金黄色葡萄球菌的pcr检测引物、试剂盒及检测方法
【专利摘要】本发明公开了金黄色葡萄球菌的PCR检测引物、试剂盒及检测方法。本发明通过组合利用金黄色葡萄球菌的耐热核酸酶基因(nuc基因)、纤维蛋白原结合蛋白基因(clf A基因)和特异性序列(SmaI序列)，针对其设计特异性引物，开发了金黄色葡萄球菌的多重PCR检测引物、试剂盒及检测方法；达到了检测特异性强、灵敏度高的技术效果，并且检测耗时短、操作简便，可大大提高检测效率，适合快速检测的要求，可应用于实际生产工作中。
【专利说明】
金黄色葡萄球菌的PCR检测引物、试剂盒及检测方法
技术领域
[0001] 本发明属于微生物检测领域，具体涉及金黄色葡萄球菌的PCR检测引物、试剂盒及 检测方法。
【背景技术】
[0002] 随着人类生活水平的提高，化妆品已逐渐成为人们生活必需品，化妆品中各种营 养元素给微生物提供了良好的生存环境，一旦化妆品中污染微生物，势必会危害人们的身 体健康，尤其是金黄色葡萄球菌的污染，金黄色葡萄球菌是葡萄球菌属中对人类致病力最 强的一种，能引起人体局部化脓性病灶，严重时可导致败血症，其不仅可以感染呼吸道，毒 害消化道，还会钻进皮肤里诱发皮炎，因此，我国《化妆品卫生规范》(2007版）中将金黄色葡 萄球菌列为化妆品常规检测项目，要求不得检出。
[0003] 在检测手段上，目前国内外检测机构仍主要采用传统的方法对金黄色葡萄球菌进 行检测，整个过程一般需要3~5d，且操作烦琐，已不能满足微生物快速准确检测的现实需 要。因此，迫切需要建立新的快速检测技术和方法。PCR技术以敏感、特异、简便和快速等优 点被越来越多地应用，而多重PCR方法以准确、高效的特点广受研究者关注。迄今，已有文献 介绍采用多重PCR方法检测食品中金黄色葡萄球菌的污染。然而，这些方法大多侧重于耐药 性相关基因和毒素基因，并较少应用于化妆品样品的检测。因此，建立适合于化妆品中特异 性强且灵敏度高的多重PCR检测方法显得尤为重要。
【发明内容】
[0004] 本发明利用金黄色葡萄球菌的特异性鉴别基因及序列，设计了其特异性引物，采 用多重PCR技术对金黄色葡萄球菌进行快速检测。通过对PCR检测体系的优化，开发了针对 化妆品中金黄色葡萄球菌PCR检测试剂盒;同时，结合前处理技术，建立了准确、高效的检测 方法。
[0005] 首先，本发明提供了一种用于检测金黄色葡萄球菌的PCR检测引物，所述的PCR检 测引物包括一个或两个以上如下所示的引物对：
[0006] 耐热核酸酶基因(nuc基因）扩增用引物对：
[0007] nuc-F:5'-GGGATGGCTATCAGTAA-3'（如SEQ ID N0.1所示），
[0008] nuc-R:5'-TGAATCAGCGTTGTCTT-3'（如SEQ ID 从).2所示）；
[0009] 纤维蛋白原结合蛋白基因 （clf A基因）扩增用引物对：
[0010] clf A-F:5'-CAACTACGGAAGAAACGC-3'（如SEQ ID N0.3所示），
[0011] clf A-R:5'-CTACTGCCGCTAAACTAA-3'（如SEQ ID N0.4所示）；
[0012] 金黄色葡萄球菌特异性序列(SmaI序列)扩增用引物对：
[0013] SmaI-F:5'-GAAGCACATAAGATAGCGAGAC-3'（如SEQ ID 从).5所示），
[0014] SmaI-R:5'-ATCCAGCATCAGATACGAG-3'0nSEQIDNO.6m*)。
[0015] 其次，本发明提供了一种用于检测金黄色葡萄球菌的PCR检测试剂盒，所述的PCR 检测试剂盒包含所述的PCR检测引物。
[0016] 所述的PCR检测试剂盒还包括含Mg2+的PCR反应缓冲液、dNTP和Taq DNA聚合酶。
[0017] 本发明还提供所述的PCR检测引物或PCR检测试剂盒在检测金黄色葡萄球菌中的 应用。
