同时检测流感病毒h1、h3、h5、h7的试剂盒及方法

同时检测流感病毒h1、h3、h5、h7的试剂盒及方法
【专利摘要】本发明公开了采用荧光定量PCR同时检测流感病毒H1、H3、H5和H7四种亚型的试剂盒和方法，试剂盒中包括对应各流感病毒亚型的特异性引物和探针。本发明提供的试剂盒使用方便，所用的试剂少，检测的特异性强，灵敏度高；检测方法实现了对同一个样本，可进行4种流感病毒分型的检测，大大简化了操作过程，减少了重复操作的过程，节省时间，减轻重复操作消耗的劳动力，并有效节约成本，实现快速筛查。
【技术领域】
[00011本发明属于生物技术检测领域，具体涉及同时检测流感病毒111、!13、!15、!17的试剂 盒及方法。 同时检测流感病毒H1、旧、吧、^的试剂盒及方法
【背景技术】
[0002] 流行性感冒病毒（inf luenza virus)，是正粘病毒科(Orthomyxoviridae)的代表 种，简称流感病毒，包括人流感病毒和动物流感病毒，人流感病毒分为甲（A)、乙（B)、丙(C) 三型，是流行性感冒（流感）的病原体。流行性感冒简称流感，主要是指人群中，由普通流感 病毒引起的一种病毒性急性呼吸道传染病。流感传染性强，传染迅速，会导致每年的流行， 并且历史上每隔几十年会造成流感大流行，在短时间内使很多人患病甚至死亡。对流感疫 情的防控最根本的途径就是早发现、早诊断、早治疗和切断传染源。由此可见，快速灵敏的 流感病毒检测技术成为了保护人民生命健康、防控疫情在国内大范围流行的第一道屏障。
[0003] 现有的快速检测技术主要有两类:第一类为免疫学方法，包括酶联免疫吸附法、免 疫荧光法、同位素标记抗体法、乳胶凝集法、免疫传感器法、免疫扩散法及免疫色谱法等;第 二类是以核酸为基础的分子生物学方法，主要有核酸探针法和聚合酶链反应法 (Polymerase Chain Reaction，PCR)。免疫学方法是以抗原抗体结合来用于检测，检测需要 制备特异性抗原或抗体，制备过程复杂，且需要保持使用的抗原或抗体具有免疫原性活性， 该检测的灵敏度较低，易出现假阴性。
[0004] PCR方法是核酸扩增技术的典型代表，该技术是由美国PE-CetUS公司人类遗传研 究室的Mullin等人于1985年发明的，在过去的二十年里，PCR技术作为分子生物学的核心得 到了迅猛的发展和应用，特别是在疾病的临床检测病毒中，PCR技术以其快速、灵敏和特异 的优势，不仅日益取代了传统的检测方法，而且使以往无法完成的检测成为了可能。
[0005] 多重PCR，是指在同一个PCR反应体系中加入二对以上的引物，同时扩增出多个核 酸片段的PCR反应，具有的优点有高效性、系统性、经济简便性。但因 PCR成功的关键在于设 计出合理的引物，合适的引物是决定PCR扩增特异性和敏感性的关键。而多重PCR对引物的 要求更加严格，如多重PCR的各对引物必须具有相近的退火温度，使得所有的靶位点可以用 相同的PCR程序在单个的反应中得到有效的扩增;而其之间不能形成稳定二聚体和发夹结 构。同时保证了扩增产物的大小能够通过电泳分开。
[0006] 现有一般检测2重、3重病原检测较多，如现有专利公开号CN101895531B，名称为检 测人甲型流感病毒Hl和/或H3亚型的引物，记载了其选取的引物间的序列在理论上可以很 好地区分Hl，H2，H3，H5，H7和H9 (选取的300条序列，全部正确的分到所该分的亚型中），但实 际当中，由于涉及到多重引物设计的条件，易出现引物间交叉反应，易导致假阴性的结果， 或无法区分出这几种分型，目前也仅能检测出H1、H3两种分型。
[0007] 目前还没有针对流感病毒!11、!13、!15、!17四种分型进行多重?0?的检测方法。因多重 PCR对引物设计的要求苛刻，检测的重数越多，限制的条件越多，要达到高灵敏、特异性强的 多重检测也就需要付出越多，不仅需要在前期引物设计或探针设计需要人工分析、经验判 断，还需要上千次及上万次的实验筛选、验证检测结果。

【发明内容】

[0008] 为解决上述技术问题，本发明提供了一组用于同时检测流感病毒流感Hl、H3、H5、 H7四种亚型的核酸。本发明还提供一组用于荧光定量PCR同时检测流感病毒流感Hl、H3、H5、 H7四种亚型的试剂盒及其检测方法。
[0009] 为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
[0010] -组用于多重PCR同时检测流感病毒!11、!13、!15、!17亚型的核酸，包括流感病毒!11的 上、下游引物、流感病毒H3的上、下游引物、流感病毒H5的上、下游引物和流感病毒H7的上、 下游引物；
