一种纳米荧光探针的制备方法及其在检测BV2细胞活化状态中的应用与流程

本发明属荧光纳米材料技术领域，具体涉及一种纳米荧光探针的制备方法及其在检测bv2细胞活化状态中的应用。

背景技术：

小胶质细胞(bv2)参与一系列神经退行性疾病的发生，其活化和神经炎症为神经病理学的主要特征。它诱导中枢神经系统损伤和疾病的内源性免疫反应，从而发挥神经保护或神经毒性作用。任何神经系统紊乱，通常可导致炎症和小胶质细胞的激活，同时胶质细胞的数量增加，表型发生改变，这种现象被称为“反应性胶质增生”。在急性神经退行性疾病(中风、脑缺氧、脑外伤)中，小胶质细胞表型发生改变并释放炎症介质，释放的炎症介质主要为细胞因子和趋化因子。这些急性炎症反应对神经细胞的存活通常是有益的，可使脑内的继发性损伤减轻，使受损的组织得到修复。小胶质细胞介导的慢性炎症参与多种慢性神经变性性疾病的病理过程，包括：阿尔茨海默症、帕金森病、肌萎缩侧索硬化症等。慢性炎症过程中，小胶质细胞被长时程激活，随后持续释放一系列炎症介质，导致氧化应激反应。通常认为，小胶质细胞介导的慢性炎症反应对机体是有害的，可造成神经组织损伤。

在现代生物医学中，研究发现bv2细胞有关的中枢神经炎症对大脑皮层、海马区域均有损伤,并在行为上表现为明显的短暂学习记忆能力下降等行为。这种应激反应在免疫应答研究中常被用来模拟单种或多种克隆免疫剂激发刺激，从而鉴别机体免疫激发状态。

此外，在bv2细胞存在的情况下，神经刺激剂对多巴胺神经元有毒性作用。所以探究诱导bv2细胞活化的状态及程度有着重要的意义，对小胶质细胞的活化状态进行区分以及实时监测小胶质细胞的状态都有着及其重要的意义。

技术实现要素：

本发明的目的是针对现有的荧光探针的存在的不足进行了创新，将荧光探针迅速高效的与bv2细胞进行结合，根据目标结合位点的数量不同产生了不同的荧光信号，在酶标仪和荧光分光光度计上得以很好的区分。

本发明采用的技术方案为：一种纳米荧光探针的制备方法，包括如下步骤：

1)将碳源用水完全溶解，向溶液中加入小分子配体进行掺杂；

2)超声溶解，在180-220℃下加热即得目标产物。

优选地，上述的一种纳米荧光探针的制备方法，所述的碳源为天然氨基酸中的一种或多种。

优选地，上述的一种纳米荧光探针的制备方法，所述的小分子配体为氨类小分子。

优选地，上述的一种纳米荧光探针的制备方法，所述的小分子配体为尿素或氨水。

优选地，上述的一种纳米荧光探针的制备方法，按摩尔比，碳源：小分子配体＝1:1-5。

上述的一种纳米荧光探针的制备方法所制备的纳米荧光探针在检测bv2细胞活化状态中的应用。

优选地，上述的应用，

1)纳米荧光探针经过滤，透析，冻干后分散于pbs缓冲溶液中，得到荧光纳米探针溶液，置于20℃以下常温避光保存；

2)将纳米荧光探针溶液加入到含有bv2细胞的96孔板中，孵化5min,检测荧光强度。

优选地，上述的应用，步骤1)中所述的荧光探针溶液的浓度为5-20mg/l。

优选地，上述的应用，步骤2)中，在96孔板每个孔中加入的细胞悬液的体积为100μl，细胞悬液的密度为100-10000个/ml，在每个孔中加入的纳米荧光探针溶液的体积为100μl。

优选地，上述的应用，所述的孵化的温度为20-25℃。

本发明的有益效果是：

1.纳米荧光探针，是以碳原子为骨架结构，尺寸在1-10nm之间，具有荧光性能的类球形的纳米颗粒。该纳米荧光探针是一个没有经过钝化或者改性的荧光探针。该纳米荧光探针能作为区分检测不同活化状态的bv2细胞的原因是其能与过度表达的膜蛋白进行结合,当细胞数量在100-10000之间都可以将其区分开来。此外，该纳米荧光探针具有荧光性能可以进行细胞成像。

