专利名称：近红外荧光分子探针及其合成方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及特异性分子识别诊断试剂领域，具体涉及由近红外荧光染料与特异性分子的 配体组成的诊断试剂复合物。
背景技术：
近红外波段(700 900nrn)的光波避开了体内水、有氧及无氧血红蛋白等主要吸收体的吸 收，其传播特性主要决定于光的散射，因而具有较深的生物组织穿透能力(达十几厘米)。而 且该波段无电离、无辐射，对生物组织无任何伤害，从而赋予了其无损在位连续监测生物体 内各参数的潜能，也使其在生物医学检测领域蕴藏着巨大的应用前景，必将在体内特异性分 子的识别，尤其是肿瘤特异性分子的诊断中发挥重要的作用。
近红外荧光探针在生物体内分子的诊断及识别中起着尤为关键的作用。目前，近红外荧 光探针按功能可将其分为三大类，即非特异性探针、可激活定靶探针及活性定靶探针。其中， 非特异性探针多为小分子游离荧光基团，缺乏特异性分子的靶向性。而可激活定耙探针只有 在与肿瘤相关的特异性酶的作用下才发出荧光信号，专属性很强，但合成探针程序较复杂， 大多处于研究阶段，未见该类产品上市。活性定靶探针则是通过荧光基团与特异性分子的配 体相结合，提高探针与特异性分子的亲和力，从而提高病变组织，尤其是肿瘤组织的耙向性。 有机或无机近红外复合探针都可设计成为用于分子识别或疾病诊断的各类新型活性定靶探 针，而"影像"及"识别"功能是该类探针的两大组成部分。"影像"功能的实现有助于无损在位 实时对该复合物在生物体内的行为进行监测，而"识别"功能的实现可将探针靶向至特定组织 部位。
有机近红外染料在荧光探针的设计及开发中是不可或缺的。迄今，已开发出的有机近红 外染料种类很多，主要包括菁染料(Cyanine)，含四吡咯(Tetrapyrrole-based)基团的近红外 荧光染料、咕吨类荧光染料、噻嗪类和噁嗪类近红外荧光染料、近红外稀土配合物荧光探针、 二氟化硼-二吡咯甲垸(BODIPY)类荧光染料等。其中，菁染料(Cyanine)(包括ICG衍生物、 IRDye系列及Cy系列)生物毒性小，更适合开发生物体内的应用。Meek等合成了一种含苯 并杂环的近红外染料，该染料比其同系物吸收红移更多，将具有更优异的近红外特性(Meek ST, Nesterov EE, Swager TM. Near-infrared fluorophores containing benzo[c]heterocycle subunits.
OrgLett.2008 Jul 17;10(14):2991-3.) 。 Tarazi等制备了最大发射波长为819、 805、 791 nm的近红外染料TG-170,并研究了其与金属离子的配合(Tarazi L, George A， Patonay G, Strekowski L. Spectral characterization of a novel near-infrared cyanine dye: a study of its complexation with metal ions. Talanta. 1998 Aug;46(6):1413-24.) 。 Achilefu等的专利US20070098638公开了一种 近红外染料cypate及其一系列衍生物的制备。专利CN1974675公开了一种近红外染料合成的 新方法，该类染料是通过桥联两个吡咯二甲川核形成一个环状结构而成，此方法在制备工艺 和产物纯化上有一定的简化和提高。专利CN1835955公开了对吩噁嗪类近红外染料机构修饰 的产物3H-吩噁嗉衍生物，这些衍生物可能用于标记脑中的淀粉样蛋白斑，用于阿尔茨海默 氏病的鉴别，并且这些衍生物染料也可以用于连接到某些载体物质上，用于其他的生物分析。
