一株具有杀线虫活性的草酸青霉菌nbc008、其制备方法及应用
【专利摘要】本发明涉及一株具有杀线虫活性的草酸青霉菌NBC008、其制备方法及应用。本发明从挪威东福尔郡小麦孢囊线虫群体上分离筛选出一株活性较高的真菌菌株P.oxalicum NBC008，保藏编号CGMCC No.12473。通过液体发酵培养制备，其发酵产物对植物寄生线虫有明显的毒杀作用。室内测定本菌株发酵液对大豆孢囊线虫2龄幼虫和卵孵化的影响。不同稀释浓度发酵液的处理对大豆孢囊线虫2龄幼虫具有毒杀作用，对卵孵化具有明显的抑制作用。发酵原液能使大豆孢囊数量下降59.88％，具有良好的开发应用前景。CGMCC No.1247320160517
【专利说明】
一株具有杀线虫活性的草酸青霉菌NBC008、其制备方法及 应用
技术领域
[0001] 本发明属于微生物农药技术领域，具体涉及一株具有毒杀植物寄生线虫的真菌及 其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002] 植物寄生线虫是重要的植物病原物之一，在全世界普遍发生，其寄主范围广，为害 严重，全世界每年由植物寄生线虫造成的经济损失高达1570亿美元（简恒，2011.植物线虫 学.北京：中国农业大学出版社）。其中，大豆孢囊线虫（Soybean Cyst Nematode，SCN)是为 害最为严重的植物寄生线虫之一。
[0003] 大豆孢囊线虫，在我国发现最早（1899年），最初学名采用Heterodera schachtii， 这是甜菜孢囊类线虫的学名。1952年Ichinohe通过细致的观察，单独建立大豆孢囊线虫 Heterodera glycines这个种(刘维志.2004.植物线虫志·北京：中国农业大学出版社）。大 豆孢囊线虫主要为害大豆根部，现在已在日本（Ichinohe M. 1988.Current research on the major nematode problems in Japan.Journal of Nematology.20(2):184-190·)、美 国（Wrather J.A.,Koenning S.R.,Anderson T.R.2003.Effect of diseases on soybean yields in the United States and 0ntario(1999to 2002).Plant Health Progress (March) .0-16·)、意大利（Manachini D.2000.First report of Heterodera glycines Ichinohe on soybean in Italy.Bolletino di Zoologia Agraria e Bachicoltura, Serie 11.32:261-267·)、巴西（Asmus G.L.，Teles T.S.，Anselmo J.et al.2012.Races of Heterodera glycines in the Northeast of Mato Grosso do Sul,Brazil.Tropical Plant Pathology.37(2) :146-148.)等15个国家和地区发现报道。在我国，主要分布在东北 和黄淮海等共16个省市自治区。大豆孢囊线虫病的流行可造成大豆减产10%_20%，重者达 50%，甚至绝产（Liu X.，Li J.，Zhang D.1997.History and status of soybean cyst nematode in China.International Journal of Nematology·7(1):18-25·)〇