[0011]其中，所述流感病毒Hl的上游引物序列如SEQ ID No. 1所示，下游引物序列如SEQ ID No.2所示；
[0012] 所述流感病毒H3的上游引物序列如SEQ ID No. 4所示，下游引物序列如SEQ ID No. 5所示；
[0013] 所述流感病毒H5的上游引物序列如SEQ ID No. 7所示，下游引物序列如SEQ ID No. 8所示；
[0014] 所述流感病毒H7的上游引物序列如SEQ ID No. 10所示，下游引物序列如SEQ ID No. 11所示。
[0015] 一组用于荧光定量PCR同时检测流感病毒!11、!13、!15、!17亚型的核酸，包括流感病毒 Hl的上、下游引物和探针、流感病毒H3的上、下游引物和探针、流感病毒H5的上、下游引物和 探针、及流感病毒H7的上、下游引物和探针；
[0016] 所述流感病毒Hl的上游引物序列如SEQ ID No. 1所示，下游引物序列如SEQ ID No.2所示，探针序列如SEQ ID No.3所示；
[0017] 所述流感病毒H3的上游引物序列如SEQ ID No. 4所示，下游引物序列如SEQ ID No.5所示，探针序列如SEQ ID No.6所示；
[0018] 所述流感病毒H5的上游引物序列如SEQ ID No.7所示，下游引物序列如SEQ ID No.8所示，探针序列如SEQ ID No.9所示；
[0019] 所述流感病毒H7的上游引物序列如SEQ ID No. 10所示，下游引物序列如SEQ ID No. 11所示，探针序列如SEQ ID No. 12所示。
[0020] 一种用于同时检测流感病毒111、!13、!15、!17亚型的试剂盒，该试剂盒包括:上述流感 病毒Hl、H3、H5、H7的上、下游引物和相应的探针，各条探针的5'端和3'端分别对S#EFAM-BHQl、Texred-BHQ2、J0E-TAMRA和CY5-BHQ3 〇
[0021] 如上所述的试剂盒，优选地，还包括2 X RT-PCR缓冲液(Buffer)、25 X反转录酶和 Taq聚合酶混合酶（25XRT/Taq mix)。
[0022] 一种用于荧光定量PCR同时检测流感病毒Hl、H3、H5、H7亚型的方法，该方法是非诊 断目的的检测方法，包括以下步骤：
[0023] (1)从样品中提取病毒RNA;
[0024] (2)对所述步骤(1)提取的病毒RNA进行荧光定量PCR扩增;其中，荧光定量PCR扩增 时，在反应体系中，采用流感病毒Hl的上、下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2所示，探针的核苷酸序列如SEQ ID No. 3所示，其5'端和3'端分别对应标记FAM和BHQl; 流感病毒H3的上、下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.4和SEQ ID No.5所示，探针的核苷 酸序列如SEQ ID No.6所示，其5'端和3'端分别对应标记Texred和BHQ2;流感病毒H5上、下 游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示，探针的核苷酸序列如SEQ ID No. 9所示，其Y端和Y端分别对应标记JOE和TAMRA;流感病毒H7上、下游引物的核苷酸序列 如SEQ ID No. 10和SEQ ID No. 11所示，探针的核苷酸序列如SEQ ID No. 12所示，其5'端和 3'端分别对应标记CY5和BHQ3;
[0025] (3)收集荧光信号，选择上述荧光基团的荧光检测模式，基线调整取3~15个循环 的荧光信号，以阈值线刚好超过正常阴性对照的最高点设定阈值线；
[0026] (4)结果判定:待测样品荧光增长曲线超过阈值线，并呈现良好的对数增长，则判 断为阳性，如无典型的扩增曲线，判断为阴性。
[0027] 如上所述的方法，优选地，所述步骤(2)中荧光定量PCR扩增的反应体系具体如下：
[0028] IXRT-PCR Buffer,
[0029] 1XRT/Taq mix,
[0030] 所述流感病毒Hl的上游引物的终浓度为SOnmo I /L，下游引物的终浓度为SOnmo I / L，探针的终浓度为40nmo I /L;所述流感病毒H3的上游引物的终浓度为400nmo I /L，下游引物 终浓度为400nmol/L，探针的终浓度为200nmol/L;所述流感病毒H5的上游引物终浓度为 200nmol/L，下游引物终浓度为200nmol/L，探针的终浓度为lOOnmol/L;所述流感病毒H7上 游引物终浓度为200nmol/L，下游引物终浓度为200nmol/L，探针的终浓度为lOOnmol/L;