近红外荧光复合探针由两种以上功能型探针的组合，具有功能的多样化。LichaKai等也 申请了多肽靶向的近红外探针进行肿瘤诊断的专利(US6630570)。 Veiseh O (Veiseh O, M Kievit F， W Gunn J, D Ratner B， Zhang M.A ligand-mediated nanovector for targeted gene delivery and transfection in cancer cells. Biotnaterials. 2008 Nov 4)等报道了以DNA-聚乙烯亚胺为纳米 的载体负载近红外染料Alexa647与CTX多肽复合物的制备及对肿瘤细胞的靶向特性。Tang 等制备了可用于血清，植物样本，雨水等检测的近红外有机荧光探针Cy.7.Cl，该探针最大发 射波长为■ nm (Tang B, Zhang L, Xu KH. FIA-near隱infrared spectrofluorimetric trace determination of hydrogen peroxide using tricarchlorobocyanine dye (Cy.7.Cl) and horseradish peroxidase (HRP)[J]. Talanta. 2006 Jan 15;68(3):876-82.) 。 Bernardi RJ等(Bernardi RJ, Lowery AR， Thompson PA, Blaney SM， West JL.Immunonanoshells for targeted photothermal ablation in medulloblastoma and glioma: an in vitro evaluation using human cell lines.J Neurooncol. 2008 Jan;86(2): 165-72)报道了将近红外光学特性的金-硅纳米粒与HETR2抗原复合探针的制备， 并通过脑癌细胞证实了该探针的肿瘤靶向特性及在该肿瘤热疗中的应用前景。
与无机荧光量子点相比，有机小分子荧光探针毒性小，体内过程主要决定于复合物中的 配体，因而在生命科学领域的应用备受关注，特别在靶向性研究中尤为重要。但就目前而言， 能体内利用的近红外荧光有机探针数量还十分有限，尤其是可用于水体系的近红外荧光染料 数量就更少了，这也是推广这门技术所要解决的瓶颈问题之一。在当前有机近红外荧光染料 相关的研究中，多次甲基菁类杂环化合物是一类重要的且使用广泛的近红外荧光染料。其中， 最为著名的就是吲哚菁绿ICG(Indocyanine Green)，是经FDA批准的用于人体的血管造影剂， 已经广泛应用于临床活体组织的荧光造影和癌症组织的检测
发明内容
本发明公开了结构式I或II的近红外染料:
S03- S。3Na II
结构式I和II的近红外染料是吲哚菁绿ICG (Indocyanine Green)的衍生物，因此，本发 明的结构式I和II的近红外染料其生物相容性及体内安全性与其它近红外探针相比具有了明 显的优势。
本发明的结构式I化合物以下简称ICG-Der-01 ，它的最大吸收峰约在780 nm，对应的最 大荧光发射峰约为805 nm。其紫外吸收光谱见图1，荧光光谱见图2。
由于ICG-Der-01近红外染料带两个不同活性羧基，在活化后，可分别与带氨基的生物活 性分子反应，通过控制反应物配比可调节其标记比例，因而在探针设计中具有明显的优势。 ICG-Der-01可作为该类生物活性分子在生物体内代谢过程研究的示踪剂，以及可作为肿瘤检 测和早期诊断的造影剂。
