用于检测过氧亚硝酸盐的二芳基胺-基荧光探针的制作方法
【专利摘要】在本文中提供了可用作测量、检测和/或筛选过氧亚硝酸盐的试剂的改进的荧光化合物和探针。本发明的荧光化合物可产生荧光色，如绿色、黄色、红色或远红色。在本文中还提供了用于选择性染色活细胞的线粒体中的过氧亚硝酸盐的荧光化合物。在本文中还提供了可用于直接或间接测量化学样品和生物样品，如生物活体中的细胞和组织中过氧亚硝酸盐的存在和/或量的方法。还提供了用于检测或筛选过氧亚硝酸盐或可提高或降低化学和生物样品中的过氧亚硝酸盐含量的化合物的高通量筛选方法。
【专利说明】用于检测过氧亚硝酸盐的二芳基胺-基荧光探针
[0001] 对相关申请的交叉引用 本申请要求2012年1月30日提交的美国临时申请序号No. 61/592, 122的权益，其全 文并入本文作为参考。
[0002] 背景 荧光技术从在化学到许多生物学领域越来越受到关注。在某些情况中，使用荧光分子 检测被分析物在食品和环境样品中的存在。一些灵敏和定量荧光检测装置对体外生化检 测，如DNA测序和血糖量化是理想的。此外，某些荧光探针是追踪活细胞中的分子和生理学 事件所必需的。最后，在许多高通量筛选中常使用荧光测量。
[0003] 荧光技术优于其它类型的光学测量的主要优点包括灵敏度、简单性和大量分子信 息。由于在大多数化学和生物样品中通常低水平的荧光背景，荧光测量非常灵敏。随着荧 光仪器，如共焦和多光子（multi-photo)荧光显微术中的进步，细胞事件和生物物种动力 学的三维成像有可能实时实现。
[0004] 特别地，荧光在生物科学中通常通过记录或成像相应生物分子的某些荧光探针在 特定波长(在此没有由激发光引起的细胞固有荧光）下的荧光发射而用作追踪或分析生物 分子，如蛋白质、金属离子、活性氧物质（ROS) /活性氮物质（RNS)等的非破坏性途径。
[0005] 在生命系统的这些令人感兴趣的生物分子中，活性氧物质（ROS)和活性氮物质 (RNS)在荧光探针的发展中因其在生物样品中的检测而受到科学界的大量关注。活性氧物 质（ROS)和活性氮物质（RNS)被科学家公认为是在生命系统中具有高反应性的极小无机或 有机分子。有各种形式的ROS和RNS，包括自由基，如超氧自由基、羟基自由基、一氧化氮、 二氧化氮和有机过氧自由基；以及非自由基物类，如过氧化氢、单线态氧、臭氧、亚硝酸、过 氧亚硝酸盐和次氯酸盐。ROS和RNS是细胞呼吸的副产物。在正常条件下，ROS和RNS以极 低量存在并在细胞信号传导中起到重要作用；而在氧化应激过程中，ROS和RNS水平显著提 高，这可以对各种生物分子如蛋白质、脂质和DNA造成严重损害。在许多人类疾病，如心血 管疾病、炎性疾病、代谢疾病、癌症和中枢神经系统疾病中涉及ROS和RNS的过度生成。因 此，非常需要可灵敏和选择性地测量、检测或筛选某些ROS和RNS以研究它们在体外和体内 的生理作用的化学品。
[0006] 过氧亚硝酸盐在各种形式的ROS和RNS中具有最强的氧化力，它们的选择性检 测非常适用于清楚解释它们在生物活体中的关键作用。过氧亚硝酸盐（ONO(T)是通过一 氧化氮（NO)和超氧化物（〇Γ)在1比1化学计量下的扩散控制反应U = 0.4-1. 9X 101° Μ?)体内形成的短寿命氧化剂物类。过氧亚硝酸盐的氧化剂反应性非常依赖于pH且过 氧亚硝酸根阴离子及其质子化形式过氧亚硝酸都可直接参与与生物分子的一电子和二电 子氧化反应。ONOCT的病理学活性也与其与生物学上普遍存在的CO 2的反应相关联，由此以 大约35%收率产生高反应性自由基COf和NO/。因此，过氧亚硝酸盐可将酪氨酸硝酸化并 将蛋白质、脂质和生物分子的铁和硫物质氧化。类似于生物活体中的其它氧化剂，过氧亚 硝酸盐及其质子化形式与有益和有害效应都相关联。但是，若干研究已暗示，过氧亚硝酸 盐促成许多人类疾病如缺血再灌注损伤、类风湿性关节炎、脓毒性休克、多发性硬化症、动 脉粥样硬化、中风、炎性肠病、癌症和若干神经退行性疾病中的组织损伤（MacMillan-Crow， L. Α·等人，Jcaol 5bi.1996，似，11853 - 11858 ;Rodenas, J.