[0031] 所述病毒RNA为2yL;
[0032] 同时设置无核酸酶水为阴性对照。
[0033]如上所述的方法，优选地，所述步骤（2)中荧光定量PCR扩增的反应程序为：50 °C 3〇!1^11，951€51^11，然后95°(：1〇8,551€4〇8，在55°(：进行荧光检测，共进行45个循环。
[0034] 如上所述的方法，优选地，所述步骤(4)结果判定中，所述阈值为35,当Ct值<35 时，有明显扩增曲线为阳性结果;Ct值>40时，无明显扩增曲线为阴性结果。
[0035]本发明提供了检测流感病毒H1、H3、H5和H7亚型的核酸组，该组核酸可用于单一病 毒亚型的检测，也可用于几种病毒亚型同步检测的多重扩增使用。用于同步检测这四种流 感病毒亚型时，其检测灵敏度高，特异性强，经过验证，相互之间不发生交叉反应。
[0036] 本发明还提供了，一种用于荧光定量PCR同时检测流感病毒Hl、H3、H5和H7四种亚 型的试剂盒，同时建立了一种比较高效、灵敏的，可同时检查四种亚型的流感病毒，具体为 流感病毒H1、H3、H5和H7亚型的快速检测方法。该方法能有效提高检测的灵敏度，避免假阴 性。提供的检测试剂盒使用方便，操作简便，自动化程度高，有效替代传统病毒分离来获得 检测结果，且试剂盒所用的试剂少，大大简化了操作过程，减少了重复操作的过程，也就减 少了在操作过程的污染，避免重复操作而消耗过多的劳动力，节省时间，有效节约成本，实 现了快速筛查，所用试剂盒的检测效果好，特异性强，灵敏度高。
[0037] 提供的检测方法采用完全闭管操作，操作简单、方便快捷、通过直接探测PCR过程 中荧光信号的变化来获得定量的结果，不需要PCR后处理或电泳检测，克服了常规PCR技术 的易污染、出现假阳性，能有效避免非特异性扩增难题，并且适合大批量样本的检测。
[0038] 被流感病毒感染，一般很难发现和控制，而本发明提供的试剂盒具有较高的检测 灵敏度，且对1个样本的检测可实现对四种亚型流感病毒的排查，且主要是检测待测样本中 是否含有流感病毒Hl、H3、H5和H7亚型的核酸，并不是针对疾病的诊断，该检测属于非诊断 性的检测。但可以有助于提前发现感染流感病毒携带者出现无病症症状的潜伏期及不发病 的隐性感染者，为能及时有效控制流感病毒H1、H3、H5和H7亚型的传播与扩散，提供有效的 技术支持。
【附图说明】
[0039]图1为本发明的方法检测流感病毒Hl亚型灵敏度的扩增曲线。
[0040]图2为本发明的方法检测流感病毒H3亚型灵敏度的扩增曲线。
[00411图3为本发明的方法检测流感病毒H5亚型灵敏度的扩增曲线。
[0042]图4为本发明的方法检测流感病毒H7亚型灵敏度的扩增曲线。
[0043]图5为本发明的方法检测流感病毒Hl亚型的标准曲线。
[0044]图6为本发明的方法检测流感病毒H3亚型的标准曲线。
[0045]图7为本发明的方法检测流感病毒H5亚型的标准曲线。
[0046]图8为本发明的方法检测流感病毒H7亚型的标准曲线。
【具体实施方式】
[0047]以下结合具体实例对本发明做进一步详细说明，并非对本发明的限定，本发明的 实施方式并不限于此，本发明提供的核苷酸序列的互补序列也可实现本发明，如无特殊说 明，所用试剂为常规试剂，因此凡依照本公开内容所作出的本领域的等同替换，均属于本发 明的保护范围。
[0048]实施例1引物、探针的设计
[0049] 首先分别筛选四种流感病毒亚型的特异目标基因，根据检测目的，对每种病毒从 GenBank下载多条病毒基因序列，进行比对分析，选取保守区，采用Array Designer 4 .Osoftware软件辅助设计扩增引物及适合焚光定量PCR反应体系的杂交探针。
[0050] 由于本发明是多重荧光定量，首先探针标记的选择比较关键，其次软件设计出来 的探针要经过筛选，四个基因的探针信号不能相互干扰，这就需要在设计探针时考虑四对 引物和四条探针之间都不能相互干扰。