ICG-Der-01不溶于乙醚等非极性试剂，在水等强极性试剂中溶解度低，易溶于乙腈、甲 醇等极性试剂中。ICG-Der-01含有羧基官能团，可与蛋白质和DNA等生物活性分子上的氨 基发生縮合，进而可以对它们进行标记。此外，由于ICG-Der-01在700到900纳米之间有强 的近红外荧光发射(荧光发射峰约为805nm)，并且，此波段近红外光能穿透深层组织。因此， 标记有ICG-Der-01的蛋白质和DNA等生物活性分子可充当活体组织成像的探针。这些充分 表明，ICG-Der-Ol在活体组织成像以及在位活体检测等研究领域有着潜在的广泛的应用前景。本发明的结构式II化合物以下简称ICG-Der-02，它的最大吸收峰约在782 nm，对应的最大 荧光发射峰约为808nm。其紫外吸收光谱和荧光光谱见图3，左边的曲线是紫外吸收光谱，右 边的曲线荧光光谱。
近红外染料ICG-Der-02是水溶性化合物，只带一个活性羧基。ICG-Der-02的羧基在活化 后，可在水相中与水溶性带氨基的生物活性分子发生偶联反应，其复合物的生物相溶性、毒 性、生物活性等都有了很大的提高。因此，ICG-Der-02是研究生物活性分子在生物体内代谢 过程的良好的示踪剂，并可作为肿瘤检测和早期诊断的造影剂。这些性质使得近红外水溶性 染料ICG-Der-02在生命科学领域有着更为广泛的应用前景。
ICG-Der-02不溶于乙醚等非极性试剂，在乙腈等中等极性试剂中溶解度低，易溶于水、 甲醇等强极性试剂中。NIRD-Der-02含有单羧基官能团，可与蛋白质和DNA等生物活性分子 上的氨基发生縮合，进而可以对它们进行标记。此外，它在700到卯0纳米之间有强的近红 外荧光发射，荧光发射峰约为808 nm。因此，NIRD-Der-02在活体组织成像以及在位活体检 测等在水体系中开展的研究领域来说有着潜在的广泛的应用前景。
ICG-Der-Ol的制备方法包括将1，1,2-三甲基[lH]-苯并吲哚与3-溴丙酸反应，获得产物 1，1,2-三甲基[lH]-苯并吲哚-3-丙酸；再将1,1,2-三甲基[1H]-苯并B引哚与碘己酸溶于乙睛中，反 应，分离纯化后得产物1，1,2-三甲基[lH]-苯并吲哚-3-己酸；最后将上述两种产物1，1,2-三甲基 [l司-苯并吲哚-3-丙酸与1,1,2-三甲基[lH]-苯并吲哚-3-己酸混合并经一系列反应，分离纯化后 得到最终产物ICG-Der-Ol 。
ICG-Der-02的制备方法包括将冰醋酸、对肼基苯磺酸、甲基异丙基酮和醋酸钠混合反 应，纯化后得产物2，2，3-三甲基[3H]-B引哚-5-磺酸；再将邻二氯苯加入到2，2，3-三甲基[3印-吲哚-5-磺酸与1，3-丙磺酸内脂的混合物中，制得2，2,3-三甲基-5-磺酸-1-(3-磺酸-丙 基)-[3H]-吲哚；再将该产物与N-[(3-(anilinomethylene)-2-chloro-l-cyclohexen-l-yl)methylene] -aniline monohydrochloride反应得到绿色碳菁染料，最后将碳菁染料与巯基丙酸及三乙胺反 应，分离纯化得水溶性近红外染料ICG-Der-02。
本发明还涉及一系列近红外荧光分子探针，由结构式I或II的近红外荧光染料上的羧基 与特异性分子的配体进行共价结合而得。其中特异性分子的配体优选肿瘤细胞特异性受体的 配体，优选为叶酸、低密度脂蛋白LDL、 RGD氨基酸序列、单克隆抗体。
本发明将近红外荧光染料与抗体、受体的配体、多肽等结合，通过与某些细胞膜表面抗 原、受体或特定基因片段的专一性相互作用，使该试剂准确输送到病变部位，实现疾病，尤其 是肿瘤的早期分子诊断。由于许多肿瘤细胞过分表达叶酸受体，如卵巢癌、宫颈癌、子宫内膜癌，乳腺癌，结肠 癌，肺癌，脉络膜癌，脑瘤，室管膜细胞瘤等，使以叶酸为靶点的诊断治疗具有巨大的潜在 优势。叶酸含有a和Y两个羧基，实验证明通过叶酸的厂羧基衍生的偶联结合物具有与叶酸 受体较高的结合能力。