[0018] 进一步的，所述的PCR检测引物或PCR检测试剂盒在检测化妆品中金黄色葡萄球菌 中的应用。
[0019] 本发明还提供一种化妆品中金黄色葡萄球菌的检测方法，包括以下步骤：
[0020] a)取待检测的化妆品样品进行金黄色葡萄球菌富集培养，然后提取细菌总DNA;
[0021] b)以步骤a)中提取的细菌总DNA为模板，利用所述的PCR检测引物进行PCR扩增；
[0022] c)检测PCR扩增产物，分析化妆品样品中是否存在金黄色葡萄球菌。
[0023]优选，所述的步骤a)的富集培养是利用SCDLP增菌液进行富集培养，所述的SCDLP 增菌液每升含有蛋白胨20g、牛肉膏3g、NaCl 5g、葡萄糖2.5g、组氨酸5g、硫乙醇酸钠 lg、卵 磷脂2g和吐温-80 IOg，余量为蒸馏水，pH7.2~7.3。
[0024]优选，所述的步骤b)的PCR扩增的反应体系为:浓度为IpgAiL~IOOngAiL的DNA模 板IyL、含Mg2+的10 X缓冲溶液IOmM、dNTP 0.2mM、Taq DNA聚合酶1.0 U、所述的PCR检测引物 中的引物对的上下游引物各〇 . 5μΜ，加 CldH2O至总体积为25yL;所述的PCR扩增的反应条件 为:95°C 预变性 5min;94°C 变性 5〇8、48°(：退火4〇8、72°(：延伸11^113〇8，进行30个循环；72°(：延 伸lOmin。
[0025] 本发明所建立的针对化妆品中金黄色葡萄球菌的多重PCR检测引物和PCR检测试 剂盒及检测方法通过组合金黄色葡萄球菌耐热核酸酶基因（nuc基因）、纤维蛋白原结合蛋 白基因 （clf A基因）和金黄色葡萄球菌特异性序列（SmaI序列）作为目标基因或序列，具有 检测特异性强、灵敏度高、没有引物二聚体形成等优势，三对引物扩增金黄色葡萄球菌DNA 的灵敏度均为1.35pg/yL。
[0026] 本发明提供的针对化妆品中金黄色葡萄球菌的多重PCR检测方法还具备检测操作 简单、耗时短、设备要求低等特点，与传统检测方法相比可大大节省检测成本和时间，提高 检测的效率和准确性，具有广泛的市场应用前景，同时本发明的检测方法中在SCDLP增菌液 的配方中加入了组氨酸、巯基乙醇酸钠，能更有效的中和化妆品中的防腐剂，缩短增菌时 间。
【附图说明】
[0027]图1是金黄色葡萄球菌单重PCR扩增结果，其中，M代表DNA marker，1-3是采用nuc 基因扩增用引物对分别对金黄色葡萄球菌ATCC6538、金黄色葡萄球菌ATCC6538P和金黄色 葡萄球菌CMCC26003的总DNA进行扩增的结果，4-6是采用SmaI序列扩增用引物对分别对金 黄色葡萄球菌ATCC6538、金黄色葡萄球菌ATCC6538P和金黄色葡萄球菌CMCC26003的总DNA 进行扩增的结果，7-9是采用clf A基因扩增用引物对分别对金黄色葡萄球菌ATCC6538、金 黄色葡萄球菌ATCC6538P和金黄色葡萄球菌CMCC26003的总DNA进行扩增的结果。
[0028]图2是nuc基因扩增用引物对PCR扩增污染菌株结果，其中，M代表DNA marker，l代 表大肠杆菌Escherichia coli，2代表铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa，3代表沃氏 葡萄球菌Staphylococcus warneri，4代表腐生葡萄球菌Staphylococcus saprophytics，5 代表弗氏朽1檬酸杆菌Citrobacter freundii，6代表恶臭假单胞菌Pseudomonas putida，7 代表肺炎克雷伯氏菌Klebsiella pneumoniae，8代表粘质沙雷氏菌Serratia marcescens。
[0029] 图3是SmaI序列扩增用引物对PCR扩增污染菌株结果，其中M代表DNA marker，1-8 代表的污染菌株样品同图2。