[0051] 荧光定量PCR检测是在普通PCR检测的基础上，进一步通过特异性的荧光探针，该 探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告焚光基团和一个淬灭焚光基团。探针完整时，报 告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收;PCR扩增时，Taq酶的5 ' 一3 '外切酶活性将探针酶 切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每 扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同 步。所以荧光定量PCR检测的前提是要进行PCR扩增反应，扩增反应之间的引物及产物需尽 量避免交叉反应，再进一步保证特异性探针与各个扩增产物、引物均不应有交叉反应。又由 于本发明是多重荧光定量，所以探针标记的选择也比较关键，不仅要对软件设计出来的探 针要经过筛选，四个基因的探针信号还不能相互干扰。
[0052] 分别设计出流感病毒Hl、H3、H5和H7亚型特异的HA基因多条引物序列和杂交探针 序列，采用NCBI Blast在线分析软件(http://www.ncbi .nlm.nih.gov/blast)对拟选用的 探针和引物组合进行序列同源性和适配性分析评估，并通过检测试验最终选定这流感病毒 4种亚型特异且适合多重荧光定量反应体系的引物与探针组合。
[0053]对于每种病毒亚型设计的扩增引物首先要进行单病毒的扩增检测，确认单个病毒 扩增检测没有非特异性扩增后，再进行多重病毒的扩增，设计引物就需要尽量避免发生交 叉反应，还要考虑扩增条件要尽量一致，最终通过杂交反应排除交叉反应;根据上述设计、 生物信息学分析和发明人的经验设计及大量实验检测试验筛选结果确定以下序列：
[0054] 流感病毒Hl亚型特异的扩增引物对和杂交探针：如SEQ ID No. 1、SEQ ID No.2所 示的特异扩增引物对，以及如SEQ ID No.3所示的杂交探针序列，具体如下：
[0055] H1-F(SEQ IDNo · 1): 5' -AGCTCATGGTCYTACATTGTGG-3'其中 Y代表嘧啶，此处为T或 Co
[0056] H1-R(SEQ IDNo.2) :5' -CCTTTCRAATGATGACACTGAGC-3'其中R为代表嘌呤，此处为A 或G。
[0057] Hl-P(SEQ IDNo.3):57-TGTTACCCAGGAGATTTCA-37
[0058] 其中，为了提高对Hl亚型变异株的检出率，在SEQ ID No. 1上游引物序列第12个碱 基Y代表嘧啶，此处为T或C、SEQ ID No.2下游引物序列第7个碱基R代表嘌呤，此处为ASG; [0059] 流感病毒H3亚型特异的扩增引物对和杂交探针：如SEQ ID No.4、SEQ ID No. 5所 示的特异扩增引物对，以及如SEQ ID No.6所示的特异探针序列，具体如下：
[0060] H3-F(SEQ IDNo.4):57-TGATGGAAAAAACTGCACACTG-37
[0061] H3-R(SEQ IDNo.5):57-GCGTTCAACAAAAAGGTCCC-37
[0062] H3-P(SEQ IDNo.6):57-AGACCCTCATTGTGATGGCT-37 ；
[0063] 流感病毒H5亚型特异的扩增引物对和杂交探针：如SEQ ID No.7、SEQ ID No.8所 示的特异扩增上下游引物，以及如SEQ ID No.9所示的杂交探针序列，具体如下：
[0064] H5-F(SEQ IDNoJhS'-TGGTAYGGRTACCAYCATAGCAA-S'，其中Y为T或C，R为A或G。
[0065] H5-R(SEQ IDNo.ShS'-GAGTTKACYTTATTRGTGATTCCAT-S'，其中K为G或T，Y为T或C， R A或 G 〇
[0066] H5-P(SEQ IDNo · 9): 5' -AGTGGATAYGCTGCAGACA-3'其中Y为T或C。
[0067] 流感病毒H7亚型特异的扩增引物对和杂交探针：如SEQ ID No. 10、SEQ ID No. 11 所示的特异扩增引物对，以及如SEQ ID No.12所示的特异探针序列，具体如下：
[0068] H7-F(SEQ IDNo.lOhS'-AGAATAGAATACAGATWGACCCAGT-S'，其中W为A或T。
[0069] H7-R(SEQ IDNo.lDj'-GTGCACYGCATGTTTCCAm'，其中Y为T或C。
[0070] H7-P(SEQ IDNo·12):5' -TTTAGCTTCGGGGCATCATGTTT-3'。
[0071] 采用上述简并引物和探针，有效地提高了检测的特异性同时避免漏检。