[0004] 目前防治大豆孢囊线虫的防治仍以化学药剂为主，但由于存在毒性高、污染环境， 对人畜健康存在潜在威胁等问题(张克勤，何世川，周薇等.1991.真菌和细菌在线充生防中 的作用及其研究进展.杀虫微生物.3:55-66)，减少化学农药的使用成为一种必然。因此寻 找一种环境友好的方法来防治线虫十分必要。生物防治作为一种安全有效手段在植物病原 线虫防治中得到了广泛的研究和应用。淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinus)，它不仅能 够寄生孢囊线虫，还能够抑制线虫的活动(姜培增，李宏园，陈铁保.2006.淡紫拟青霉防治 植物线虫研究进展.中国农业科技导报，8(6) :38-14.)。洛斯里被毛孢霉（Hirsutella rhossiliensis)能使大豆孢囊线虫种群数量降低79% (Zhang L.，Yang E·，Xiang M.et al.2008.Population dynamics and biocontrol efficacy of the nematophagous fungus Hirsutella rhossiliensisas affected by stage of the soybean cyst nematode .Biological Control,47(2): 244-249)。根内益生菌印度梨形抱（Piriform osporaindica)能够降低大豆孢囊线虫卵的密度（Bajaj R.，Hu W.，Huang Y.et al. 2015. The beneficial root endophyte Piriform osporaindica reduces egg density of the soybean cyst nematode .Biological Control ,90:193-199·)。镜刀菌发 酵原液能够抑制孢囊孵化并且有极强的杀线虫活性，处理lh线虫死亡率高达90% (赵晓晖， 许艳丽.2011.镰刀菌发酵液对大豆孢囊线虫的抑制作用.大豆科学，30(3): 468-470.)。然 而，被开发成防治线虫的生防制剂很少。因此，本发明以大豆孢囊线虫为靶标，从真菌代谢 产物中寻找具有高效杀线虫活性物质，为研究开发新型生物杀线虫剂寻找新的资源。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是选择对孢囊线虫具高杀线虫活性的真菌菌株，将菌株按常规液体 发酵液培养后，除去菌体，从代谢产物中提取具有杀线虫活性物质的有效成分，开发杀线虫 生物农药。
[0006] 本发明筛选到的一株具有杀线虫活性的真菌菌株是Penicil lium oxali cum NBC008,保藏编号为CGMCC No.12473。
[0007] 一种真菌发酵液，其特征在于：上述真菌菌株经液体发酵培养制成，其pH为4.1-4.4〇
[0008] 所述液体发酵所用的培养基为含氯霉素的马铃薯液体发酵培养基，其pH为5.4-5 · 8〇
[0009] 真菌发酵液的制备方法，此方法具体为:将直径为lcm含上述真菌菌株的菌饼接种 到马铃薯液体发酵培养基内，26°C黑暗条件下150rpm/min培养120h，除去菌体后而得到。
[0010] 所述除去菌体采用4层灭菌纱过滤，滤液再经0.22μπι细菌过滤器，收集滤过液体。
[0011] 上述真菌菌株在植物寄生线虫生物防治中的应用。
[0012] 所述应用是将真菌菌株制备成真菌发酵液喷洒或浇灌感染植物寄生线虫的作物。
[0013] 所述植物寄生线虫为孢囊线虫(Heterodera spp.)。
[0014] 本发明通过研究发现，从挪威东福尔郡小麦孢囊线虫群体上分离的绝大多数菌株 都具有一定的杀线虫活性，从这些菌株中筛选出一株活性较高的真菌菌株P.oxalicum NBC008进行了进一步的研究。
[0015] 本发明还涉及用于防治植物寄生线虫的真菌发酵液，其是由本发明的真菌菌株 P. oxalicum NBC008经过常规液体发酵培养后制备的。
[0016] 本发明的菌株P.oxalicum NBC008是通过平板培养来制备后，再经扩大发酵培养 来制备。
[0017] 其具体方法如下：
[0018] 1.平板培养
[0019] 培养基为马铃薯琼脂培养基(PDA)，购自青岛海博生物技术有限公司，其配方为马 铃薯浸粉6.0g，葡萄糖20.0g，琼脂20.0g，水1000ml，pH值5.4-5.8。
[0020] 2.液体发酵培养
[0021]其中液体培养基为马铃薯液体培养基(PDB)，购自青岛海博生物技术有限公司，其 配方为：马铃薯浸出粉6.0g，葡萄糖20.0g，氯霉素0.1 g，水1000ml，pH为5.4-5.8。从培养皿 上取直径为lcm的真菌菌饼接种到250ml锥形瓶（内装PDB 100ml)中，26°C黑暗条件下 150rpm/min 振荡培养 120h。