[0030] 图4是clf A基因扩增用引物对PCR扩增污染菌株结果，其中M代表DNA marker，1-8 代表的污染菌株样品同图2。
[0031] 图5是nuc基因扩增用引物对灵敏度扩增结果，其中，M代表DNA marker，1-7依次分 别代表浓度为 134 · 82ng/yL、13 · 48ng/yL、1 · 35ng/yL、134 · 82pg/yL、13 · 48pg/yL、1 · 35pg/yL 和0.13pg/yL的DNA模板，8代表阳性对照，9代表阴性对照。
[0032]图6是clf A基因扩增用引物对灵敏度扩增结果，其中，M代表DNA marker，1-9代表 的扩增样品同图5。
[0033]图7是SmaI序列扩增用引物对灵敏度扩增结果，其中，M代表DNA marker，1-9代表 的扩增样品同图5。
[0034]图8是金黄色葡萄球菌多重PCR灵敏度扩增结果，其中，M代表DNA marker，1-9代表 的扩增样品同图5。
[0035]图9是实施例2检测的化妆品中金黄色葡萄球菌多重PCR扩增结果，其中，M代表DNA marker，1代表保湿乳，2代表化妆水，3代表面霜，4代表洁面膏，5代表爽肤水，6代表粉底液， 7代表阳性对照，8代表阴性对照。
【具体实施方式】
[0036]以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
[0037] 实施例1:用于检测金黄色葡萄球菌的多重PCR引物的筛选和确定
[0038] 1、引物设计
[0039] 通过查阅相关参考文献筛选用于检测金黄色葡萄球菌的候选检测目标基因或序 列，然后对其核苷酸序列进行生物信息学分析，经过分析，本研究选择了耐热核酸酶基因 (nuc基因）、纤维蛋白原结合蛋白基因 （clf A基因）和特异性序列(SmaI序列)作为特异性检 测目标序列。
[0040] 分别对上述的检测目标序列设计引物，然后通过实验验证，筛选出了特异性高的3 对引物如下：
[0041] 耐热核酸酶基因(nuc基因）扩增用引物对：
[0042] nuc-F:5，-GGGATGGCTATCAGTAA-3,（如SEQ ID N0.1所示），
[0043] nuc-R:5，-TGAATCAGCGTTGTCTT-3,（如SEQ ID 从).2所示）；
[0044] 纤维蛋白原结合蛋白基因 （clf A基因）扩增用引物对：
[0045] clf A-F:5'-CAACTACGGAAGAAACGC-3'（如SEQ ID N0.3所示），
[0046] clf A-R:5，-CTACTGCCGCTAAACTAA-3,（如SEQ ID N0.4所示）；
[0047] 金黄色葡萄球菌特异性序列(SmaI序列)扩增用引物对：
[0048] SmaI-F:5，-GAAGCACATAAGATAGCGAGAC-3,（如SEQ ID 从).5所示），
[0049] SmaI-R:5'-ATCCAGCATCAGATACGAG-3'0nSEQIDNO.6m*)。
[0050] 2、单重PCR特异性实验
[0051]分别采用合成好的金黄色葡萄球菌耐热核酸酶基因（nuc基因）扩增用引物对、特 异性序列(SmaI序列)扩增用引物对和纤维蛋白原结合蛋白基因 （clf A基因）扩增用引物对 分别对金黄色葡萄球菌ATCC6538、金黄色葡萄球菌ATCC6538P和金黄色葡萄球菌CMCC26003 的总DNA进行单重PCR扩增，结果表明，用nuc基因扩增用引物对分别扩增上述3种金黄色葡 萄球菌总DNA均得到618bp的特异性片段，用SmaI序列扩增用引物对分别扩增上述3种金黄 色葡萄球菌总DNA均得到822bp的特异性片段，用clf A基因扩增用引物对分别扩增上述3种 金黄色葡萄球菌总DNA均得到348bp的特异性片段，结果扩增片段大小与预期一致（图1 )，分 别用上述三对引物扩增从污染化妆品中分离出的8株污染菌株(大肠杆菌、铜绿假单胞菌、 沃氏葡萄球菌、腐生葡萄球菌、弗氏柠檬酸杆菌、恶臭假单胞菌、肺炎克雷伯氏菌、粘质沙雷 氏菌)的细菌总DNA，结果均未扩增出条带（图2-4)，说明上述三对引物对金黄色葡萄球菌有 良好的检测特异性和准确性。