[0072] 经大量实验验证，采用上述引物、探针时，可单独用于检测各对应的流感病毒亚 型的检测，其探针的5'端和3'端分别可选用标记FAM-BHQl、Texred-BHQ2、J0E-TAMRA和CY5-BHQ3。但进行同时检测四种流感病毒的亚型时，各探针标记则应对应标记这四种组合关系 也就是说采用FAM-BHQl、Texred-BHQ2、J0E-TAMRA和CY5-BHQ3分别标记Hl的探针，H3的探 针，H5的探针，H7的探针，各探针5'端和3'端标记是不重合的，但是可随意进行组合，检测结 果不受影响，当然单独一个病毒亚型进行检测时，探针也可选用其它荧光基团如VIC、NED等 作为发光基团，使用如BHQ和MGB等作为非荧光淬灭基团。
[0073]实施例2 4重流感病毒亚型荧光定量PCR检测试剂盒
[0074] 流感病毒Hl、H3、H5和H7亚型荧光定量PCR检测试剂盒包括以下成分：
[0075] 2XRT-PCR Buffer；25XRT/Taq mix；
[0076] 流感病毒Hl的上游引物序列如SEQ ID No.1所示，下游引物序列如SEQ ID No.2所 示，探针序列如SEQ ID No.3所示，探针SEQ IDNo.3的SlgEFAMJlgEBHQl;
[0077] 所述流感病毒H3的上游引物序列如SEQ ID No. 4所示，下游引物序列如SEQ ID No . 5所示，探针序列如SEQ ID No . 6所示其中，探针SEQIDNo . 6的Y #ETexred，3l*E BHQ2；
[0078] 所述流感病毒H5的上游引物序列如SEQ ID No. 7所示，下游引物序列如SEQ ID No. 8所示，探针序列如SEQ ID No. 9所示，其中，探针SEQIDNo . 9的5'标记JOE，3'标记TAMRA; [0079] 所述流感病毒H7的上游引物序列如SEQ ID No. 10所示，下游引物序列如SEQ ID No. 11所示，探针序列如SEQ ID No. 12所示，其中，探针SEQ IDNo. 12的SlgECYSJlgE BHQ3〇
[0080] 其中，所述2XRT-PCR Buffer和25XRT/Taq mix上海辉睿生物科技有限公司的 HR One-step qPCR Master Mix，Code:SJ-2106B;引物、探针委托英潍捷基(上海）贸易有限 公司合成。
[0081] 实施例3 4种亚型流感病毒荧光定量PCR检测的方法
[0082] 采用荧光定量PCR同时检测流感病毒!11，!13，!15，!17亚型的方法包括以下步骤：
[0083] (1)病毒RNA提取
[0084] 病毒RNA提取可选用QIAmp RNA Mini Kit提取试剂盒(如可购自德国QIAGEN公司） 进行提取。
[0085] (2)荧光定量PCR扩增
[0086]采用实施例3制备的试剂盒配置反应体系，其组分及其体积优选采用下表1中组分 配置。
[0087]表1反应体系
[0090] 设置阳性对照时，采用流感病毒111、!13、!15、!17亚型提取的1^^替换样本1?^，设置阴 性对照时，采用无核酸酶水替换样本RNA。
[0091] 扩增条件:优选以下扩增条件：5〇￡€3〇!1^11，951€51^11，然后95°(：1〇8,55 1€4〇8，在55 °C进行荧光检测，共进行45个循环。
[0092] (3)收集荧光信号信号，分别选择?舰、1'以代(1、1(^、0￥5的荧光检测模式，基线调整 取3~15个循环的荧光信号，以阈值线刚好超过正常阴性对照的最高点设定阈值线；
[0093] (4)结果判定:待测样品荧光增长曲线超过阈值线，并呈现良好的对数增长，待测 样品荧光增长曲线超过阈值线，并呈现良好的对数增长，则判断为阳性，如无典型的扩增曲 线，判断为阴性。
[0094]进一步地，本实施例中，阈值为35,当Ct值<35,有明显扩增曲线为阳性结果，Ct值 > 40，明显扩增曲线为阴性结果。
[0095] 上述荧光定量PCR反应可使用的仪器包括ABI实时PCR系统（例如7000,7300,7500， 7900等）；BioRad实时PCR检测系统、Stratagene定量多聚酶链反应仪（例如MX4000，MX3000， MX3005)。
[0096] 具体在本发明中，以ABI7500荧光定量PCR仪为例，第一到第四条检检测通过分别 以FAM、Texred、J0E和Cy5标记。第一条检测通道检测流感病毒Hl亚型，其荧光染料FAM的检 测波长约为520nm;第二条检测通道检测流感病毒H3亚型，其荧光染料Texred的检测波长约 为580nm;第三条检测通道检测流感病毒H5亚型，其荧光染料JOE的检测波长约为550nm;第 四条检测通道流感病毒H7亚型，其荧光染料CY5的检测波长约为650nm。以下实施例采用最 优选的实施例来说明本发明。
