专利名称：吲哚类菁染料嵌入的硅壳荧光纳米颗粒及其制备方法
技术领域：
本发明属于纳米材料领域，特别涉及一种将在近红外区可发荧光的吲哚类菁染料嵌入的荧光硅壳纳米颗粒及其制备方法。
背景技术：
吲哚类菁染料(其代表性化合物Cy3、Cy5)的特点是摩尔消光系数大，与生物基质结合后荧光增强，易于合成得到在近红外及红外区有吸收的荧光染料。因绝大多数生物基质在近红外区无吸收，用于生物检测时无背景干扰。这些染料近年来已广泛应用于各种生物分析技术。包括生物大分子的定量测定、DNA测序、荧光免疫分析检测及原位荧光杂交技术等。
目前，纳米颗粒因其可修饰性、靶向性等等优点，已经被广泛应用于生物医药的各个领域。把染料嵌入至纳米颗粒中，由此而发展起来的荧光纳米颗粒，不仅可以避免染料与所研究的生物体发生直接的接触，提高安全性，更能提高标记后的荧光强度，从而提高检测的灵敏度。以往所发展的荧光纳米颗粒，它们所包埋的染料，激发和发射波长都比较短，难以完成在近红外区进行样品检测的需要。而把吲哚类菁染料包埋到纳米颗粒中，无疑发展了一种可以在近红外区进行检测的荧光纳米颗粒。现有的荧光纳米颗粒以纯染料为核，而吲哚类菁染料的分子量较小，如果直接包埋到颗粒里会导致严重的染料泄漏。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种可以在近红外区进行检测，既可避免染料的泄漏，又能显著提高染料的包埋效率的吲哚菁染料(如Cy5、Cy3)硅壳荧光纳米颗粒及其工艺简单、物理性质稳定的制备方法。
本发明的吲哚类菁染料硅壳荧光纳米颗粒，其为核壳型纳米颗粒，其外壳成分为二氧化硅，内核材料为结合了免疫球蛋白的吲哚类菁染料。其制备方法为在吲哚类菁染料(如Cy5、Cy3菁染料系列)上结合上免疫球蛋白，以此为内核材料，通过油包水的原理制备了在近红外区可产生荧光的硅壳荧光纳米颗粒。
其具体步骤如下①将NaHCO3溶于水中，配成1mol/L的NaHCO3溶液，其pH值范围在8.0到8.5之间；②将免疫球蛋白溶于0.1mol/L的NaHCO3缓冲溶液中，得到浓度为2mg/ml的免疫球蛋白溶液。该浓度的NaHCO3由第一步的1mol/L的NaHCO3用超纯水稀释10倍而成。再把2mg/ml的免疫球蛋白溶液和1mol/L的NaHCO3溶液以10∶1的比例混合均匀，得到免疫球蛋白溶液b；③使用超纯水将染料配成10mg/ml；④将染料溶液和免疫球蛋白溶液b以体积比为1∶25到1∶30之间的比例混合，并立即搅拌。反应持续轻微搅拌2h。最终得到的结合了免疫球蛋白的吲哚类菁染料溶液称为反应液a；⑤在磁力搅拌下依次加入环己烷、正己醇、和聚氧乙烯辛烷基苯酚醚-100，其体积比为4∶1∶1到5∶1∶1之间；另外加入超纯水及反应液a，其体积比为4∶1，搅拌5min至澄清。接着依次加入体积比范围为1∶1到1∶4之间的氨水和正硅酸乙酯.在磁力搅拌下反应24h即可得吲哚类菁染料荧光纳米颗粒溶液。
本发明具有以下特点1、制备方法简便易行，制备过程中染料损失量少，制备出的纳米颗粒尺寸均一；2、吲哚类菁染料的性质不稳定，在水溶液中溶液水解，而制备吲哚类菁染料(Cy5、Cy3菁染料系列)硅壳荧光纳米颗粒可以避免染料与水环境直接接触。
3、吲哚类菁染料(Cy5、Cy3菁染料系列)硅壳荧光纳米颗粒的物理稳定性较好，经过一段时间保存后未见有染料泄漏、粒径大小变化不大；4、吲哚类菁染料(Cy5、Cy3菁染料系列)包埋成为纳米级微粒，使得染料与生物机体隔离起来，避免了染料对机体造成的不利影响，同时可以大大提高标记生物体所得标本的荧光强度，从而提高检测的灵敏度。
5、吲哚类菁染料(Cy5、Cy3菁染料系列)硅壳荧光纳米颗粒同时也具有良好的光稳定性，可以完成对生物标本标记后的长时间检测。同时，也发展了一种可以在近红外区进行检测的荧光纳米颗粒。
