具体实施方案如下：
[0036]在等量的无机培养基中将含菌量约为1.0 X108cfu/ml的优势降解菌悬液以10% 的接种量接种于51111的不同？!1(?!16.0、？!16.5、？!17.0、？!17.5、？!18.0、？!18.5)的发酵培 养基中（四氯愈创木酚初始浓度为200mg/L)，四氯愈创木酚为唯一碳源，置于32°C、150r/ min的水浴恒温振荡器中培养至第4d，取样测定四氯愈创木酚降解率和含菌量。
[0037] 结果如图3所示，降解率随着pH的增大，四氯愈创木酚降解率先缓慢增加后减小， 而含菌量先增加后急剧减小。在PH7.5处达到最大其最大降解率为35.03%，在pH7.5处菌数 达到最大，说明pH越高不利于该菌生长。所以pH 7.5是四氯愈创木酚的适宜pH。
[0038] 3.不同接种量下蜡状芽孢杆菌WTXJ1-16对四氯愈创木酚的降解特性
[0039]在不同接种量下实施蜡状芽孢杆菌WTXJ1-16对四氯愈创木酚的降解实验，结果表 明，在接种量4%_14%有较高的降解四氯愈创木酚的能力，接种量为8%时，有最大得降解 效率，具体实施方案如下：
[0040] 在等量的无机培养基中将优势降解菌制成含菌量约为1.0X108cfu/ml的菌悬液， 以4%、6%、8%、10%、12%、14%的接种量接种于5ml的发酵培养基中（四氯愈创木酚浓度 为200mg/L，pH 7.0)置于32 °C、150r/min的水浴恒温振荡器中培养至第4d，取样测定四氯愈 创木酚降解率和含菌量。
[0041] 结果如图4所示，随着接种量的增加，四氯愈创木酚降解率先增加后缓慢下降，而 含菌量先增加后急剧下降。在10%时四氯愈创木酚降解率最大。而菌的含量在8%时达到最 大，可以看出并非接种量越大其降解率就越大，过多的接种量不能有效提高降解，增加成 本。因此选择8 %为适宜接种量。
[0042] 4.蜡状芽孢杆菌WTXJ1-16对不同浓度四氯愈创木酚的降解特性
[0043]在不同初始浓度四氯愈创木酚对样芽孢杆菌WTXJ1-16实施降解，结果表明， WTXJ1-16对四氯愈创木酚的耐受浓度为200mg/L。具体实施方案如下：
[0044]在等量的无机培养基将含菌量约为1.0 X108cfu/ml的优势降解菌悬液以10%的 接种量接种入5ml的发酵培养基中（四氯愈创木酚浓度为200、400、600、800mg/L，pH 7.0)， 置于32°C、150r/min的水浴恒温振荡器中培养至第4d，取样测定四氯愈创木酚降解率和含 菌量。
[0045] 结果如图5所示，随着初始目标物质浓度的增加，其降解率一直下降，而含菌量先 下降逐渐趋于平缓。其中200mg//L四氯愈创木酚的降解率最大，浓度过大可导致菌死亡。由 此可见菌株WTXJ1-16在200mg/L时生长较好，并能达到很好的降解。
[0046] 5.不同时间下蜡状芽孢杆菌WTXJ1-16对四氯愈创木酚的降解特性，
[0047]在不同初始浓度四氯愈创木酚对样芽孢杆菌WTX J1 -16实施降解，结果表明， WTXJ1-16对四氯愈创木酚的降解最适宜的时间为5.05d。具体实施方案如下：
[0048]在等量的无机培养基将含菌量约为1.0 X108cfu/ml的优势降解菌悬液以10%的 接种量接种于5ml的发酵培养基中（四氯愈创木酚浓度为200mg/L，pH 7.0)，置于32°C、 150r/min的水浴恒温振荡器中，分别培养至第2d、4d和6d，取样测定四氯愈创木酚降解率和 含菌量。
[0049] 结果如图6所示，随降解时间的延长，四氯愈创木酚降解率先快速增加后渐趋平 缓，而含菌量则先增加后急剧下降。培养〇-4d，四氯愈创木酚降解率与含菌量呈正相关。培 养4d后，四氯愈创木酚降解继续增加，而菌体开始衰亡，至6d，四氯愈创木酚降解达最大，而 菌体已死亡殆尽，说明适当生长降解时间有利于该菌的生长和四氯愈创木酚的降解，但过 分的延长降解时间则可导致菌体死亡。因此4d左右是四氯愈创木酚的适宜降解时间。
[0050] 实施例2:响应面法优化WTXJ1-16对四氯愈创木酚的降解特性
[0051 ] 采用Box-Behnken法，对Plackett-Burman设计筛选出的主要单因素进行深入研 究，以获得最优降解条件和优化模型，具体实施方案如下：
[0052] 响应曲面方程为:Y = bo+ 21^11+213；^^1」+213；^12：[：[。式中，￥为响应值;13()为回 归系数;bi为xi的线性效应;bii为xi的二次效益;bi j表示xi与xj间的线性交互效益;xa为 自变量，它与自变量的真实值Xa的关系为xa = (X ao-Xao)/ Δ Xa。式中，Xa0为实验中心的真 实值，A Xi为自变量变化。
