玉米秸秆基质化的熟化菌剂及应用
【专利摘要】本发明提供一种玉米秸秆基质化的熟化菌剂，其活性成分为热纤梭菌(Clostridium thermocellum)、解纤维素木聚糖单胞菌(Xylanimonas cellulosilytica)、蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)和地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)，以上四种菌的集落形成单位数目之比分别为4?5:2?3:2?3:2?3，所述菌剂的有效活菌数为109个/mL以上。本发明还提供所述熟化菌剂在玉米秸秆基质化的腐熟发酵中的应用。本发明的熟化菌剂对玉米秸秆的降解率高，在进行大规模熟化发酵时，20天内可分解秸秆的40?70％，为玉米秸秆基质化提供了重要技术手段，在有机栽培基质生产领域具有广阔的应用前景。
【专利说明】
玉米秸秆基质化的熟化菌剂及应用
技术领域
[0001] 本发明涉及农业废弃物的资源化利用领域，具体地说，涉及玉米秸杆基质化的熟 化菌剂及应用。
【背景技术】
[0002] 近年来，随着工厂化育苗技术和无土栽培技术的迅速发展，对于栽培基质的需求 量日益激增，常见的育苗栽培基质如草炭、蛭石等资源有限，且短时间不可再生，岩棉等使 用后较难处理，易对环境造成污染，迫切需要开发新型的替代栽培基质。我国是农业大国， 每年产生大量的农作物秸杆，尤其玉米秸杆的产量巨大，如果将这些玉米秸杆进行高温熟 化发酵，实现无害化处理，可以生产大量的商品栽培基质，真正实现农业废弃物的资源化利 用。
[0003] 玉米秸杆含有大量的木质纤维素成分，分解难且速度慢;作为基质物理性状粗糙， 密度小，孔隙大;作为栽培基质烧根严重，抑制农作物生长。利用玉米秸杆生产有机栽培基 质必须进行高温熟化发酵，旨在分解大分子物质(木质纤维素、糖类、淀粉、脂肪、蛋白），降 低碳氮比，消灭杂草、病原菌，以适应作物生长。熟化发酵是在微生物的作用下，将可分解的 有机物全部分解，进入安全使用状态，部分元素矿化成植物养分的过程。在熟化过程中，首 先是糖类、淀粉、脂肪、蛋白等物质易分解物分解产热的升温阶段，伴随纤维素、半纤维素分 解而持续产热的高温发酵阶段。其中纤维素和半纤维素的分解快慢和分解程度决定着熟化 的程度。近年来，菌剂在发酵过程中的应用研究较多，但是针对栽培基质熟化的菌剂并不 多，尤其是玉米秸杆基质化的快速熟化菌剂方面的报道更是凤毛麟角。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种玉米秸杆基质化的熟化菌剂。
[0005] 本发明的另一目的是提供所述熟化菌剂在玉米秸杆基质化的腐熟发酵中的应用。
[0006] 为了实现本发明目的，本发明的一种熟化菌剂，其活性成分为热纤梭菌 (Clostridium thermocellum)、解纤维素木聚糖单胞菌(Xylanimonas cellulosilytica)、 錯样芽抱杆菌(Bacillus cereus)和地衣芽抱杆菌(Bacillus licheniformis)。以上四种 菌的CFU(集落形成单位数目）之比分别为4-5: 2-3: 2-3: 2-3(优选4:2:2:2)，所述菌剂的有 效活菌数为1〇9个/mL以上。
[0007] 优选地，其活性成分为保藏号DSM No. 1237的热纤梭菌、保藏号DSM No. 15894的解 纤维素木聚糖单胞菌、保藏号ACCC No.03315的蜡样芽孢杆菌和保藏号ACCC No.01958的地 衣牙抱杆囷。
[0008] 其中，所述的热纤梭菌为厌氧细菌，具有纤维素酶活高、可快速分解农业废弃物中 的纤维素和半纤维素，该菌种保藏于德国微生物菌种保藏中心（DSMZ)，保藏号为DSM No. 1237;解纤维素木聚糖单胞菌为好养细菌，可分解纤维素和半纤维素成分，该菌种保藏 于德国微生物菌种保藏中心，保藏号为DSM No. 15894;蜡样芽孢杆菌为好氧细菌，具有产生 纤维素酶的特性，该菌种保藏于中国农业微生物菌种保藏管理中心(ACCC)，保藏号为ACCC No. 03315;地衣芽孢杆菌为好氧细菌，具有纤维素分解功能，该菌种保藏于中国农业微生物 菌种保藏管理中心，保藏号为ACCC No.01958。以上四种菌种可通过相应的菌种保藏机构购 买获得。
