用于海南鲤种质鉴定的sine介导的indel标记的制作方法
【专利摘要】本发明公开了鲤鱼反转录转座子标记，包括鲤鱼反转录转座子序列的预测，鉴定；筛选并开发了以SINE元件介导的INDEL标记。本发明可应用于海南鲤的种质鉴定。
【专利说明】
用于海南鲤种质鉴定的SI NE介导的INDEL标记
技术领域
[0001] 本发明涉及一种分子标记技术，具体涉及评估海南鲤的种质鉴定的以SINE元件介 导的INDEL标记。
【背景技术】
[0002] 鲤鱼（Cyprinus Carpio)是我国最主要的淡水养殖品种之一，在我国培育有近千 年的历史，通过多年的人工培育，已培育成多个品系，但是对不同品系的鲤鱼如何进行有效 的种质区分，对于保护和鉴定鲤鱼种质资源是非常必要的。第四纪冰期冷暖交替后，我国形 成了许多地理隔离的种群。海南岛是在第四纪时期，由于地壳断裂才与大陆分离形成了独 立的半岛，半岛上的内陆湖泊河流与大陆板块的河流形成了地理隔离，独立进化。关于海南 鲤鱼的种群研究，并未找到合适的分子标记，能够显示出岛内的鲤鱼地理种群是否独立进 化成亚种。
[0003] SINE是一种段散在重复序列，是近年来新开发的短分子标记，因在基因组中广泛 分布，鉴定效率高等优点而被广泛使用。SINE能用作种质鉴定研究的标记，是因为它们不可 逆的插入到基因的新位置，并且这个过程是随机独立发生的。因为目前还没有固定的SINE 座位丢失掉(被剪除）的报道，并且两个基因组中两个SINE精确的插入到基因组的同一个座 位或者从同一座位被移除掉的可能性极小，因此，两个不同物种基因组中共有同一个SINE 座位可以作为一种单向的标记，它可以用来定义一个支系或者单系类群。根据共同离征，共 有或者起源性状来构建系统发育关系。目前，SINE技术仅在植物中常见，但在鱼类中研究很 少。目前能够用于快速检测鲤鱼种质特异性的引物较少，常用的微卫星和AFLP存在着特异 性标记少，而SNP标记则存在检测麻烦等问题。
【发明内容】
[0004] 本发明所要解决的技术问题在于:开发鲤鱼SINE标记，提供种质特异性引物，建立 鲤鱼以SINE元件介导的INDEL标记的开发体系，为鲤鱼的遗传背景分析提供更多新的分子 标记，提尚种质资源鉴定的效率。
[0005] 本发明所要解决技术问题的技术方案:通过454高通量测序仪对鲤鱼所获得的序 列，进行长片段拼接，利用生物信息学的方法鉴定SINE序列，筛选出以SINE元件介导的 INDEL引物，并对鲤鱼的INDEL位点进行遗传多态性检测，开发出1个海南种质特异的以SINE 元件介导的INDEL标记，SLl，其核苷酸序列为SEQ ID NO: 1。
[0006] 鲤鱼以SINE元件介导的INDEL标记的SLl的引物序列为：
[0007] SLl-F:AACGACGACACATGGACATCAAGGAACC
[0008] SLl-R:GTTCAGTCGGTCAGTATTGGA
[0009] 利用该引物扩增鲤鱼海南地里种群和我国其他水系，发现该标记在鲤鱼的海南地 理种群为INDEL标记，而在其他水系的基因组中具有扩增稳定，标记特异性显著等优点，该 标记能够对鲤鱼的海南地理种群的种质特异性进行有效评估，因此将该引物开发成试剂 盒，用于检测鲤鱼的海南地理种群的的种质鉴定研究。
[0010] 本申请涉及如下技术方案：
[0011] 1.从鲤鱼基因组序列，挖掘鲤鱼反转录转座子SINE序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所述。
[0012] SEQ ID NO:1
[0013] AACGACGACACATGGACATCAAGGAACCATCTGCCTTTAAAGCACCATAATGTTTGGTTTATGCTTGAC AGCTCACACAAACATGAGAGTGTGGATGAGCAGATGCACTTCTAAGCCGCAAGCTTTCAGAAGAACTAAAGCACGAC GTTGTAAAAGCACTGTTGGATCTTCTGTTATTTGGTTGATCAGTTGTTTCTGTTATTAAACATCTTGCACTGTTATT ATGTCTTGTTCCTGTGGCTCAGTGGTAGAGCATTGCATTAGCAGCGCAAAAGGTCATGGGTTCAATTCCCAGGGAAC ACACATACTGGTAAAAAAAAATGTGTAGCCTGAATGCACTGTAAGTCGCTTTGGATAAAAGCGTCTGCTAAATGCAT AAATGTAAATGTTATTAAAATTCGGTCTAATAATGGTTGCTAAATGTGAATTCAGGCATCACAACCTTAAAATGCAC ATTATTCATTTTGAGATAAGCTAAAGATTACATTTTAAAGTCTTACTAAATAATAAGTGTATTAAAGATTCTACATT TGGAAAAATCTAAATATGAAAATATAGGAAACAAGCACACAGTTACATATATCCAATACTGACCGACTGAAC [0014] 2.根据鲤鱼的SINE序列，开发反转录转座子SINE标记的引物SLl，其引物序列为：
[0015] SLl-F:AACGACGACACATGGACATCAAGGAACC；
[0016] SLl-R:GTTCAGTCGGTCAGTATTGGA。
[0017] 3.利用该引物扩增黑龙江鲤、长江鲤、海南鲤、月亮湖鲤、俄罗斯鲤五种鲤，共130 个DNA样本，该引物除了在海南鲤群体，没有阳性扩增外，在其他群体的603bp上均产生阳性 扩增。