等 )κ, Free Radical. Biol. & Med. 2WK), 28，?Ι4：'CuzzocTcea, S.等）κ, Pharmacol Rev. 2001, 53, 135 - 159 ；Szabo, C. Toxicol. Lett. 2003, 140, 105 - 112 ；ffhite, C. R.等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1994, 91, 1044 - 1048 ；Lipton, S. A.等 k，Nature 1%?), 364, 626 - 632 ;Pappolla, Μ. A.等人，J Afeara/ 2000， 107, 203 - 231 ；Beal, M. F. , Free Radical Biol. & Med. 2002，797 - 803)。
[0007] 目前，具有绿色荧光色的过氧亚硝酸盐探针可得(美国专利申请序号No. 12/417, 672);但是，现有的绿色荧光探针在细胞测定中表现出有限的细胞内保留。此外，具 有其它荧光色或具有定位在所需胞内隔室中的能力的过氧亚硝酸盐探针少见。长波长荧光 探针，如黄色、红色、远红或近红外（NIR)荧光探针在生物样品中提供可靠成像方面比绿色 探针更有吸引力和更有利，因为它们有效避免来自在绿色区中的细胞自发荧光的干扰并具 有能够更深入渗透细胞和组织的更长激发/发射波长。因此，需要具有合意和可靠得多的 过氧亚硝酸盐检测和成像的新一代荧光探针。
[0008] 概述 本发明提供用于灵敏和特异性检测过氧亚硝酸盐的改进的荧光（fluorogenic)或荧光 (fluorescent)化合物和探针。在一个实施方案中，在本文中提供了产生荧光色，如绿色、黄 色、红色或远红色的荧光化合物。在本文中还提供了用于选择性染色活细胞的线粒体中的 过氧亚硝酸盐的荧光化合物。
[0009] -方面，本发明提供式（I)或（II)所示的荧光化合物：
【权利要求】
1.式⑴或（π)的化合物：
或其互变异构体； 其中N是氮原子并经由单共价键连接到Q和R1上； R1是Η、烧基、齒代烧基、稀基、块基、烧氧基烧基、杂烧基、环烧基、环稀基、环块基、杂环 基、氨基烷基、芳基烷基、烷氧基、羧基烷基、烷基氨基、烷氧基氨基、烷基酰胺基、烷氧基酰 胺基或酰基； R2、R3、R4、R5、R6和R 7各自独立地为H、F、Cl、Br、I、CN、烷基、卤代烷基、杂烷基、烯基、 炔基、芳烷基、芳基、烷芳基、杂环基、环烷基、环烯基、环炔基、羟烷基、氨基烷基、氨基、烷基 氨基、芳基氨基、二烷基氨基、烷基芳基氨基、二芳基氨基、酰胺基、羟基、巯基、硫代烷基、烷 氧基、烧硫基、烧氧基烧基、芳氧基、芳基烧氧基、醜氧基、硝基、氣基甲醜基、二氣甲基、苯氧 基、苄氧基、膦酸、磷酸酯、磺酸（-SO 3H)、磺酸酯、磺酰胺、-C(=0) - P1或-C(=0) - M - P2 ; P1和P2各自独立地为氧、齒素、烧氧基、轻基、疏基、烧基、稀基、块基、环烧基、环稀基、 环炔基、芳基、烷芳基、芳基烷基、氨基甲酸酯、氨基、烷基氨基、芳基氨基、二烷基氨基、烷基 芳基氨基、二芳基氨基、烷硫基、杂烷基、烷基三苯基鱗或具有3至7个环原子的杂环基；M 是亚烷基、亚烯基、亚炔基、亚芳基、亚芳烷基或亚烷芳基； A 是 ORici 或 NR11R12 ; 其中Rici是H、烧基、稀基、块基、烧氧基烧基、杂烧基、环烧基、环稀基、环块基、杂环基、 氨基烷基、芳基、烷芳基、芳基烷基、羧基烷基、烷氧基羰基、酰基或氨基羰基； 其中R11和R12各自独立地为H、烷基、卤代烷基、烯基、炔基、烷氧基烷基、杂烷基、环烷 基、环烯基、环炔基、杂环基、氨基烷基、芳基烷基、烷氧基、酰基、羧基烷基、磺基烷基、羧基 烷基的盐、磺基烷基的盐、或羧基烷基或磺基烷基的酯或酰胺；或R