[0052] 3、单重和多重PCR检测灵敏度实验
[0053]以不同浓度的金黄色葡萄球菌ATCC6538DNA模板对上述三对引物的单重和多重 PCR检测灵敏度进行测试，其中金黄色葡萄球菌ATCC6538DNA模板浓度分别为134.82ngAiL、 13 · 48ng/yL、1 · 35ng/yL、134 · 82pg/yL、13 · 48pg/yL、1 · 35pg/yL和 0 · 13pg/yL，结果采用耐热 核酸酶基因 (nuc基因）、纤维蛋白原结合蛋白基因 （clf A基因）和特异性序列(SmaI序列)扩 增用引物对扩增的灵敏度均为1.35pgAxL(图5-7)，采用上述三对引物同时扩增上述不同浓 度金黄色葡萄球菌ATCC6538DNA模板，多重PCR检测灵敏度也为1.35pg/yL(图8)。
[0054]实施例2:化妆品中金黄色葡萄球菌的检测
[0055]某公司送检的六个不同类型化妆品样品，分别为保湿乳、化妆水、面霜、洁面膏、爽 肤水和粉底液，采用《化妆品卫生规范》（2007版）中微生物检测方法进行检测，均未发现微 生物污染，进行人工随机致病菌污染，保湿乳中加入金黄色葡萄球菌ATCC 6538，化妆水中 加入金黄色葡萄球菌ATCC 6538和大肠杆菌ATCC 8039,面霜中加入金黄色葡萄球菌 ATCC6538和铜绿假单胞菌ATCC 9027,洁面膏中加入大肠杆菌ATCC 8039,爽肤水中加入铜 绿假单胞菌ATCC 9027,粉底液中加入大肠杆菌ATCC 8039和铜绿假单胞菌ATCC 9027,控制 加入上述致病菌污染后各样品的菌悬液的终浓度为102cfu/mL，由此制备得到各化妆品的 人工污染样品。
[0056] 进行样品前处理：
[0057] (1)分别取IOg化妆品的人工污染样品，加入90mL S⑶LP增菌液中，充分混匀；阴性 对照为IOOmL S⑶LP增菌液，阳性对照为加入了金黄色葡萄球菌ATCC6538的IOOmL S⑶LP增 菌液(终浓度为102cfu/mL)，各组置于37°C振荡培养箱中150rpm培养6h;
[0058] 所述的SCDLP增菌液的配方为：每升含有蛋白胨20g、牛肉膏3g、NaCl 5g、葡萄糖 2.5g、组氨酸5g、硫乙醇酸钠 lg、卵磷脂2g和吐温-80 10g，余量为蒸馏水，将各组分混合均 匀，调ρΗ7·2~7.3，121°C高压灭菌20min。
[0059] (2)基因组DNA提取:取上述振荡培养后的增菌液各10ml，离心收集菌体，用生理盐 水洗涤3次，采用Magen细菌DNA提取试剂盒提取六个化妆品的人工污染样品、阴性对照和阳 性对照中的细菌基因组DNA，采用BioSpec-nano超微量分光光度计测定浓度，于-20°C保存 备用。
[0060] 采用本发明的多重PCR引物对化妆品的人工污染样品、阴性对照和阳性对照中金 黄色葡萄球菌进行检测，经优化后的多重PCR扩增的反应体系为:浓度为lpg/yL~100ng/yL 的DNA模板IyL，10 X缓冲溶液(含Mg2+) IOmM，dNTP 0.2mM，Taq DNA聚合酶1.0 U，本发明中的 三组引物对各0.5μΜ，加 CldH2O至总体积为25yL;反应条件为：95°C预变性5min; 94°C变性 5〇8、48°(：退火4〇8、72°(：延伸1111丨113〇8，进行30个循环；72°(：延伸1〇11^11。
[00611 PCR产物电泳检测结果：
[0062] 取PCR扩增产物5yL用1 %琼脂糖凝胶（含染色剂Gold view)在120v电压下电泳 30min，然后置于Bio-Red凝胶成像分析系统中观察结果（图9)。
