四色荧光标记可逆终端及其在dna测序中的用途
【专利摘要】本发明公开了一种四色荧光标记可逆终端及其在DNA测序中的用途；所述可逆终端的结构式如式(I)所示：(I)；其中，R1为三磷酸盐；R2为H或者OH；碱基为U，C，A，G或其衍生物；连接单元为在温和条件下可以断裂的双官能团化合物；荧光基团选自BODIPY、荧光素、罗丹明、香豆素、呫吨、花青、芘、酞菁、alexa、squarene染料、产生能量转移染料的组合以及其衍生物中的一种。本发明的可逆终端可用于DNA单分子测序；同时，本发明的可逆终端的合成所需原料简单易得，合成过程均为常规化学反应，可用于大规模推广使用，并且生物学评价结果表明该类可逆终端能完全满足高通量测序的生化反应要求，具备很好的实用前景。
【专利说明】四色荧光标记可逆终端及其在DNA测序中的用途
【技术领域】
[0001]本发明涉及化学合成和生物化学领域，具体涉及一类四色荧光标记可逆终端及其在DNA测序中的用途。
【背景技术】
[0002]DNA测序技术是现代生命科学和医学研究的重要手段之一。DNA测序从1977年的Sanger测序技术(一代测序)开始，在三十几年的时间里，飞速发展。测序的通量大幅提高而成本急剧下降，有人甚至认为其发展的速度打破了半导体工业界已有的摩尔定律预算的速度。二代高通量平行测序技术的出现是测序技术飞速发展的集中体现。采用第一代测序技术，人类基因组计划(HGP)耗资30亿美元完成人整个基因组(30亿个碱基)的序列测定。而目前的二代测序的最新技术仅需5000美元左右就能完成人整个基因组测序。
[0003]虽然如此，二代测序的成本和技术方面依然存在不足，不能满足基础科学和临床医学对测序的要求。单分子测序技术(三代测序技术)应运而生。三代测序技术的核心是直接对单个DNA分子进行测序，不做任何的DNA扩增反应，从而减少成本，提高通量。单分子测序技术虽然已有商业化产品，但是都还存在技术上的难点，未能大规模应用。
[0004]目前市场上的高通量测序平台被少数几家国外产品所垄断，尤其令人忧虑的是，国外公司凭借对测序试剂的控制，几乎完全控制了国内的测序市场，即便是测序硬件上我们能有所突破，在测序试剂等配 套产品上我们还将受制于人。因此，自主研发可适用于二代测序甚至是三代测序平台的测序试剂，将对改变目前的市场格局、建立我国自主的测序平台具有战略性的意义。为此，国家863、973和“十二五”生物技术发展规划都将研发新一代测序技术及配套产品的研发列为重点发展的对象。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供一类四色荧光标记可逆终端及其在DNA测序中的用途；该可逆终端具有氧化还原敏感特性。本发明是在已有工作的基础上，通过多学科交叉，首先合成了新型四色荧光标记核苷酸，并发展基于该新型核苷酸的DNA延伸反应，实现单个荧光分子超灵敏光学检测技术并最终实现具有单分子测序能力的三代测序技术原型机。
[0006]本发明的目的是通过以下技术方案来实现的:
[0007]本发明涉及一种四色荧光标记可逆终端，其结构式如式(I)所示:
[0008]
【权利要求】
1.一种四色荧光标记可逆终端，其结构式如式(I)所示:
2.如权利要求1所述的四色荧光标记可逆终端，其特征在于，所述可逆终端的结构式如式(II)所示:
3.如权利要求1所述的四色荧光标记可逆终端，其特征在于，所述可逆终端的结构式如式(III)所示:
4.如权利要求1所述的四色荧光标记可逆终端，其特征在于，所述可逆终端的结构式如式(IV)所示:
5.如权利要求1所述的四色荧光标记可逆终端，其特征在于，所述可逆终端的结构式如式(V)所示:
6.如权利要求5所述的四色荧光标记可逆终端，其特征在于，所述可逆终端是通过如下步骤合成的: Α、化合物I的合成:半胱胺盐酸盐在有机溶剂中加入三苯基氯甲烷反应，重结晶得白色固体，即化合物I ; B、化合物2的合成:化合物I在碱性条件下与荧光素FTTC反应得化合物2； C、化合物3的合成:将化合物2去保护即得化合物3； D、化合物7的合成:丙炔胺与三氟乙酸甲酯反应得化合物7； Ε、化合物8的合成:5_碘-2’-脱氧胞苷与化合物7在Pd催化剂作用下发生偶联反应得化合物8 ； F、化合物4的合成:化合物8接三磷酸即得化合物4； G、化合物5的合成:化合物4与SPDP反应即得化合物5； H、化合物6的合成:化合物5与化合物3发生二硫键交换反应即得化合物6;所述化合物6即具有式(V)所示的可逆终端。
7.如权利要求5所述的四色荧光标记可逆终端，其特征在于，所述可逆终端是通过如下步骤合成的:A、化合物F2的合成:在冰水浴搅拌条件下，摩尔比为1.0: (1.2~2)的丙炔胺与三氟乙酸甲酯反应，得化合物F