除叶酸受体外，大多数肿瘤细胞表面过分表达其他特异性受体，如低密度脂蛋白受体 (LDLR)、雌激素受体(ER)、表皮生长因子受体(EGFR)、整合素受体等。同样，在一些 恶性肿瘤组织或细胞表面会产生一些肿瘤抗原，如甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、前 列腺特异抗原(PSA)等。利用受体-配体及抗原-抗体的高度特异性结合，将可实现相应受体 或抗原过度表达的相关肿瘤的早期诊断。例如，将本发明的近红外荧光染料与LDLR的特异 性配体低密度脂蛋白(LDL)或载脂蛋白E (apo-E)共价标记，利用受体配体高度特异性结 合的特性，将可实现急性骨髓性白血病，直肠癌、肾上腺癌，肺癌，脑癌，转移性前列腺癌 等LDLR受体过量表达肿瘤的早期诊断。这些肿瘤特异性受体的配体和肿瘤抗原的特异性抗 体都含有可与相应羧基形成较稳定酰胺键的氨基，易于得到近红外荧光复合物。
当特异性分子的配体含有羧基官能团时，制备方法包括由近红外染料上羧基与双氨基 聚乙二醇反应，然后再与特异性分子的配体的羧基反应。当特异性分子的配体含有氨基官能 团时，制备方法包括由近红外染料上羧基与特异性分子的配体配体上氨基的反应。
近红外染料的羧基与叶酸的Y-羧基共价偶联的制备方法为称取一定量的叶酸溶于无水
DMS0中，加入催化剂活化后，将活化液滴加到1.2倍量的双氨基聚乙二醇(分子量4， 000) 的无水二甲基亚砜(DMS0)溶液中，避光反应12 h;通过硅胶柱分离纯化获得叶酸偶联PEG。 取一定量的含有羧基官能团的近红外染料，加入催化剂活化，然后将活化液滴加入含有叶酸 偶联PEG的pH 9 PBS溶液中，避光反应12 h。将反应液于pH 7. 2 PBS溶液中透析3天(透 析袋，截留分子量为3, 500)，然后通过反相高效液相色谱纯化出叶酸偶联近红外染料的产品。 上述制备反应中，反应温度为0-28° C，优选为25士r C;催化剂为EDCI/NHS， DCC/NHS， H0BT/HBTU。优选为EDCI/NHS;近红外染料为NIR-Der-01， NIR-Der-02。
本发明的叶酸受体靶向性近红外探针具有良好的水溶性，在磷酸盐PBS缓冲液中荧光很 好，稳定性良好。由于PEG的加入，使探针的生物相容性增加，且没有免疫原性，没有蛋白 对抗，避免单核吞噬细胞系统(MPS )的摄取，延长循环时间等优异特性，它为叶酸受体高 表达的相关肿瘤的早期诊断提供了简单、快捷的诊断试剂。
近红外荧光探针中近红外染料的羧基与特异性配体或抗体的氨基结合的制备方法为 (1)含羧基的近红外荧光探针的活化将近红外荧光染料与一定量的催化剂(EDCI、 DCC 等)溶解于无水二甲亚砜(DMSO)或相应的缓冲盐体系中，涡旋混合一段时间后，再向该体系中投入第二种催化剂(NHS、 HOBt等)，室温避光搅拌反应一段时间；(2)特异性配体 标记将(1)步骤活化的近红外荧光探针的混悬液离心，取一定量的上清液，边搅拌边缓慢 滴加入配体或抗体溶液，两者混匀后避光反应，优选在4度条件下搅拌反应4-24小时，溶液 体系的pH值优选在pH8.0-10.0; (3)标记复合物的纯化将反应液离心后，脂溶性近红外荧 光探针标记的复合物可用葡聚糖凝胶柱层析分离后可得近红外荧光探针与相应配体或抗体的 共价标记物纯品；水溶性近红外荧光探针标记的复合物可于PBS缓冲液透析数天后得共价标 记物纯品，所得溶液冻干。
本发明的系列近红外荧光探针都具有极好的生物相溶性，体内毒性低，荧光信号强且稳 定，与特异性受体的亲和力高，是多种恶性肿瘤早期诊断的优选试剂。