6、吲哚类菁染料(Cy5、Cy3菁染料系列)硅壳荧光纳米颗粒具有的二氧化硅外壳，适于进行生物结合。
7、由于吲哚类菁染料的分子量较小，直接包埋到颗粒里会导致严重的染料泄漏，所以本发明将其标记到结构复杂，分子量大的免疫球蛋白上，既避免了染料的泄漏，又提高了染料的包埋效率。
图1为Cy5、Cy3菁染料系列荧光纳米颗粒结构示意图。
图中 1二氧化硅外壳 2染料标记的人免疫球蛋白分子图2为Cy5荧光纳米颗粒和Cy5纯染料溶液的荧光光谱比较图。
图中 1 Cy5纳米颗粒的激发光谱 2 Cy5染料溶液的激发光谱3 Cy5染料溶液的发射光谱 4 Cy5纳米颗粒的发射光谱图3为Cy5荧光纳米颗粒透射电子显微镜表征图。
图4为Cy5荧光纳米颗粒的光稳定性图。
图中 1 Cy5荧光纳米颗粒的光稳定性图2 Cy5染料溶液的光稳定性5为Cy5荧光纳米颗粒的染料泄漏考察图。
具体实施例方式实施例1Cy5染料嵌入的硅壳荧光纳米颗粒的制备(核为结合了人免疫球蛋白的Cy5染料)称取约84mg NaHCO3溶于1ml水中，配成1ml1mol/L的NaHCO3溶液，其pH值约为8.3；将1mg人免疫球蛋白溶于0.5ml0.1mol/L的NaHCO3缓冲溶液中，得到2mg/ml的免疫球蛋白溶液，再加入50μl1mol/L的NaHCO3缓冲溶液，并混合均匀，得到人免疫球蛋白溶液b。使用超纯水将Cy5染料配成10mg/ml，取20μl Cy5染料溶液加入人免疫球蛋白溶液b中，并立即搅拌。反应持续轻微搅拌2h，最终得到的结合了人免疫球蛋白的Cy5染料溶液称为反应液a。在磁力搅拌下依次加入7.5ml环己烷，1.8ml正己醇，1.8ml聚氧乙烯辛烷基苯酚醚-100，400μl超纯水及100μl反应液a，搅拌5min至澄清。接着依次加入200μl氨水和400μl正硅酸乙酯.在磁力搅拌下反应24h即可得粒径范围为50～100nm的Cy5的荧光纳米颗粒。
实施例2Cy3染料嵌入的硅壳荧光纳米颗粒的制备(核为结合了人免疫球蛋白的Cy3染料)称取约84mg NaHCO3溶于1ml水中，配成1ml1mol/L的NaHCO3溶液，其pH值约为8.3；将1mg人免疫球蛋白溶于0.5ml0.1mol/L的NaHCO3缓冲溶液中，得到2mg/ml的免疫球蛋白溶液，再加入50μl1mol/L的NaHCO3缓冲溶液，并混合均匀，得到人免疫球蛋白溶液b。使用超纯水将Cy3染料配成10mg/ml，取20μl Cy3染料溶液加入人免疫球蛋白溶液b中，并立即搅拌。反应持续轻微搅拌2h，最终得到的结合了人免疫球蛋白的Cy3染料溶液称为反应液a。在磁力搅拌下依次加入7.5ml环己烷，1.8ml正己醇，1.8ml聚氧乙烯辛烷基苯酚醚-100，400μl超纯水及100μl反应液a，搅拌5min至澄清。接着依次加入200μl氨水和200μl正硅酸乙酯.在磁力搅拌下反应24h即可得粒径范围为40～100nm的Cy3的荧光纳米颗粒。
实施例3Cy5染料嵌入的硅壳荧光纳米颗粒的制备(核为结合了羊免疫球蛋白的Cy5染料)称取约84mg NaHCO3溶于1ml水中，配成1ml1mol/L的NaHCO3溶液，其pH值约为8.3；将1mg羊免疫球蛋白溶于0.5ml0.1mol/L的NaHCO3缓冲溶液中，得到2mg/ml的羊免疫球蛋白溶液，再加入50μl1mol/L的NaHCO3缓冲溶液，并混合均匀，得到羊免疫球蛋白溶液b。使用超纯水将Cy5染料配成10mg/ml，取20μl Cy5染料溶液加入羊免疫球蛋白溶液b中，并立即搅拌。反应持续轻微搅拌2h，最终得到的结合了羊免疫球蛋白IgG的Cy5染料溶液称为反应液a。在磁力搅拌下依次加入15ml环己烷，3.6ml正己醇，3.6ml聚氧乙烯辛烷基苯酚醚-100，800μl超纯水及200μl反应液a，搅拌5min至澄清。接着依次加入400μl氨水和400μl正硅酸乙酯.在磁力搅拌下反应24h即可得粒径范围为50～100nm的Cy5的荧光纳米颗粒。