[0009]优选地，本发明的熟化菌剂中还包括吸附载体，所述活性成份与吸附载体的比例 关系为1CFU: (1 X 10-6~1 X 10-5) g吸附载体，优选1CFU: 5 X 10-6g吸附载体。
[0010]更优选地，所述吸附载体由40-60目（优选40目）的麦饭石和玉米秸杆粉按2-4:6-8 (优选2:8)的重量比组成。
[0011]本发明还提供所述熟化菌剂的制备方法，包括以下步骤：
[0012] ⑴种子液的制备：
[0013] 将热纤梭菌接种于蛋白胨纤维素改良培养基中，在50°C条件下静止培养2d，收集 发酵液作为种子液；
[0014] 将解纤维素木聚糖单胞菌接种于蛋白胨纤维素改良培养基中，在50°C条件下静止 培养2d，收集发酵液作为种子液；
[0015] 将蜡样芽孢杆菌接种于蛋白胨纤维素改良培养基中，在50°C条件下静止培养ld， 收集发酵液作为种子液；
[0016] 将地衣芽孢杆菌接种于蛋白胨纤维素改良培养基中，在50°C条件下静止培养ld， 收集发酵液作为种子液；
[0017] (2)菌种的扩大培养：
[0018] 将步骤（1)中所得各种子液分别接种于蛋白胨纤维素改良培养基中，在培养温度 为50°C的发酵罐中静止逐级扩大培养，扩大过程按5%~10%的体积比转接，当发酵液中的 有效活菌数达到1〇 9个/mL时终止培养；
[0019] ⑶熟化菌剂的制备：
[0020] 将步骤(2)中所得各发酵液按比例混合，然后向其中添加吸附载体混匀，即得熟化 菌剂。
[0021] 步骤（1)和(2)中所用的蛋白胨纤维素改良培养基的配制方法如下：将蛋白胨5g、 酵母提取物18、恥(：158、1(2册〇4 18、]\%3〇4.7!1200.358和〇3〇)338溶解在比水中，灭菌即得。
[0022] 本发明还提供所述熟化菌剂在纤维素及半纤维素分解中的应用。
[0023] 本发明还提供所述熟化菌剂在玉米秸杆基质化的腐熟发酵中的应用。
[0024]本发明还提供一种栽培基质的制备方法，将玉米秸杆、尿素、碳酸钙和水混合，添 加适量所述熟化菌剂，混匀后堆制进行腐熟发酵，发酵周期为15-25天(优选20天），所得发 酵产物即作为栽培基质。
[0025]前述的方法，将玉米秸杆、尿素和碳酸钙按98:1:0.1的质量比混合，向其中添加玉 米秸杆、尿素和碳酸钙总重55-60% (优选60%)的水，所得熟化发酵原料与熟化菌剂按100: 0.5-1(优选100:0.5)的质量比混匀，堆成宽1-3111、高1-2111、长2-100111(优选宽3111、高1.3111、长 5m)的长方体进行腐熟发酵，发酵周期为20天，发酵过程中当堆体温度超过50°C时，每天翻 堆一次，直至发酵完成。
[0026] 本发明还提供由上述方法制备的栽培基质。
[0027] 本发明进一步提供所述栽培基质在植物无土栽培中的应用。所述植物包括水稻。
[0028] 本发明具有以下优点：
[0029] ( - )本发明提供的玉米秸杆基质化的熟化菌剂，纤维素和半纤维素酶活高，可在 玉米秸杆熟化发酵的初期有效分解纤维素和半纤维素成分，从而快速破坏坚硬的木质纤维 素结构，达到松散秸杆结构的作用，之后进入纤维素、半纤维素的同步高效熟化阶段。
[0030] (二)本发明的熟化菌剂为细菌微好氧复合菌系，可在微好氧的熟化发酵过程中， 相对好氧的菌株解纤维素木聚糖单胞菌、蜡样芽孢杆菌及地衣芽孢杆菌先行分解纤维素和 半纤维素的同时消耗局部氧气，创造局部厌氧，为厌氧纤维素分解菌-热纤梭菌创造分解环 境，进一步加快纤维素和半纤维素的分解，促进原料整体的熟化进度。
[0031] (三)本发明的熟化菌剂对玉米秸杆的降解率高，在进行大规模熟化发酵时，20天 内可分解猜杆的40-70 %。
[0032] (四）本发明的熟化菌剂突破了由纯化菌及其分解酶无法高效分解天然纤维素的 局限，为玉米秸杆基质化提供了重要技术手段，在有机栽培基质生产领域具有广阔的应用 前景。
【具体实施方式】
[0033]以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例 中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