n与R12结合形成饱和 5-或6-元杂环，其是哌啶、吗啉、吡咯烷或哌嗪，它们各自任选被烷基、羧酸、羧酸盐或醇的 羧酸酯取代；或Rn与R4结合，或R12与R3结合，或这两者形成饱和或不饱和或进一步与芳 基或杂芳基环稠合并任选被一个或多个烷基、羧酸、磺酸（-SO 3H)或它们的盐、酯或酰胺衍 生物取代的5-或6-元环； B 是 0 或 N+R11R12 ; Z 是 0、S、NR13、CR13R14、SiR13R 14、GeR13R14 或 SnR13R14 ; 其中R13和R14各自独立地为Η、烷基、卤代烷基、杂烷基、烯基、炔基、芳烷基、芳基、烷 芳基、杂环基、环烧基、环稀基、环块基、轻烧基、氣基烧基、轻基、疏基、硫代烧基、烧氧基、烧 硫基、烷氧基烷基、芳氧基、芳基烷氧基、酰氧基、氨基甲酰基、三氟甲基、苯氧基、苄氧基、膦 酸、磷酸酯、磺酸（-SO3H)、磺酸酯、磺酰胺、羧酸、羧酸酯或羧酰胺；或R 13与R14结合形成任 选被烷基、羧酸、羧酸盐或醇的羧酸酯取代的饱和5-或6-元杂环； R8是H、CF3、CN、羧酸、羧酸盐或醇的羧酸酯；或R8是任选被一个或多个F、Cl、Br、 I、羧酸、羧酸盐、醇的羧酸酯、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、烷氧基、烷基三苯基鱗、磺酸 (-SO3H)、磺酸酯（-SO3R15)或磺酰胺（-SO2NR 15R16)取代的饱和或不饱和烷基，其中R15和R16 各自代表任选被一个或多个？、(：1、81*、1、羧酸、羧酸盐、醇的羧酸酯、氨基、烷基氨基、二烷基 氨基、烷氧基或烷基三苯基鱗取代的饱和或不饱和的环烷基或非环烷基；或R 8具有式
其中R17、R18、R19、R2tl和R 21各自独立地为H、F、Cl、Br、I、CN、硝基、羧酸、羧酸盐、磺 酸（-SO3H)、磺酸酯（-SO3R15)、磺酰胺（-SO2NR 15R16)、羟基、叠氮化物、烷基、烯基、炔基、杂 烷基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、烷基芳基、芳基烷基、杂环基、烷氧基、烷氧基烷基、烷 氧基烧氧基、醜基、烧基撰基烧基、齒代烧基撰基烧基，如二氣甲基撰基烧基、氣基烧基、竣 基烧基 > 疏基 >烧硫基 > 氣基 > 烧基氣基> 二烧基氣基 > 烧氧基撰基 > 烧氧基撰基烧基> 氣基撰 基、烷基氨基羰基、二烷基氨基羰基或芳基酰胺基，其烷基或芳基任选被一个或多个F、C1、 Br、I、竣酸、竣酸盐、醇的竣酸醋、氣基、烧基氣基、二烧基氣基、烧氧基、烧基二苯基鱗、横酸 (-SO3H)、磺酸酯（-SO 3R15)或磺酰胺（-SO2NR15R16)取代；或 R17 和 R18 -起、R18 和 R19 -起、 R19和R2tl -起、或R2tl和R21 -起形成式（III)的与苯基环稠合的5-或6-元环烷基、杂环 基、芳基或杂芳基环部分，其任选进一步被一个或多个F、Cl、Br、I、羧酸、羧酸盐、醇的羧酸 醋、氣基、烧基氣基、二烧基氣基、烧氧基、疏基、烧硫基、烧基二苯基鱗、横酸（ _S03H)、横酸 酯（-SO3R15)或磺酰胺（-SO 2NR15R16)取代； R9是H、羟基、CN或烷氧基；或R8与R9结合形成5-元螺内酯或螺内酰胺环或5-元螺 磺内酰胺环；或R9与R17或R21结合形成5-或6-元螺内酯或螺内酰胺环或5-或6-元螺磺 内酯或螺磺内酰胺环，其任选并独立地被H、F或CH 3取代；且 Q是式（IV)所示的取代苯基：