[0063]结果表明，污染有金黄色葡萄球菌的化妆品样品（保湿乳、化妆水、面霜)均能检出 各基因相应条带，而没有加入金黄色葡萄球菌的化妆品样品（洁面膏、爽肤水和粉底液)未 出现条带，说明本发明的金黄色葡萄球菌多重PCR检测引物能快速、准确检测出污染化妆品 中的金黄色葡萄球菌。
【主权项】
1. 一种用于检测金黄色葡萄球菌的PCR检测引物，其特征在于，所述的PCR检测引物包 括一个或两个以上如下所示的引物对： nuc基因扩增用引物对： nuc-F:5 '-GGGATGGCTATCAGTAA-3 '， nuc-R:5，-TGAATCAGCGTTGTCTT-3，； elf A基因扩增用引物对： elf A-F:5 '-CAACTACGGAAGAAACGC-3 '， elf A-R:5 '-CTACTGCCGCTAAACTAA-3 '； Smal序列扩增用引物对： Smal-F:5，-GAAGCACATAAGATAGCGAGAC-3，， Smal-R:5 '-ATCCAGCATCAGATACGAG-3 '。2. -种用于检测金黄色葡萄球菌的PCR检测试剂盒，其特征在于，所述的PCR检测试剂 盒包含权利要求1所述的PCR检测引物。3. 根据权利要求2所述的PCR检测试剂盒，其特征在于，所述的PCR检测试剂盒还包括含 Mg2+的PCR反应缓冲液、dNTP和Taq DNA聚合酶。4. 权利要求1所述的PCR检测引物或权利要求2或3所述的PCR检测试剂盒在检测金黄色 葡萄球菌中的应用。5. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于，是在检测化妆品中金黄色葡萄球菌中的应 用。6. -种化妆品中金黄色葡萄球菌的检测方法，其特征在于，包括以下步骤： a) 取待检测的化妆品样品进行金黄色葡萄球菌富集培养，然后提取细菌总DNA; b) 以步骤a)中提取的细菌总DNA为模板，利用权利要求1所述的PCR检测引物进行PCR扩 增； c) 检测PCR扩增产物，分析化妆品样品中是否存在金黄色葡萄球菌。7. 根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述的步骤a)的富集培养是利用 S⑶LP增菌液进行富集培养，所述的SCDLP增菌液每升含有蛋白胨20g、牛肉膏3g、NaCl 5g、 葡萄糖2.5g、组氨酸5g、硫乙醇酸钠 lg、卵磷脂2g和吐温-80 10g，余量为蒸馏水，pH7.2~ 7.3。8. 根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述的步骤b)的PCR扩增的反应体系 为：浓度为lpg/VL~lOOng/yL的DNA模板lyL、含Mg 2+的 10X 缓冲溶液 10mM、dNTP 0.2mM、Taq DNA聚合酶1.0U、所述的PCR检测引物中的引物对的上下游引物各0.5μΜ，加 ddH20至总体积 为25yL;所述的PCR扩增的反应条件为:95°C预变性5min;94°C变性5〇8、48°(：退火4〇8、72 1€ 延伸lmin30s，进行30个循环；72°C延伸lOmin。
【文档编号】C12Q1/14GK106086218SQ201610688165
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年8月18日 公开号201610688165.1, CN 106086218 A, CN 106086218A, CN 201610688165, CN-A-106086218, CN106086218 A, CN106086218A, CN201610688165, CN201610688165.1
【发明人】文霞, 杨秀茳, 谢小保, 孙廷丽, 李彩玲
【申请人】广东省微生物研究所