2.基于纳米荧光探针的荧光信号不仅可以鉴别不同活化状态的细胞，而且还具有生物相容性好、安全无毒、作用效果稳定等特点。它主要特异性识别膜蛋白及细胞因子；其制备方法工艺简单、易于操作，制备成本低，易于推广。

3.本发明制备的纳米荧光探针，粒径在10nm以下，且为均匀分布的球状颗粒，纳米荧光探针表面没有经过钝化或者改性，且没有毒性，因此可用于生物医学领域。

附图说明

图1是纳米荧光探针的透射电镜成像。

图2是纳米荧光探针在激发波长为330nm，发射波长为380nm的荧光光谱。

图3是在荧光酶标仪下的，活化与未活化细胞被标记的荧光强度值。

具体实施方式

实施例1纳米荧光探针的制备

称取2g(11.5mmol)精氨酸，0.09g丙氨酸(1mmol)，溶于20ml超纯水中，加入1.5g(25mmol)尿素，完全超声溶解后，在反应釜200℃条件下加热10h，得到纳米荧光探针。

将上述制备的纳米荧光探针进行电镜扫描，结果如图1所示，从图1可见，制备的纳米荧光探针平均粒径为4nm，且分布均匀，成均匀分布的球形颗粒。

图2是实施例1制备的纳米荧光探针样品，利用荧光分光光度计于最佳激发波长处进行荧光检测得到的荧光光谱图。由图可知，该纳米荧光探针的最佳激发波长为330nm，最佳发射波峰，位于380nm处。

实施例2

将实施例1制备的纳米荧光探针过滤、透析、冻干后，取0.004g溶于200mlpbs缓冲溶液中，使纳米荧光探针溶液的浓度为0.02mg/ml，在96孔板每个孔中加入100μl细胞悬液，细胞悬液的密度为10000个/ml，每个孔中再加入100μl纳米荧光探针溶液，在20℃下孵化5min。

在荧光酶标仪上检测荧光强度值，重复8次，如图3所示。纳米荧光探针在酶标仪下的荧光强度为2.2×10⁷。正常bv2细胞未经活化，膜蛋白的特异性成分以及细胞因子的浓度较低，根据非特异性吸附原理，纳米荧光探针与生物硫醇，多肽等结合产生轻微的荧光增强现象。活化的bv2细胞，细胞表面经刺激应激反应暴露的特异性的膜蛋白并释放细胞因子，并与纳米荧光碳针特异性结合后，发生荧光猝灭现象。综上所述，纳米荧光探针与活化诱导的bv2细胞结合发生荧光猝灭，与未活化的细胞发生荧光增强现象，该探针具有优异的重复性和较好的准确率。

综上可见，从制备过程来看，本发明的方法，原料价格低廉，方法简单易行，且无需复杂的反应条件，从医学应用来看，本发明可以很好的识别bv2细胞活化与未活化的状态。它不仅能够作为纳米荧光探针而且还具有生物相容性好、特异性选择识别、作用时间长、稳定性好、廉价易得等特点。鉴于这些优秀的性能，这种新型纳米荧光探针有望在医学诊疗领域开展应用研究。

技术特征：

技术总结
本发明属于荧光纳米材料技术领域，具体提供了一种纳米荧光探针的制备方法，包括如下步骤：将碳源用水完全溶解，向溶液中加入小分子配体进行掺杂；超声溶解，加热即得目标产物。所述的碳源为天然氨基酸中的一种或多种。所述的小分子配体为尿素或氨水。按摩尔比，碳源：小分子配体＝1:1‑5。本发明所制备的纳米荧光探针，是以碳原子为骨架结构，具有荧光性能的类球形的纳米颗粒。该纳米荧光探针不仅可以鉴别不同活化状态的BV2细胞，而且还具有生物相容性好、安全无毒、作用效果稳定等特点。它主要特异性识别BV2细胞膜蛋白及细胞因子；其制备方法工艺简单、易于操作，制备成本低，易于推广。

技术研发人员：刘学;毕秀丽;刘禹霖;陈扬
受保护的技术使用者：辽宁大学
技术研发日：2019.05.09
技术公布日：2019.08.02