其中R22、R23、R24、R25和R 26各自独立地为H、羟基、烷基、烯基、炔基、杂烷基、环烷基、环烯 基、环炔基、芳基、烷基芳基、芳基烷基、杂环基、烷氧基、烷氧基烷基、烷氧基烷氧基、酰基、 烧基撰基烧基、齒代烧基撰基烧基，如二氣甲基撰基烧基、氣基烧基、竣基烧基、疏基、烧硫 基> 氣基 > 烧基氣基> 二烧基氣基 > 烧氧基撰基 > 烧氧基撰基烧基> 氣基撰基> 烧基氣基撰基> 二烷基氨基羰基、或芳基酰胺基，其烷基或芳基任选被一个或多个F、Cl、Br、I、羧酸、羧酸 盐、醇的竣酸醋、氣基、烧基氣基、二烧基氣基、烧氧基、烧基二苯基鱗、横酸（_S03H)、横酸醋 (-SO 3R15)或磺酰胺（-SO2NR15R16)取代；或 R22 和 R23 -起、R23 和 R24 -起、R24 和 R25 -起、或 R25和R26 -起形成式（IV)的与苯基环稠合的5-或6-元环烷基、杂环基、芳基或杂芳基环 部分，其任选进一步被一个或多个F、Cl、Br、I、羧酸、羧酸盐、醇的羧酸酯、氨基、烷基氨基、 二烷基氨基、烷氧基、巯基、烷硫基、烷基三苯基鱗、磺酸（-SO 3H)、磺酸酯（-SO3R15)或磺酰胺 (-SO2NR 15R16)取代。
2. 权利要求1的化合物，其中R9,在与R8结合形成5-元螺内酯或螺内酰胺环或5-元 螺磺内酰胺环时，是氧或取代氮。
3. 权利要求1的化合物，其中式（I)或（II)的Q是式（IV)所示的取代苯基。
4. 权利要求3的化合物，其中R24是与过氧亚硝酸盐反应的基团。
5. 权利要求4的化合物，其中R24是OR27、CH2CH2COR 28或NR29R3tl,其中R27是氢或选自烷 基、烷氧基烷基、烷酰基或聚醚的基团；R 28是选自CF3、卤素取代的低级烷基或（C=O) - O-W1 的吸电子基团，其中W1是选自烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、烷芳基或芳 基烷基的基团；R 29和R3tl独立地为氢或选自如下的基团：氢或选自烷基、烯基、炔基、烷氧基 烷基、烷酰基、烯酰基、炔酰基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、烷芳基、芳基烷基、芳酰基或 聚醚的基团。
6. 权利要求1的化合物，其中式⑴或（II)的R1是CH3。
7. 权利要求1的化合物，其中R8是式（III)。
8. 权利要求1的化合物，其中所述化合物具有式（II)或其互变异构体的结构，且其中 B是0, Z是0,且R8是式（III)。
9. 权利要求8的化合物，其中R17、R18、R19和R2tl的至少一个是羧基。
10. 权利要求8的化合物，其中R21是H、CH3、OMe或C00H。
11. 权利要求8的化合物，其中式（III)的R8基团包含一个或多个羧基，其中至少一个 羧基进一步与具有结构（HN((CH 2)nCOOH)2的亚氨基二烷基羧酸酯缀合，其中η = 1、2或3。
12. 权利要求8的化合物，其中所述化合物具有（V'）或其互变异构体（VI)的结构
13. 权利要求8的化合物，其中COOH基团用甲基、乙基或乙酰氧基甲基（AM)酯化。
14. 权利要求8的化合物，其中酚基被乙酰基、丙酰基或丁酰基酰化或被乙酰氧基甲基 (AM)保护。
15. 权利要求8的化合物，其中所述化合物具有式1-10之一：
16. 权利要求1的化合物，其中所述化合物具有式（II)或其互变异构体的结构，且其中 B 是 N+R11R12, Z 是 0,且 R8 是式（III)。
17. 权利要求16的化合物，其中所述化合物具有（VII'）或其互变异构体（VIII)的结 构
18. 权利要求17的化合物，其中COOH基团用甲基、乙基或乙酰氧基甲基（AM)酯化。
19. 权利要求17的化合物，其中R17 - R2tl的至少一个是烷基化基团。
20. 权利要求19的化合物，其中所述烷基化基团具有式CR31R32X,其中R31和R 32独立地 为H和CH3，且X是CUr或I。
21. 权利要求16的化合物，其中所述化合物具有式（IX)或（X)的结构：
22. 权利要求21的化合物，其中式（IX)或⑴中的R12是CVltl烷基或烯烃。
23. 权利要求21的化合物，其中式（IX)或⑴中的R12是在末端位置被羧基取代的Cpltl 烷基或烯烃。
24. 权利要求21的化合物，其中R12是乙基、羧基甲基、羧基乙基或羧基丙基。