下面是部分本发明系列近红外荧光探针的实验结果，其中NIR-Der-01-Folate表示叶酸与 NIR-Der-01偶联的近红外染料探针，其它表示方法类同。
一、 NIR-Der-01-Folate对宫颈癌HeLa细胞的亲和性 培养叶酸受体阳性人宫颈癌HeLa细胞和叶酸受体阴性人肺癌A549细胞，消化传代于96
孔细胞培养板，在细胞培养箱37°C， 5WC02培养12h。然后分别按一定的量加入叶酸偶联 的近红外染料探针NIR-Der-01-Folate,孵育1.5h。然后去掉培养基，用冷PBS溶液冲洗细胞 3次，然后于近红外成像系统下观察，如图4。叶酸受体阳性的人宫颈癌HeLa细胞有大量的 叶酸摄入，故荧光信号比相同条件下阴性对照A549细胞内信号强很多，证明了 NIR-Der-01-Folate荧光探针对过分表达叶酸受体的肿瘤细胞具有较高的亲和性。
二、 NIR-Der-01-Folate对荷肝癌Bel-7402肿瘤裸鼠的靶向性
培养人肝癌Bel-7402细胞，取107-108细胞接种于雌性裸鼠的右前肢腋下，待肿瘤生长到 直径2-3mm用于成像试验。取一定量的NIR-Der-01-Folate探针溶于pH 7.2 PBS溶液中，通 过尾静脉注射于裸鼠体内，通过近红外成像系统进行实时观察，各时刻的探针分布如图5所 示。肿瘤位于裸鼠右侧腋下，直径约为4-5mm。在注射NIR-Der-01-Folate约1分钟后，探针 进入肝脏，IO分钟在肿瘤处己观察到荧光信号，1 h后，可以清楚地观察到肿瘤组织，并与 正常组织有明显的区别；4小时左右，肿瘤成像清晰，12小时后，还能观测到肿瘤组织的荧 光信号，且肿瘤组织与正常组织内荧光信号之比达到最大。此时肝中荧光信号以逐渐消退。 实验结果充分展示了 NIR-Der-01-Folate探针对过分表达叶酸受体的肿瘤组织的高度识别能 力。
三、 NIR-Der-01-Folate +荷卵巢癌(HO8910)肿瘤裸鼠
培养人卵巢癌HO8910细胞，将107-108细胞接种于雌性裸鼠腋下，4-5周后肿瘤小块长到 直径2-3画用于近红外成像实验。将0.2 ml NIR-Der-01-Folate探针的PBS溶液通过尾静脉注射入小鼠体内，置于近红外成像系统下实时监测，各时刻的探针分布与图5相似，lh后就 可以清晰地观察到肿瘤组织的荧光信号，4-6小时，肿瘤组织成像到达高峰，与正常组织的信 号对比度达20: 1。
四、 NIR-Der-02-Folate +荷人宫颈癌(HeLa)肿瘤裸鼠
培养人宫颈癌HeLa细胞，将107-108细胞接种于雌性裸鼠腋下，1周后肿瘤细胞种植处 未触摸到硬块时就用于近红外成像实验。将NIR-Der-02-Folate探针的PBS溶液通过尾静脉注 射入小鼠体内，探针的体内分布如图6所示，IO分钟左右就可以清晰地观察到肿瘤细胞种植 的组织处有荧光信号；20-30分钟肿瘤组织成像到达高峰，与正常组织的对比度达15: 1以上。 肿瘤组织的信号延迟到2小时还清晰可见。且尾部未注射进尾静脉的探针也逐渐通过组织进 入了血液循环。与NIR-Der-01-Folate相比，肝脏组织内荧光信号较弱，而膀胱内很快就有较 强的荧光信号，说明NIR-Der-02-Folate探针体内代谢速度更快，且从肾-膀胱系统清除体内。
五、 NIR-Der-02-Folate +荷乳腺癌(MCF-7)肿瘤裸鼠
培养人乳腺癌MCF-7细胞，将107-108细胞接种于雌性裸鼠腋下，4~5周后肿瘤小块大小 长到直径2-3 mm用于近红外成像实验。将一定量的NIR-Der-02-Folate探针的PBS溶液通过 尾静脉注射入小鼠体内，10min左右就可以清晰地观察到肿瘤组织内荧光信号，30分钟后肿 瘤组织成像到达高峰，与正常组织的对比度达10: 1以上。