[0097] 实施例4本发明试剂盒灵敏度的检测 [0098]首先，进行阳性模板的制备如下：
[0099] 对流感病毒!11、!13、!15、!17亚型的菌株进行1?^的提取，采用实施例3中不加入探针 的体系，其它反应试剂及扩增条件不变，进行扩增。取电泳鉴定为阳性扩增的片段，相对应 的纯化后的片段进行体外转录，SP6 5XBuffer 20yL，rNTP s 30yL，酶切纯化产物30yL， SP6Enzyme MixlOyL，Nuclease_Free Water 10yL，混合均勾，短暂离心，放入PCR扩增仪中， 37°C，反应4h。加入IyL RQl DNase到IOOyL体系，放入PCR扩增仪中37°C，15min。再次取出反 应物，用酸氯仿法抽提RNA，得到的沉淀为流感病毒的阳性模板，用Nuclease-Free Water溶 解，-80 °C保存。
[0100]上述过程中相应步骤如无特殊说明均采用常规方法，其中，采用的试剂盒等试剂 及其来源如下，高纯度质粒小提试剂盒为TIANGEN公司，Xhc^酶为New England BioLabs公 司，质粒回收纯化试剂盒为QIAGEN公司，SP6体外转录试剂盒为Promega公司的试剂盒。 [0101] 将上述获得的流感病毒111、!13、!15、!17亚型阳性模板，经测定，其浓度分别为283即/ μL、182ng/yl、262ng/yl、238ng/yl，按照拷贝数copies/μL = (ng/μL X 10-9) X (6 · 02 X IO23)/(660 X DNA长度）公式计算，流感病毒Hl、H3、H5、H7亚型阳性模板的拷贝数分别为6.19 X 101QcopiesAU、3 · 95 X 101QcopiesAU、5 · 74 X 101QcopiesAU、5 · 21 X 101QcopiesAU，进行 10倍比稀释，即可获得浓度从6.19copies/yL至6.19 X 109copies/yl的Hl亚型阳性模板样 品，浓度从3.95(3〇?丨68/^1^至3.95\10 9(：〇?丨68/^1的!13亚型阳性模板样品，浓度从 5 · 74copies/yL至 5 · 74 X 109copies/yl的H5亚型阳性模板样品，浓度从5 · 21copies/yL至 5· 21 X IO9CopiesAil的H7亚型阳性模板样品。
[0102] 利用实施例3检测方法对上述流感病毒Hl、H3、H5和H7亚型的阳性模板进行检测， 其中，
[0103] 1)NTC:无核酸酶水；
[0104] 2)反应体系按照实施例3中表1进行配制，样本RNA采用上述稀释后的阳性模板进 行检测，每个梯度做三个平行样。
[0105] 结果判定:Ct值<35,有明显扩增曲线为阳性结果，Ct值>40,明显扩增曲线为阴 性结果。检测流感病毒Hl亚型、H3亚型、H5亚型、H7亚型的阳性梯度样品的荧光值图，如图1、 2、3、4所示。结果表明，本发明设计的引物和探针检测流感病毒Hl亚型的检测灵敏度为 6(3〇口丨68/^1^，!13亚型的检测灵敏度为30(3(^丨68/^1^，!15亚型的检测灵敏度为5(3(^丨6 8/^1^，!17 亚型的检测灵敏度为50c〇pieSAiL。
[0106] 检测流感病毒Hl亚型、H3亚型、H5亚型、H7亚型的阳性梯度样品的标准曲线图，分 别如图5、6、7、8所示。由图可知，流感病毒Hl亚型、H3亚型、H5亚型、H7亚型的R 2值分别为 0.999、0.999、0.999和0.998，具有良好的线性关系。
[0107] 实施例5本发明试剂盒的特异性检测
[0108] 1)选择流感病毒Hl、H3、H5、H7亚型病毒株提取的RNA作为阳性对照；
[0109] 2)阴性对照:无核酸酶水；
[0110] 3)模板:选择流感病毒!11、!13、!15、!17亚型、!19亚型、乙型流感、博卡病毒、冠状病毒、 偏肺病毒、呼吸道合胞病毒的RNA，上述菌株均为中国检验检疫科学研究院卫生检疫研究所 保存。
[0111] 4)反应体系按照实施例3中表2进行配制，之后进行荧光定量PCR扩增。
[0112] 结果表明，所建立的四种流感亚型病毒的荧光定量PCR方法及其试剂盒，流感病毒 !11、!13、!15、!17亚型有明显扩增曲线，为阳性，对于除流感病毒!11、!13、!15、!17亚型外的其他病 毒为阴性，没有特异性的扩增，表明设计的引物及探针特异性强。
[0113] 实施例6:利用本发明试剂盒对样品进行检测