[0034]以下实施例中所用蛋白胨纤维素(PCS)改良培养基的配制方法如下:将蛋白胨5g、 酵母提取物18、恥(：158、1(2册〇4 18、]\%3〇4*7!1200.358和〇3〇)338溶解在比水中。121°(：蒸汽 灭菌15分钟。
[0035]实施例1-3玉米秸杆基质化的熟化菌剂的制备
[0036] 实施例1-3中制备的熟化菌剂，其活性成分为热纤梭菌（Clostridium thermocellum)保藏号DSM No . 1237、解纤维素木聚糖单胞菌（Xylanimonas cellulosilytica)保藏号DSM No · 15894、錯样芽抱杆菌（Bacillus cereus)保藏号ACCC Ν〇·03315和地衣芽抱杆菌(Bacillus licheniformis)保藏号ACCC Ν〇·01958。
[0037] 1、种子液的制备：
[0038]将热纤梭菌保藏号DSM No. 1237接种于蛋白胨纤维素(PCS)改良培养基中，在50°C 条件下静止培养2d，收集发酵液作为种子液；
[0039]将解纤维素木聚糖单胞菌保藏号DSM No. 15894接种于蛋白胨纤维素改良培养基 中，在50°C条件下静止培养2d，收集发酵液作为种子液；
[0040]将蜡样芽孢杆菌保藏号ACCC No.03315接种于蛋白胨纤维素改良培养基中，在50 °c条件下静止培养Id，收集发酵液作为种子液；
[0041 ]将地衣芽孢杆菌保藏号ACCC No.01958接种于蛋白胨纤维素改良培养基中，在50 °(：条件下静止培养ld，收集发酵液作为种子液。
[0042] 2、菌种的扩大培养：
[0043] 将步骤1中所得各种子液分别接种于蛋白胨纤维素改良培养基中，在培养温度为 50 °C的发酵罐中静止逐级扩大培养，扩大过程按5%~10%的体积比转接，当发酵液中的有 效活菌数达到1〇9个/mL时终止培养。
[0044] 3、熟化菌剂的制备：
[0045] 将步骤2中所得的热纤梭菌发酵液、解纤维素木聚糖单胞菌发酵液、蜡样芽孢杆菌 发酵液和地衣芽孢杆菌发酵液按CFU之比4:2:2:2 (实施例1，实施例2中四种菌的CFU之比为 5: 2: 3: 2，实施例3中四种菌的CFU之比为4:3: 2:3)混合，然后向其中添加吸附载体混匀，即 得熟化菌剂。其中，活性成份与吸附载体的比例关系为lCFU:5Xl(T6g吸附载体。所述吸附载 体由40目的麦饭石和玉米秸杆粉按2:8的重量比组成。
[0046] 实施例4熟化菌剂在玉米秸杆基质化的腐熟发酵中的应用
[0047]实验组1-实验组3:将玉米秸杆、尿素和碳酸钙按98:1:0.1的质量比混合，向其中 添加玉米秸杆、尿素和碳酸钙总重60%的水，所得熟化发酵原料分别与实施例1-3(实施例 1、实施例2和实施例3分别对应于实验组1、实验组2和实验组3)制备的熟化菌剂按100:0.5 的质量比混匀，堆成宽3m、高1.3m、长5m的长方体进行腐熟发酵，发酵周期为20天，发酵过程 中当堆体温度超过50 °C时，每天翻堆一次，直至发酵完成。
[0048]对照组：不添加实施例1-3制备的熟化菌剂，直接将熟化发酵原料堆成宽3m、高 1.3m、长5m的长方体进行腐熟发酵。发酵条件同上。
[0049] 实验结果，施用菌剂后7天，玉米秸杆的纤维素分解率达到10.5%，半纤维素分解 率达到13.0%，结构有松散迹象，之后进入纤维素和半纤维素的旺盛分解阶段。施用20天 后，玉米秸杆的分解率达40 %以上。
[0050] 发酵20天后，实验组和对照组发酵产物主要参数比较结果见表1。
[0051]表1发酵产物主要参数比较结果
[0052]
[0053]实施例5无土栽培基质在水稻育苗中的应用
[0054]将实施例4中获得的发酵产物作为无土栽培基质，用于水稻育苗。
[0055] 实验组1-3:将实施例4中获得的实验组的基质，取总干重约300g，均匀铺于长宽高 60 X 30 X 4cm的专用薄塑料盘中，基质厚度约3cm，轻度镇压后饶透pH5.5的硫酸水，每盘播 种l〇〇g(干重计)发芽水稻种子，覆表土 0.5cm厚，温室育苗30天，温度模拟东北春季条件，白 天25°C，夜间10-15Γ。实验设置3个重复，并于30天后测定水稻秧苗的生长状况。
[0056] 对照组:参照上述实验组的操作方法，仅将基质替换成实施例4对照组中获得的基 质。