六、NIR-Der-02-LDL +肝癌细胞HepG2
培养LDL受体阳性人肝癌HepG2细胞，消化传代于24孔细胞培养板，在细胞培养箱37°C， 5% C02培养12 h。然后分别加入同比浓度的纯化后NIR-Der-02-LDL共价标记复合物与 NIR-Der-02单品染料，孵育2 h。然后小心吸取培养基，用冷PBS溶液冲洗细胞3次，经细 胞裂解液裂解后于近红外成像系统下观察，如图7所示。NIR-Der-02-LDL复合物在LDL受 体阳性的人肝癌HepG2细胞中荧光信号明显增强。
七、 NIR-Der-01-LDL+荷宫颈癌/肝癌裸鼠
培养人宫颈癌HeLa细胞和人肝癌Bel-7402细胞，分别取~106-107细胞分别接种于雌性裸 鼠的右前肢腋下和右后肢皮下。 一星期后，接种肿瘤细胞处还未触摸到肿瘤，即将O.lml的 NIR-Der-01-LDL共价标记复合物通过尾静脉注射于裸鼠体内，通过近红外成像系统进行实时 在位监测，其探针体内分布如图8所示。在尾静脉注射2小时后除了肝组织外，在两处癌细 胞种植处有较强的荧光信号，进一步说明该荧光探针能进行特异性分子识别，在肿瘤组织成 型之前就可识别肿瘤细胞，从而实现恶性肿瘤的早期诊断。
八、 NIR-Der-02-抗CEA单抗+结肠癌
培养CEA抗原过量表达的人结肠癌COLO-320细胞，将106-107细胞接种于裸鼠腋下，4-5周后肿瘤小块长到直径2-3 mm即可用于近红外成像实验。将0.2 ml具有近红外荧光特性的 NIR-Der-02-抗CEA单抗的标记复合物通过尾静脉注射入小鼠体内，30分钟后肿瘤组织有明 显的荧光信号，lh后肿瘤组织荧光信号达到峰值，与正常组织的对比度达90%以上。 九、NIR-Der-01-RGD环肽+肝癌
培养整合素avp3受体表达阳性的人肝癌Bel-7402细胞，将~106-107细胞接种于裸鼠腋下， 4-5周后待肿瘤小块长到可触摸到硬块时即可用于近红外成像实验。将0.2 ml具有近红外荧光 特性的NIR-Der-01-RGD环肽的标记复合物通过尾静脉注射入荷瘤裸鼠体内，3h时肿瘤组织 荧光信号达到峰值，与正常组织的对比度达90%以上。
图1是ICG-Der-Ol的紫外吸收光谱
图2是ICG-Der-Ol的荧光光谱
图3是ICG-Der-02的紫外吸收光谱和荧光光谱
图4是HeLa和A549细胞对复合物NIR-Der-01-Folate亲和性的差异。HeLa为叶酸受体过表 达的阳性对照；A549为叶酸受体表达的阴性对照。
图5是探针NIR-Der-01-Folate通过尾静脉注射于荷肝癌Bel-7402裸鼠体内，在近红外成像 系统进行实时观察得到的不同时刻的探针分布图。
图6是探针NIR-Der-02-Folate通过尾静脉注射与荷宫颈癌HeLa裸鼠体内的不同时刻的近 红外荧光探针的分布。
图7是探针NIR-Der-02-LDL在LDL受体阳性人肝癌HepG2细胞中的荧光信号。 图8是探针NIR-Der-01-LDL在种植有宫颈癌及肝癌的裸鼠体内荧光信号的分布。
具体实施例方式
实施例1
ICG-Der-Ol的制备
1. 分取4gl，l，2-三甲基[lH]-苯并吲哚与6g的3-溴丙酸溶于30mLl，2-二氯苯溶液，在 不断搅拌的条件下于130。C加热16个小时。待反应液冷却至室温后，向反应体系中加入二氯 甲烷，使产物析出，并再用二氯甲垸洗涤产物三次以除去未反应物，最终得到较纯的产物1，1，2-三甲基[lH]-苯并吲哚-3-丙酸(暗紫红色)。
2. 分取4gl,l,2-三甲基[lH]-苯并吲哚与8g碘己酸溶于30mL乙睛中，在不断搅拌的条件下加热至沸，回流4天。待反应结束后，冷却至室温，向反应体系中加入二氯甲烷，使 产物析出，并再用二氯甲烷洗涤产物三次以除去未反应物，最终得到较纯的产物l,l,2-三甲基 [lH]-苯并吲哚-3-己酸(棕色)。