25. 权利要求16的化合物，其中所述化合物具有式11-21之一：
O
26. 权利要求1的化合物，其中所述化合物具有式（II)的结构，且其中B是0, Z是 YR13R14,其中 Y 是 Si、Ge 或 Sn,且 R8 是式（III)。
27. 权利要求26的化合物，其中R13和R14独立地为CH3或苯基。
28. 权利要求26的化合物，其中R21是C00H，且所述化合物具有（XI'）或其互变异构 体（XII)的结构
29. 权利要求28的化合物，其中COOH基团用甲基、乙基或乙酰氧基甲基（AM)酯化。
30. 权利要求28的化合物，其中酚基被乙酰基、丙酰基或丁酰基酰化或被乙酰氧基甲 基（AM)保护。
31. 权利要求26的化合物，其中所述化合物具有式22-24之一
32. 权利要求1的化合物，其中所述化合物具有式（II)的结构，且其中B是N+R11R12, Z 是 YR13R14,其中 Y 是 Si、Ge 或 Sn,且 R8 是式（III)。
33. 权利要求32的化合物，其中R21是C00H，且所述化合物具有（XIII'）或其互变异 构体（XIV)的结构
O
34. 权利要求32的化合物，其中R11与R4结合，或R12与R3结合，或这两者形成饱和 或不饱和或可以进一步与芳基或杂芳基环稠合并可以任选被一个或多个烷基、羧酸、磺酸 (-SO3H)或它们的盐、酯或酰胺衍生物取代的5-或6-元环。
35. 权利要求32的化合物，其中COOH基团用甲基、乙基或乙酰氧基甲基（AM)酯化。
36. 权利要求32的化合物，其中酚基被乙酰基、丙酰基或丁酰基酰化或被乙酰氧基甲 基（AM)保护。
37. 权利要求32的化合物，其中所述化合物具有式（XV)或（XVI)
〇
38. 权利要求32的化合物，其中所述化合物具有式25-29之一：
39. 权利要求1的化合物，其中所述化合物包含一个或多个游离羧基，其中至少一个羧 基经酰胺键连接与带正电荷的三苯基鱗基团缀合。
40. 权利要求39的化合物，其中所述化合物与所述三苯基鱗基团之间的连接具有下式 (XVII)或（XVIII):
其中 η = 1、2、3、4、5、6、7、8、9 或 10。
41. 权利要求39的化合物，其中所述化合物具有式30-33之一：
〇
42. 包含权利要求1的化合物和任选载体的荧光探针组合物。
43. 权利要求42的荧光探针组合物，其中所述荧光探针组合物进一步包含溶剂、酸、 碱、缓冲溶液或其组合。
44. 检测样品中过氧亚硝酸盐的存在和/或测定样品中的过氧亚硝酸盐含量的方法， 其包括： a) 使权利要求1的化合物与样品接触以形成荧光化合物；和 b) 测定所述荧光化合物的荧光性质。
45. 权利要求44的方法，其中所述样品是化学样品或生物样品。
46. 权利要求45的方法，其中所述样品是包含微生物的生物样品，或细胞或组织。
47. 在生物体中体内检测过氧亚硝酸盐的存在或测定过氧亚硝酸盐含量的方法，其包 括： a)将权利要求1的化合物施用于生物体以形成荧光化合物；和 b)测定所述荧光化合物的荧光性质。
48. 检测样品中过氧亚硝酸盐的存在或测定样品中的过氧亚硝酸盐含量的高通量筛选 方法，其中所述高通量方法包括以下步骤： a) 使权利要求1的化合物与样品接触以形成一种或多种荧光化合物；和 b) 测定所述荧光化合物的荧光性质以测定所述样品中过氧亚硝酸盐的存在和/或 量。
49. 用于筛选一种或多种提高或降低过氧亚硝酸盐含量的靶标化合物的高通量方法， 其中所述高通量方法包括以下步骤： a) 使权利要求1的化合物与靶标化合物接触以形成一种或多种荧光化合物；和 b) 测量所述荧光化合物的荧光性质以测定靶标化合物的存在和/或量。
【文档编号】C09K3/00GK104220438SQ201380007241
【公开日】2014年12月17日 申请日期:2013年1月30日 优先权日:2012年1月30日
【发明者】杨丹, 彭涛, 沈剑刚, 陈幸苗 申请人:香港大学