[0018] 4.避开变异位点，重新设计引物，该序列在5个地理种群中均得到有效的扩增。从 每个群体中选择10个个体，共50个个体，进行测序，分析该SINE序列在5个群体的遗传多样 性。
【附图说明】
[0019]图1 : 5个地理种群的S INE介导的INDEL标记的遗传多样性电泳图。左1 : DL2000Marker;左2-3 :黑龙江鲤;4-5 :长江鲤;6-7:海南鲤;8-9:月亮湖鲤；10-11:俄罗斯 鲤。
[0020] 图2:5个地理种群SINE的单倍型序列
【具体实施方式】
[0021] 1鲤鱼SINE序列的获得
[0022] 利用454高通量测序仪对鲤鱼基因组进行测序，获得0.0 lX覆盖，测序深度为1。 [0023] 鲤鱼SINE序列的鉴定流程：
[0024] 从鲤鱼基因组中的片段序列中，鉴定转座子分类
[0025] 利用Repeat masker软件的RepeatModeler
[0026] (http: //www · repeatmasker · org/RepeatModeler · html)，进行denovo的重复序列 鉴定，通过与斑马鱼基因组比对，挖掘鲤鱼基因组内的SINE元件。
[0027] 在基因组内部得到所有SINE序列，通过分类整理成不同的亚家族类别，针对不同 亚家族内部拷贝序列进行分析，找寻SINE拷贝多，序列之间极度相似的分支群。对于候选的 分支群，两端各延长600bp。
[0028] 2基因组提取
[0029] 利用QIAGEN基因组试剂盒提取黑龙江鲤(HLJ)、长江鲤(CJ)、海南鲤(HN)、月亮湖 鲤(YLH)、俄罗斯鲤(RUS)的基因组DNA。除俄罗斯鲤仅收集到10份样品外，其余每个地理种 群各采样30尾，共130个样品。
[0030] 3多态性引物设计
[0031] SINE引物从SIEN保守区域设计Pl:
[0032] SLl-F:AACGACGACACATGGACATCAAGGAACC；
[0033] SLl-R:GTTCAGTCGGTCAGTATTGGA。
[0034] 4 REMAP分子标记PCR反应技术体系的建立
[0035] 利用得到的引物进行PCR扩增。扩增反应体系为25uL:基因组DNA40ng，2.5mmol/ LMgC12 I · 5uL，dNTps2 · OuL，10XBuffer2 · 5uL，TaqDNA聚合酶I · 5U，lOumol/L SLl-F引物 I · OuL，lOumol/L SLl-R引物I · OuL，加 ddH20至25uL。反应程序：4°C预变性4min; 94°C变性 lmin，57°C退火lmin，72°C延伸lmin30s，共30个循环；72°C延伸1〇111丨11。？0?产物用3%〇琼脂 糖凝胶分离。
[0036] 5 INDEL引物检测
[0037] 该引物在黑龙江鲤、长江鲤、月亮湖鲤和俄罗斯鲤鲤鱼基因组中只有唯一扩增清 楚的扩增产物，扩增片段为603bp，但在海南鲤无扩增产物，图1。
[0038] 6 INDEL位点确认及其序列遗传多样性分析
[0039] 改变引物位置，重新设计引物Tl，该序列在5个地理种群中均得到有效的扩增。从 每个群体中选择10个个体，共50个个体，进行测序，分析该SINE序列在5个群体的遗传多样 性。
[0040] Tl-F:AACGACGACACATGGACATCAA；
[0041 ] Tl-R:GTTCAGTCGGTCAGTATTGGA。
[0042] 该序列在50个个体成功扩增出并进行测序，为603bp，经多重序列比对分析表明， 共有68个变异位点，其中含有简约信息位点55个，变异率为11.03%。平均碱基含量分别为： T 29.4%，C 17.4%，A 34.3%，G 19.0%。在5个群体中，共发现6个单倍型（表1，SEQ2)，黑 龙江鲤、长江鲤、月亮湖鲤、俄罗斯鲤共享4个，海南鲤有2个特有单倍型。所有样本间平均序 列分歧距离Da为0.1282。5个地理种群的遗传多样性和遗传距离见表2和表3。
[0043] 衷1单倍塑在5个地理种群中的分布
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[0047]表3 SINE序列的遗传参数.N:群体数量;η:单倍型数量;π:核酸多态性;h~单倍型 多样性。
[0049]本发明开发出了一段特异序列能够鉴定海南鲤的种质特异性，且该发明将该特异 序列转化为这个特异等位基因，降低了检测难度，减少了检测成本，为鲤鱼的种质鉴定的工 厂化奠定了研究基础。
【主权项】
1. 鲤鱼反转录转座子SINE标记，其特征在于:所述的SINE标记CS1，其核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所述。2. 权利要求1所述的鲤鱼反转录转座子SINE标记的引物，其特征在于:其为 SL1-F:AACGACGACACATGGACATCAAGGAACC SL1-R:GTTCAGTCGGTCAGTATTGGA 〇3. -种试剂盒，其包含权利要求2所述的引物。4. 权利要求1所述的标记或权利要求2所述的引物或权利要求3所述的试剂盒在区分海 南鲤的种质特异性方面的用途。
【文档编号】C12Q1/68GK106086191SQ201610474817
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年6月24日
【发明人】张研, 彭文竹, 徐鹏, 赵紫霞, 吴静, 王书
【申请人】中国水产科学研究院