8.如权利要求1所述的四色荧光标记可逆终端，其特征在于，所述可逆终端的结构式如式(VI)所示:
9. 如权利要求8所述的四色荧光标记可逆终端，其特征在于，所述可逆终端(VI)是通过如下步骤合成的: A、化合物Cy5-SH的合成:将荧光素Cy5活性酯与半胱胺反应即得化合物Cy5_SH； B、化合物dATP(AP3) -SPDP的合成:将化合物dATP (AP3)与SPDP反应得化合物dATP(AP3)-SPDP: C、化合物dATP-SS-Cy5的合成:化合物dATP-SPDP与Cy5_SH在Na3PO4-EDTA缓冲溶液中发生硫醇交换反应即得化合物dATP-SS-Cy5 ;该化合物dATP-SS_Cy5即具有式(VI)所示的可逆终端。
10.如权利要求1所述的四色荧光标记可逆终端，其特征在于，所述可逆终端的结构式如式(VII)所示:
11.如权利要求10所述的四色荧光标记可逆终端，其特征在于，所述可逆终端是通过如下步骤合成的: A、化合物a2的合成:化合物al
12.如权利要求1所述的四色荧光标记可逆终端，其特征在于，所述可逆终端的结构式如式(VIII)所示:
13.如权利要求12所述的四色荧光标记可逆终端，其特征在于，所述可逆终端是通过如下步骤合成的: Α、化合物的合成:以甲醇为溶剂，在TEA存在的条件下，半胱胺盐酸盐在冰浴搅拌条件下与2-羟乙基二硫化反应，得化合物曝，所述半胱胺盐酸盐、2-羟乙基二硫化物和TEA的摩尔比为1:(1~2):(2~3): B、化合物TexasRedl的合成:以无水DMF为溶剂，在TEA存在的条件下，化合物
与 Texas Red-X 避光反应，得化合物 Texas Redl ；所述 Texas Red_X、w~S-S^oh和TEA的摩尔比为1: (I~4):(10~15)； C、化合物dGTP-S-S-TexasRed2的合成:以NaHC03/Na2C03的缓冲溶液为溶剂，化合物 ClGTP-NH2 与 Texas Redl 反应，得化合物 dGTP-S-S-Texas Red2;所述 Texas Redl 和dGTP-NH2的摩尔比为1: (I~2);所述化合物dGTP-S-S-Texas Red2即具有式(VIII)所示结构式的可逆终端。
14.如权利要求1所述的四色荧光标记可逆终端，其特征在于，所述可逆终端的结构式如式(IX)所示:
15.如权利要求14所述的四色荧光标记可逆终端，其特征在于，所述可逆终端是通过如下步骤合成的: A、化合物的合成:以甲醇为溶剂，在TEA存在的条件下，半胱胺盐酸盐在冰浴搅拌条件下与2-羟乙基二硫化物~OH反应，得化合物_~3-?所述半胱胺盐酸盐、2-羟乙基二硫化物和TEA的摩尔比为1:(1~2):(2~3): B、化合物FITCl的合成:以无水DMF为溶剂，在TEA存在的条件下，化合物關~s-s~OH与FITC避光反应，得化合物FITCl ;所述TEA的摩尔比为1: (I~4): (10~15)； C、化合物dCTP-S-S-FITC的合成:以NaHC03/Na2C03的缓冲溶液为溶剂，化合物ClCTP-NH2与FITCl反应，得化合物dGTP-S-S_FITC ;所述FITCl和dCTP_NH2的摩尔比为1:(1~2);所述化合物dCTP-S-S-FITC即具有式(IX)所示结构式的可逆终端。
16.如权利要求1所述的四色荧光标记可逆终端，其特征在于，所述可逆终端的结构式如式⑴所示:
17.如权利要求16所述的四色荧光标记可逆终端，其特征在于，所述可逆终端是通过如下步骤合成的: A、化合物H2N~S-S~w的合成:以甲醇为溶剂，在TEA存在的条件下，半胱胺盐酸盐在冰浴搅拌条件下与2-羟乙基二硫化物反应，得化合物_~3-5^<? r所述半胱胺盐酸盐、2-羟乙基二硫化物和TEA的摩尔比为1:(1~2):(2~3): B、化合物Cy51的合成:以无水DMF为溶剂，在TEA存在的条件下，化合物 滅~―与Cy5避光反应，得化合物Cy51 ;所述?和TEA的摩尔比为 1:(1 ~4):(10 ~15)； C、化合物dATP-S-S-Cy5的合成:以NaHC03/Na2C03的缓冲溶液为溶剂，化合物dATP_NH2与Cy51反应，得化合物dATP-S-S-Cy5 ;所述Cy51和dATP_NH2的摩尔比为1: (I~2);所述化合物dATP-S-S-Cy5即具有式(X)所示结式的可逆终端。
18.一种如权利要求1~17中任一项所述的四色荧光标记可逆终端在DNA测序中的用途。
【文档编号】C09K11/06GK103484106SQ201310401580
【公开日】2014年1月1日 申请日期:2013年9月5日 优先权日:2013年9月5日
【发明者】沈玉梅, 邵志峰, 赵小东, 汤道年, 龚兵, 李小卫, 江敏, 刘亚智, 魏晓飞, 伍新燕 申请人:上海交通大学