[0022]本发明所涉及的菌株P.oxalicum NBC008发酵液具有杀线虫活性物质，可用于植 物寄生线虫的防治，特别是孢囊线虫。
[0023]生物保藏信息：
[0024] 草酸青霉NBC008，分类名为草酸青霉(penicillium oxalicum)
[0025] 保藏号：CGMCC No .12473。
[0026] 保藏日期:2016年5月17日
[0027]保藏单位:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
[0028] 保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编 100101
【具体实施方式】
[0029] 为了更详细地阐明而不是限制本发明，给出了下列实施例。
[0030] 本发明通过研究发现，从小麦孢囊线虫群体上分离的P.oxalicum NBC008具有较 好的杀线虫活性，PDA培养基26°C培养一周后，菌落呈椭圆形，长轴40-45mm，短轴30-35mm， 生长初期菌落表面呈粉色，后期变成绿色。显微镜下观察，分生孢子梗长，柱状，顶端生排列 成扫帚状的间枝，分生孢子卵圆形，绿色。PDB发酵培养，发酵液呈酸性，pH在4.1-4.4之间。
[0031] 生物保藏信息：保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号 为CGMCC No.12473。
[0032] 本发明的菌株P.oxalicum NBC008是通过平板培养来制备后，再经扩大发酵培养 来制备发酵液。
[0033] 实施例1:菌株P.oxalicum NBC008发酵液的制备
[0034] 将菌株P.oxalicum NBC008菌丝体接种到TOA平板上，26°C培养10天，用灭菌打孔 器从平板上取直径为lcm的菌饼接种到250ml锥形瓶（内装100ml PDB)，26°C黑暗条件下 150rpm/min，振荡培养120h。用4层灭菌纱布除去菌丝体后过0.22μπι细菌过滤器除菌，得到 发酵原液。将发酵原液稀释不同倍数进行杀线虫药效测定。
[0035] 实施例2:菌株P.oxalicum NBC008的杀线虫活性
[0036]在发酵液原液的基础上依次稀释1 X，5X，10 X，对大豆孢囊线虫2龄幼虫进行测 定。
[0037] 1制备试验用药剂
[0038]按前述液体发酵方法制备的真菌菌株P.oxalicum NBC008发酵液，用不同稀释倍 数的发酵液进行杀线虫活性测定。
[0039] 2制备试验用线虫
[0040] 2.1大豆孢囊线虫孢囊的收集
[0041]将从农科院廊坊中试基地采集的大豆孢囊线虫危害的病土倒入一干净塑料小桶 内，用强水流将病土冲散后，过20目/80目网筛，收集80目网筛上的沉积物，在解剖镜下挑取 孢囊。
[0042] 2.2大豆孢囊线虫2龄幼虫的制备
[0043] 孢囊经0.5%次氯酸钠消毒3min，灭菌双蒸水洗净后，置于一干净的100目网筛上， 将网筛置于一灭菌培养皿内，向皿内加3mmol/L氯化锌至没过孢囊，26°C黑暗条件下孵化。3 天后开始收集2龄幼虫，并制成浓度为200头/ml的2龄幼虫悬浮液。
[0044] 2.3大豆孢囊线虫卵悬浮液的制备
[0045] 孢囊经0.5 %次氯酸钠消毒3min，灭菌双蒸水洗净后，用软木塞磨破孢囊，制成卵 悬浮液
[0046] 3.试验方法
[0047] 3.1 菌株P.oxalicum NBC008的杀线虫活性
[0048]向24孔板中加入不同稀释倍数的发酵液0.5ml，稀释同样倍数的PDB作为对照，再 加入0.5ml 2龄幼虫悬浮液，则最终稀释浓度分别为2 X，10 X，20 X。室温放置24h后统计线 虫死亡数，并计算死亡率和校正死亡率。每个处理重复4次，该试验重复2次。
[0049] 死亡率（％ )=死亡线虫/供试线虫X 100%
[0050] 校正死亡率（％) = (处理线虫死亡率-对照线虫死亡率)/(1-对照线虫死亡率）X 100%
[0051 ] 3.2菌株P.oxalicum NBC008对大豆孢囊线虫卵孵化的作用