[0114] 本发明的试剂盒对病毒RNA提取液进行检测。人鼻咽拭子、组织等标本的RNA提取 流程可参考WHO发布标准进行，推荐使用Roche公司的High Pure Viral RNA Kit(目录号： 11858882001)或Qiagen公司的OIAampViral RNA Mini Kit(目录号：52904)进行病毒样本 的RNA提取操作。
[0115] 针对目前，发热人群中携带有流感病毒H1、H3、H5和H7亚型可能性大，对发热人群 中流感病毒H1、H3、H5和H7亚型的筛查检测显得尤为重要，下面主要是对发热人群是否携带 有的流感病毒H1、H3、H5和H7亚型进行模拟检测。
[0116] 利用本发明试剂盒，对鼻咽拭子的提取的RNA进行模拟阳性样品的检测，其中，模 拟阳性样品为在咽拭子中加有流感病毒Hl、H3、H5和H7亚型的病毒株，具体实验步骤如下：
[0117] (1)病毒RNA提取
[0118] 病毒RNA提取选用QIAGEN公司的RNA提取试剂盒进行提取。
[0119] a.匀浆处理：
[0120] 从-80°C冰箱或液氮中取出咽拭子样本，置于预先加入3颗直径3mm的氧化锆颗粒 的2mL圆底离心管中，再加入1.5mL研磨液(含10 %青链霉素的细胞培养基），用TOMY的组织 研磨器4000次/min震荡60sec，直至成勾衆，于4°C，10,000印111离心1〇111；[11。
[0121] b.将上清转移至1.5mL离心管，4°(：，12,000印111，离心21^11。取14(^1^上清液用于尺· 提取，其余匀浆液置于_40°C保存。
[0122] 总RNA提取
[0123] c.选用QIAGEN公司的RNA提取试剂盒，根据样本的数量分装AVL液，每管560yL;
[0124] d.取HOyL研磨液上清加入到560yL分装好的AVL液，涡旋震荡15s，充分混匀，室温 孵育IOmin;
[0125] e.每管分别加入560yL的无水乙醇(96%-100% )，震荡15s充分混匀，快速离心；
[0126] f.从Kit中取出带滤柱的2mL的收集管，做好标记，取混合液630yL加入到收集管 中，8000rpm 离心 Imin;
[0127] g.将滤柱放置到新的2mL收集管中，将剩余的液体加入滤柱，8000rpm离心Imin;
[0128] h.将滤柱移至新的收集管中，加入500yL AWl液，8000rpm离心lmin;
[0129] i.滤柱放置到一个新的收集管中，加入500yL AW2液，14,000rpm离心3min;
[0130] j.将滤柱移到干净的1.5mL EP管中，加入60yL AVE，室温静置2min，8000rpm离心 Imin，即得到RNA，放置于-80 °C冰箱保存备用。
[0131] (2)荧光定量PCR扩增
[0132] 按照实施例3配置反应体系及扩增条件，进行检测。检测结果得出，加入流感流感 病毒H1、H3、H5和H7亚型的病毒株的样品，检测结果为阳性，说明本发明试剂盒可应用于检 测咽拭子中流感病毒Hl、H3、H5和H7亚型的检测，且检测结果准确、可靠。
【主权项】
1. 一组用于多重PCR同时检测流感病毒!11，!13，!15，!17亚型的核酸，其特征在于，包括流 感病毒H1的上、下游引物、流感病毒H3的上、下游引物、流感病毒H5的上、下游引物和流感病 毒H7的上、下游引物； 其中，所述流感病毒H1的上游引物序列如SEQ ID No. 1所示，下游引物序列如SEQ ID No. 2所示； 所述流感病毒H3的上游引物序列如SEQ ID No.4所示，下游引物序列如SEQ ID No.5所 示； 所述流感病毒H5的上游引物序列如SEQ ID No.7所示，下游引物序列如SEQ ID No.8所 示； 所述流感病毒H7的上游引物序列如SEQ ID No. 10所示，下游引物序列如SEQ ID No. 11 所示。2. -组用于荧光定量PCR同时检测流感病毒!11、!13、!15、!17亚型的核酸，其特征在于，包 括流感病毒H1的上、下游引物和探针、流感病毒H3的上、下游引物和探针、流感病毒H5的上、 下游引物和探针、及流感病毒H7的上、下游引物和探针； 所述流感病毒H1的上游引物序列如SEQ ID No. 1所示，下游引物序列如SEQ ID No.2所 示，探针序列如SEQ ID No.3所示； 所述流感病毒H3的上游引物序列如SEQ ID No.4所示，下游引物序列如SEQ ID No.5所 示，探针序列如SEQ ID No.6所示； 所述流感病毒H5的上游引物序列如SEQ ID No.7所示，下游引物序列如SEQ ID No.8所 示，探针序列如SEQ ID No.9所示； 所述流感病毒H7的上游引物序列如SEQ ID No. 10所示，下游引物序列如SEQ ID No. 11 所示，探针序列如SEQ ID No. 12所示。