上述实例1、2所制备的Cy5、Cy3菁染料系列荧光纳米颗粒其结构示意图见图1。Cy系列的荧光纳米颗粒其外壳为二氧化硅1，内壳为Cy染料标记的人免疫球蛋白分子2。
实施例1Cy5荧光纳米颗粒荧光光谱性质通过荧光分光光度计进行波长扫描，结果见图2.从图中可知，在染料包埋前后，Cy5染料的荧光光谱性质没有发生改变。
实施例1Cy5荧光纳米颗粒的形貌通过透射电子显微镜表征，结果见图3。本发明制备的纳米颗粒呈完整的球形，分散性好，粒径均匀。纳米颗粒的平均粒径为50nm。
实施例1Cy5荧光纳米颗粒的光稳定性考察，结果见图4。在激光共聚焦激发30分钟后，Cy5染料溶液1的荧光强度下降为原来的18％，而Cy5荧光纳米颗粒2的荧光强度仍为原来的82％，说明Cy5纳米颗粒具有良好的光稳定性。
实施例1Cy5荧光纳米颗粒的染料泄漏情况考察，结果见图5。经丙酮析出的纳米颗粒用无水乙醇和水分别超声洗涤数次除去多余的表面活性剂和物理吸附在SiO2壳层上的有机染料后，在浸泡在水中，每隔一定时间除去纳米颗粒悬浮液中的上清，所得的颗粒重新分散在水中用荧光仪F-2500测荧光。在20h内，Cy5荧光纳米颗粒的荧光强度仍为原来的95％以上，说明Cy5染料泄漏很少。
权利要求
1.一种吲哚类菁染料荧光纳米颗粒，其特征为为核壳型纳米颗粒，其壳成分为二氧化硅，内核材料为结合了免疫球蛋白的吲哚类菁染料。
2.一种如权利要求1所述的吲哚类菁染料荧光纳米颗粒的制备方法，其特征在于以免疫球蛋白为载体，标记上吲哚类菁染料后，被包埋到核壳型的纳米颗粒中，采用反相微乳液法制备在近红外区可发荧光的纳米颗粒。
3.根据权利要求2所述的吲哚类菁染料荧光纳米颗粒制备方法，其特征在于具体步骤为①将NaHCO3溶于水中，配成1mol/L的NaHCO3溶液，其pH值范围在8.0到8.5之间；②将免疫球蛋白溶于0.1mol/L的NaHCO3缓冲溶液中，得到浓度为2mg/ml的免疫球蛋白溶液，该浓度的NaHCO3由第一步的1mol/L的NaHCO3溶液用超纯水稀释10倍而成；再把2mol/L的免疫球蛋白溶液和1mol/L的NaHCO3溶液以10∶1的比例混合均匀，得到免疫球蛋白溶液b；③使用超纯水将染料配成10mg/ml；④将染料溶液和免疫球蛋白溶液b以体积比为1∶25到1∶30之间的比例混合，并立即搅拌；反应持续轻微搅拌2h；最终得到的结合了免疫球蛋白的吲哚类菁染料溶液称为反应液a；⑤在磁力搅拌下依次加入环己烷、正己醇、聚氧乙烯辛烷基苯酚醚-100，其体积比为4∶1∶1到5∶1∶1之间；另外加入超纯水及反应液a，其体积比为4∶1，搅拌5min至澄清；接着依次加入体积比为1∶1到1∶4之间的氨水和正硅酸乙酯，在磁力搅拌下反应24h即可得吲哚类菁染料荧光纳米颗粒溶液。
全文摘要
本发明公开了一种吲哚菁染料(Cy染料系列)嵌入的硅壳荧光纳米颗粒及其制备方法，旨在提供一种工艺简单、物理性质稳定，并能显著提高染料的包埋效率的硅壳荧光纳米颗粒及其制备方法。吲哚菁染料(Cy染料系列)嵌入的硅壳荧光纳米颗粒特征为为核壳型纳米颗粒，其壳成分为二氧化硅，内核材料为结合了免疫球蛋白的吲哚类菁染料。其制备方法是以人免疫球蛋白为载体，标记上吲哚菁染料后，被包埋到核壳型的纳米颗粒中，采用反相微乳液法制备了在近红外区可产生荧光的纳米颗粒。
文档编号C09K11/02GK1654592SQ20051003115
公开日2005年8月17日 申请日期2005年1月17日 优先权日2005年1月17日
发明者王柯敏, 谭蔚泓, 何晓晓, 陈基耘, 秦迪岚 申请人:湖南大学