[0052] 取不同浓度的发酵液100μ 1置于96孔板中，100μ 1灭菌水作为对照，再向其中加入 100μ1卵悬浮液(约50个），26 °C黑暗条件下孵化，12天后统计孵化的线虫数，并计算孵化率。 每个处理重复4次。
[0053] 孵化率（％ )=孵化的卵个数/卵总个数X 100%
[0054] 孵化抑制率（％ )=(处理组孵化率-对照组孵化率)/对照组孵化率X 100%
[0055] 4试验结果
[0056] (l)P.oxalicum NBC008代谢物对大豆孢囊线虫2龄幼虫的杀线虫效果
[0057]结果表明，菌株P.oxalicum NBC008不同稀释倍数发酵液都有较高的活性。其2X 稀释液的校正死亡率能够达到90%以上，10 X稀释液在50%左右，具有$父尚的杀线虫活性。
[0058] 表1草酸青霉发酵液不同稀释倍数对小麦孢囊线虫2龄幼虫的影响
[0059]
[0060] 注：CK1 为稀释 2 X PDB，CK2 为稀释 10 X PDB，CK3 为稀释 20 X PDB;
[0061]值为平均值土标准误，字母为差异显著性分析结果，下表同。
[0062] (2)P.oxalicum NBC008代谢物对大豆孢囊线虫卵孵化的作用
[0063] 结果表明，经不同浓度发酵液处理的卵孵化率均显著低于对照组，说明NBC008发 酵液对大豆孢囊线虫卵孵化均有抑制作用，且不同浓度的抑制作用差异不显著。
[0064] 表2.草酸青霉NBC008不同浓度发酵液对大豆孢囊线虫卵孵化的影响
[0065]
[0066]注:CK为灭菌水对照，字母为差异显著性分析结果。
[0067] 实施例3:菌株P.oxalicum NBC008发酵液室内防治效果测定
[0068]利用发酵原液防治大豆孢囊线虫和小麦孢囊线虫，效果如下：
[0069] 1供试材料：
[0070] 大豆品种：中黄13
[0071] 线虫:大豆孢囊线虫
[0072] 2试验方法：
[0073]菌株P.oxalicum NBC008发酵液室内防治大豆孢囊线虫的效果测定 [0074]大豆种子表面用1 %次氯酸钠消毒，灭菌水清洗三遍后，置于一次性培养皿中发 芽。2天后将发芽的种子种在装有灭菌土的塑料杯中，每杯3颗种子。一周后，向塑料杯中加 入真菌发酵原液20ml，PDB作为对照。经发酵原液处理24h后，在大豆根附近接种SCN二龄幼 虫，300条/株，两天后第二次接种SCN二龄幼虫300条/株，接种30天后，统计每杯根系土壤中 的孢囊数量。
[0075] 3试验结果
[0076] 结果表明：菌株P.oxalicum NBC008发酵原液处理后接种线虫，形成的大豆孢囊数 量显著低于对照组，孢囊减少率为59.88%，具有应用前景。
[0077] 表3.菌株P.oxalicum NBC008发酵原液防治大豆孢囊线虫的效果测定
[0078]
[0079]注:CK为液体发酵用培养基TOB。
【主权项】
1. 一株具有杀线虫活性的真菌菌株，命名为Penicillium oxalicum NBC008,保藏编号 为CGMCC No.12473。2. -种真菌发酵液，其特征在于：由权利要求1所述的真菌菌株经液体发酵培养制成， 发酵液pH为4.1-4.4。3. 根据权利要求1所述的真菌发酵液，所述液体发酵所用的培养基为含氯霉素的马铃 薯液体发酵培养基，液体发酵培养基的pH为5.4-5.8。4. 权利要求2或3所述的真菌发酵液的制备方法，其特征在于:将直径为lcm的含有权利 要求1所述真菌菌株的菌饼接种到马铃薯液体发酵培养基内，26°C黑暗条件下150rpm/min 培养120h，除去菌体后而得到。5. 根据权利要求4所述的制备方法，所述除去菌体采用4层灭菌纱过滤，滤液再经0.22μ m细菌过滤器，收集滤过液体。6. 权利要求1所述的真菌菌株在植物寄生线虫生物防治中的应用。7. 根据权利要求6所述的应用，是将权利要求1所述的真菌菌株制备成真菌发酵液喷洒 或浇灌感染植物寄生线虫的作物。8. 根据权利要求6所述的应用，所述植物寄生线虫为孢囊线虫(Heterodera spp.)。
【文档编号】C12N1/20GK106085911SQ201610486282
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年6月28日
【发明人】彭德良, 李婷, 黄文坤, 孔令安, 彭焕, 崔江宽
【申请人】中国农业科学院植物保护研究所