3.取700pL乙酸酐溶于2.5mL二氯甲烷，在不断搅拌下将获得的溶液逐滴加入10 mL 冷的戊烯二醛双苯胺盐酸盐(3 g)和二异丙基乙胺(2mL)的二氯甲烷悬浮液中。所得的澄清溶 液继续搅拌0.5 h后，然后再逐滴加入到2.5 g U,2-三甲基[lH]-苯并吲哚-3-丙酸、5 g 1，1，2-三甲基[lH]-苯并B引哚-3-己酸与2 g乙酸钠组成的30 mL乙腈溶液。混合物于50。C下回流反 应llh后，冷却至室温，溶液中有大量的沉淀。加入二氯甲烷，过滤，弃去上清夜。再依次 用二氯甲烷，5%HC1溶液(或1%三氟乙酸)洗漆，干燥，最后经硅胶柱分离可以得到 ICG-Der-Ol，呈暗绿色。
实施例2
ICG-Der-02的制备
1. 取30 mL冰醋酸加入到对肼基苯磺酸(6g)、甲基异丙基酮(7mL)和醋酸钠(2 g) 的混合物中。将获得的棕色的悬浮液加热至沸，并回流16小时。随后用烧结玻璃过滤器趁热 过滤，去掉未反应的悬浮物。待滤液冷至室温，用二氯甲垸析出产品，产品为棕色(2,2，3-三甲基[3H]-卩引哚-5-磺酸)。
2. 取50mL邻二氯苯加入到2,2，3-三甲基[3H]-哼l哚-5-磺酸(15 g)和1，3-丙磺酸内脂(4 mL)。将混合物加热至130。C，并保持15小时。制得的固体用二氯甲烷研磨，最后制得产品 2,2，3-三甲基-5-磺酸-l-(3-磺酸-丙基)-[3H]』引哚。
3. 取20 mL无水乙醇加入到2,2,3-三甲基-5-磺酸-1-(3-磺酸-丙基)-[3H]-n引哚(500 mg)、 N- [(3-(anilinomethylene)-2-chloro画1 -cyclohexen-1 -yl)methylene]aniline monohydrochloride (100 mg)与乙酸钠(100mg)，并加热回流2小时。待反应液冷至室温，利用悬蒸仪将溶剂去除。最 后，利用硅胶柱分离获得纯的绿色碳菁染料。
4. 取200mg上面制得的碳菁染料溶于10mLDMF中，再加入100 p L巯基丙酸，反应 15小时。用二氯甲烷析出粗产品，最后经硅胶柱分离得纯的水溶性近红外染料ICG-Der-02。
实施例3
叶酸偶联ICG-Der-Ol的近红外荧光探针复合物的制备
称取18 mg的叶酸(Folic acid)溶于5 mL无水二甲亚砜(DMSO)中，加入15 mg 1-乙基-3(3-二甲基丙胺)碳二亚胺和7mg N-羟基琥珀酰亚胺(EDCI/NHS)活化2小时，将活 化液滴加到含200mg的双氨基聚乙二醇(PEG-bis-amine，分子量4， 000)的无水二甲亚 砜(DMSO)溶液中，避光室温反应8小时；通过硅胶柱分离纯化获得叶酸偶联的聚乙二醇
(Folate-PEG)。取2mg的含有羧基官能团的ICG-der-Ol近红外染料溶于1 mL无水DMSO 中，加入催化剂EDCI/NHS活化2小时，然后将活化液滴加入含有叶酸偶联的聚乙二醇
(Folate-PEG)的pH 9.4的碳酸盐缓冲液中，避光反应12小时。将反应液于pH 7.2的磷酸 盐缓冲液中透析3天和去离子水中透析1天并冻干(透析袋，截留分子量为3，500)，然后通 过反相高效液相色谱柱，用甲醇/水洗脱，纯化出叶酸偶联近红外染料的产品
(Folate-PEG-ICG-der-Ol )。
实施例4
叶酸偶联的ICG-der-02近红外染料的制备方法