[0053] 响应面分析因素水平的选取及试验设计如下表1
[0054] 表1 Box-Behnken试验设计方案中的因素和水平
[0055]
[0056] Box-Behnken设计为5因素3水平共46个实验点，实验方案及结果见表3-10。46个实 验点分两类:40个析因点;6个零点。Box-Behnken试验设计方案及四氯愈创木酚降解率的响 应值见表2
[0057]
[0058]
[0059] 根据表2的实验结果，以四氯愈创木酚降解率(P)为响应值，对数据进行回归分析， 可得拟合方程：
[0060] P = 31 · 77+1 · 27*Α-0 · 20*B-1 · 85*03 · 29*D+4 · 13*Ε-0 · 36*A*B-1 · 74*A*C+0 · 23*A* D-2.10*A*E+2.62*B*C+0.67*B*D+1.21*B*E+1.83*C*D+1.20*C*E-5.82*D*E-3.24*Α λ2-3·16*Βλ2-0·60*Ca2-9·54*Da2-4·14*Ε λ2。
[0061] 对于该方程进行检验，该模型的校正决定系数R2Ajd为0.9317,说明方程的拟合度 比较好，此模型能解释93.17%响应值的变化。WTXJ1-16优势降解菌降解四氯愈创木酚中四 氯愈创木酚初始浓度、降解时间、降解pH、接种量、降解温度5个因素之间交互作用对降解率 的影响如图7、图8和图9所示。
[0062]对上述回归方程中的五个因素分别求偏导数使其等于0,得出最佳的降解条件:降 解温度28.61°C，降解pH7.29，接种量8.0 %，四氯愈创木酚初始浓度156.08mg/L，降解时间 5.05d，预测的降解率为35.9603 %。取实测降解温度29 °C，降解pH7.3，接种量8.0 %，四氯愈 创木酚初始浓度156mg/L，降解时间5d，转速160r/min，获得实测降解率为36.01 %，与预测 值十分接近，说明响应面优化的模型和方程可以用来分析和预测四氯愈创木酚降解率。
【主权项】
1. 高效降解四氯愈创木酚的蜡状芽孢杆菌WTXJ1-16,其特征在于，所述蜡状芽孢杆菌 WTXJ1-16的分类命名为錯状芽孢杆菌(ifeciDus cereus)，已于2015年06月12日保藏于中 国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌株保藏号为CGMCC No. 10979。2. 根据权利要求1所述的蜡状芽孢杆菌WTXJ1-16在降解四氯愈创木酚中的应用。3. 根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述降解条件为：降解温度20°C-36°C，pH 5 · 0~9 · 0，接种量 4%-14%，浓度 200mg/L~800mg/L，转速 150r/min~200r/min，降解时间 1 ~6d。4. 根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述最佳降解条件:降解温度29°C，降解pH 7.3，接种量8.0%，初始四氯愈创木酚浓度156 mg/L，转速160r/min，降解时间5 d。5. 根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于，该蜡状芽孢杆菌WTXJ1-16适合培养条 件为：培养基添加 200 mg/L~800mg/L 四氯愈创木酚，K2HP〇4 1.7 g/L，KH2P〇4 4.35 g/L， MgS〇4 ·7Η20 0.2 g/L，NH4N03 1.05 g/L，MnS〇4.H20 0.05 g/L，FeS〇4.7H20 0.01 g/L，pH 7.0~7.2。6. 权利要求1所述的蜡状芽孢杆菌WTXJ1-16在制备四氯愈创木酚的生物降解剂中的用 途。7. 权利要求1所述的蜡状芽孢杆菌WTXJ1-16在构建用于处理四氯愈创木酚的工程菌中 的用途。
【文档编号】C12R1/085GK106085907SQ201610427339
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年6月16日
【发明人】丁成, 陈天明, 李朝霞, 杨百忍, 金建祥, 陈爱辉, 肖波
【申请人】盐城工学院