3. -种用于同时检测流感病毒!11、!13、!15、!17亚型的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包 括:如权利要求2所述的流感病毒!11、!13、!15、!17的上、下游引物和相应的探针，各条探针的5 / 端和Y 端分别对应标记FAM-BHQ1、Texred-BHQ2、J0E-TAMRA和CY5-BHQ3。4. 如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，还包括2 X RT-PCR缓冲液及25 X反转录酶 和Taq聚合酶混合酶。5. -种用于荧光定量PCR同时检测流感病毒!11、!13、!15、!17亚型的方法，其特征在于，该 方法是非诊断目的的检测方法，其包括以下步骤： (1) 从样品中提取病毒RNA; (2) 对所述步骤（1)提取的病毒RNA进行荧光定量PCR扩增;其中，荧光定量PCR扩增时， 在反应体系中，采用流感病毒H1的上、下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2所示，探针的核苷酸序列如SEQ ID No. 3所示，其5'端和3'端分别对应标记FAM和BHQ1; 流感病毒H3的上、下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.4和SEQ ID No.5所示，探针的核苷 酸序列如SEQIDNo.6所示，其5/端和3/端分别对应标记Texred和BHQ2 ;流感病毒H5上、下 游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示，探针的核苷酸序列如SEQ ID No. 9所示，其Y端和Y端分别对应标记JOE和TAMRA;流感病毒H7上、下游引物的核苷酸序列 如SEQ ID No. 10和SEQ ID No. 11所示，探针的核苷酸序列如SEQ ID No. 12所示，其5'端和 3'端分别对应标记CY5和BHQ3; (3) 收集荧光信号，选择上述荧光基团的荧光检测模式，基线调整取3~15个循环的荧 光信号，以阈值线刚好超过正常阴性对照的最高点设定阈值线； (4) 结果判定:待测样品荧光增长曲线超过阈值线，并呈现良好的对数增长，则判断为 阳性，如无典型的扩增曲线，判断为阴性。6. 如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中荧光定量PCR扩增的反应体系 具体如下： 1XRT-PCR缓冲液， 1 X反转录酶和Taq聚合酶混合酶， 所述流感病毒H1的上游引物的终浓度为80nmol/L，下游引物的终浓度为80nmol/L，探 针的终浓度为40nmo 1 /L;所述流感病毒H3的上游引物的终浓度为400nmo 1 /L，下游引物终浓 度为400nmol/L，探针的终浓度为200nmol/L;所述流感病毒H5的上游引物终浓度为 200nmol/L，下游引物终浓度为200nmol/L，探针的终浓度为100nmol/L;所述流感病毒H7上 游引物终浓度为200nmol/L，下游引物终浓度为200nmol/L，探针的终浓度为100nmol/L ; 所述病毒RNA为2yL; 同时设置无核酸酶水为阴性对照。7. 如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中荧光定量PCR扩增的反应程序 为：5〇￡€3〇!1^11，95 1€51^11，然后95°(：1〇8,551€4〇8，在55°(：进行荧光检测，共进行45个循环。8. 如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)结果判定中，所述阈值为35,当 Ct值<35时，有明显扩增曲线为阳性结果;Ct值>40时，无明显扩增曲线为阴性结果。
【文档编号】C12R1/93GK106086236SQ201610467212
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年6月24日
【发明人】杨宇, 王静, 王建成, 赵婷婷, 李辉
【申请人】中国检验检疫科学研究院