称取22 mg的叶酸(Folic acid)溶于5 mL无水二甲亚砜(DMSO)中，加入10 mg 1-乙基-3(3-二甲基丙胺)碳二亚胺和7mg N-羟基琥珀酰亚胺(EDCI/NHS)活化2小时，将活 化液滴加到含200mg的双氨基聚乙二醇(PEG-bis-amine，分子量4， 000)的无水二甲亚 砜(DMSO)溶液中，避光室温反应8小时；通过硅胶柱分离纯化获得叶酸偶联的聚乙二醇 (Folate-PEG)。取2 mg的含有羧基官能团的ICG-der-02近红外染料溶于无水DMSO中，加 入催化剂EDCI/NHS活化2小时，然后将活化液滴加入含有叶酸偶联的聚乙二醇(Folate-PEG) 的pH9.4的碳酸盐缓冲液中，避光反应12小时。将反应液于去离子水中透析3天(透析袋， 截留分子量为3，500)，然后冻干；再通过葡聚糖凝胶柱LH-20 (S印hadexLH-20)，用氯仿/ 甲醇洗脱，纯化出叶酸偶联近红外染料的产品(Folate-PEG-ICG-der-02)。
实施例5
低密度脂蛋白-ICG-Der-Ol复合物的制备方法
精密称取lmg含羧基官能团的近红外染料ICG-Der-01，溶于lml无水二甲亚砜(DMSO)， 依次加入催化剂l-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI) lmg和N-羟基琥珀酰亚 胺(NHS) 0.8mg，避光室温活化3小时，得活化液。将活化液边振摇边缓慢滴加入20ml低 密度脂蛋白(LDL)提取液中(约48mg)，避光4。C反应12小时，将反应液低温高速离心后， 小心吸取上清液，以葡聚糖凝胶柱G-50柱层析分离，收集前色带流出液即为LDL-ICG-Der-Ol 复合物，过滤除菌后密闭避光保存于4"C冰箱中备用。实施例6
低密度脂蛋白-ICG-Der-02复合物的制备方法
精密称取lmg含羧基官能团的近红外染料ICG-Der-02，溶于lml无水二甲亚砜(DMSO)， 依次加入催化剂l-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI) lmg和N-羟基琥珀酰亚 胺(NHS) 0.8mg，避光室温活化3小时，得活化液。将活化液边振摇边缓慢滴加入20ml低 密度脂蛋白(LDL)提取液中(约40mg)，避光4。C反应12小时，将反应液低温高速离心后， 小心吸取上清液，以PH 7.4的磷酸盐缓冲液(含0.01%叠氮化钠)充分透析，直至透析外液 中无近红外染料ICG-Der-02残留为止，透析内液即为LDL-ICG-Der-02复合物，过滤除菌后 密闭避光保存于4'C冰箱中备用。
权利要求
1、一种结构式为I或II的近红外有机荧光染料
2、 一种近红外荧光分子探针，由权利要求1的结构式I或II的近红外荧光染料与特异性分 子的配体进行共价结合而得。
3、 权利要求2的近红外荧光分子探针，其中特异性分子的配体选自叶酸、低密度脂蛋白、 RGD氨基酸序列或单克隆抗体。
4、 一种权利要求2的近红外荧光分子探针的制备方法，当特异性分子的配体含有羧基官能团 时，制备方法包括由近红外染料上羧基与双氨基聚乙二醇反应，然后再与特异性分子的 配体的羧基反应。
5、 一种权利要求2中的近红外荧光分子探针，当特异性分子的配体含有氨基官能团时，制备 方法包括由近红外染料上羧基与特异性分子的配体上氨基反应即得。
6、 权利要求2的近红外荧光分子探针用于诊断肿瘤疾病的用途。
全文摘要
本发明涉及特异性分子识别诊断试剂领域，具体公开了结构式I和II的近红外荧光染料，本发明还公开了结构式I或II的近红外荧光染料与特异性分子的配体进行共价结合而得的近红外荧光分子探针。本发明的近红外荧光分子探针可用于肿瘤疾病的早期诊断。
文档编号C09B23/08GK101440282SQ20081024479
公开日2009年5月27日 申请日期2008年12月18日 优先权日2008年12月18日
发明者飞 刘, 邓大伟, 钱志余, 陈新洋, 顾月清 申请人:中国药科大学