[0057]实验组1-3和对照组水稻秧苗的生长状况见表2。
[0058]表2水稻秧苗的生长状况
[0059]
[0060]虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在 本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因 此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
【主权项】
1 · 一种熟化菌剂，其特征在于，其活性成分为热纤梭菌(Clostridium thermocellum)、 解纤维素木聚糖单胞菌（Xylanimonas cellulosilytica)、錯样芽孢杆菌（Baci 1 lus cereus)和地衣芽抱杆菌(Bacillus licheniformis)，以上四种菌的CFU之比分别为4-5:2-3:2-3:2-3，所述菌剂的有效活菌数为109个/mL以上。2. 根据权利要求1所述的熟化菌剂，其特征在于，其活性成分为保藏号DSM No. 1237的 热纤梭菌、保藏号DSM No. 15894的解纤维素木聚糖单胞菌、保藏号ACCC No.03315的蜡样芽 孢杆菌和保藏号ACCC No.01958的地衣芽孢杆菌，优选以上四种菌的CFU之比分别为4:2:2: 2〇3. 根据权利要求1或2所述的熟化菌剂，其特征在于，所述菌剂中还包括吸附载体，所述 活性成份与吸附载体的比例关系为1CFU: (1 X 10-6~1 X l(T5)g吸附载体，优选1CFU:5 X 10一 6g吸附载体。4. 根据权利要求1-3任一项所述的熟化菌剂，其特征在于，所述吸附载体由40-60目麦 饭石和玉米猜杆粉按2_4:6_8的重量比组成。5. 权利要求3或4所述熟化菌剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤： (1) 种子液的制备： 将热纤梭菌接种于蛋白胨纤维素改良培养基中，在50°C条件下静止培养2d，收集发酵 液作为种子液； 将解纤维素木聚糖单胞菌接种于蛋白胨纤维素改良培养基中，在50°C条件下静止培养 2d，收集发酵液作为种子液； 将蜡样芽孢杆菌接种于蛋白胨纤维素改良培养基中，在50°C条件下静止培养ld，收集 发酵液作为种子液； 将地衣芽孢杆菌接种于蛋白胨纤维素改良培养基中，在50°C条件下静止培养ld，收集 发酵液作为种子液； (2) 菌种的扩大培养： 将步骤（1)中所得各种子液分别接种于蛋白胨纤维素改良培养基中，在培养温度为50 °(：的发酵罐中静止逐级扩大培养，扩大过程按5%~10%的体积比转接，当发酵液中的有效 活菌数达到1〇9个/mL时终止培养； (3) 熟化菌剂的制备： 将步骤（2)中所得各发酵液按比例混合，然后向其中添加吸附载体混匀，即得熟化菌 剂； 步骤（1)和（2)中所用的蛋白胨纤维素改良培养基的配制方法如下：将蛋白胨5g、酵母 提取物lg、NaCl 5g、K2HP〇4 lg、MgS〇4.7H20 0.35g和CaC03 3g溶解在 1L水中，灭菌即得。6. 权利要求1-4任一项所述熟化菌剂在纤维素及半纤维素分解中的应用。7. 权利要求1-4任一项所述熟化菌剂在玉米秸杆基质化的腐熟发酵中的应用。8. -种栽培基质的制备方法，其特征在于，将玉米秸杆、尿素、碳酸钙和水混合，添加适 量权利要求1-4任一项所述熟化菌剂，混匀后堆制进行腐熟发酵，发酵周期为15-25天，所得 发酵产物即作为栽培基质。9. 根据权利要求8所述的方法，其特征在于，将玉米秸杆、尿素和碳酸钙按98:1:0.1的 质量比混合，向其中添加玉米秸杆、尿素和碳酸钙总重55-60%的水，所得熟化发酵原料与 熟化菌剂按100:0.5-1的质量比混匀，堆成宽1-3111、高1-2111、长2-100111的长方体进行腐熟发 酵，发酵周期为20天，发酵过程中当堆体温度超过50°C时，每天翻堆一次，直至发酵完成。10.根据权利要求8或9所述方法制备的栽培基质。
【文档编号】C12N1/20GK106085909SQ201610437451
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年6月17日
【发明人】方春光
【申请人】大庆市春田绿土农业科技有限公司