用于检测细菌及真菌死活状态的荧光染色试剂、制备方法及用图
【专利摘要】本发明公开了一种用于检测细菌及真菌死活状态的荧光染色试剂、制备方法及用途，其中，该荧光染色试剂包括染料分子，该染料分子可通过在聚乙二醇分子两端分别化学连接胆固醇分子和荧光分子获得。本发明对细菌或动物细胞的毒性低，几乎无生物毒性，能够实现对细菌和真菌死活状态的长时间检测；另外，本发明的试剂具有良好的水溶性。
【专利说明】
用于检测细菌及真菌死活状态的荧光染色试剂、制备方法及用途
技术领域
[0001]本发明属于微生物检测领域，尤其是一种检测细菌及真菌死活状态的荧光染色试剂以及制备该荧光染色试剂的方法。
【背景技术】
[0002]微生物检测在环境监测、医疗卫生、食品加工以及制药工业等领域发挥着重要的作用。其中，微生物的死活鉴定在反映饮用水及食品质量、评价抗菌材料的效果以及确定污染源等方面是一项关键的检测指标。传统的平板计数法通过利用活细菌在培养板上具有繁殖能力来对样本中活细菌的数量进行评价。
[0003]在该方法中，一个或少量活的细菌会在适宜的琼脂糖培养板上生长成为一个肉眼可见的菌斑，因此菌落形成单位(CFU)的数量就反映了样品中活细菌的多少。然而这种方法非常费时费力，并且所得数据的可靠性与实验人员的操作有很大的关联。除此之外，也有利用高分辨显微镜观察细菌形态或测量细菌细胞膜电位等方法来反映细菌活力，但这些检测方法价格昂贵且样品制备过程复杂，难以进行广泛应用。
[0004]基于荧光的微生物活性检测手段具有灵敏度高、易于操作和检测速度快等优点，在近年来得到了广泛应用。其中最为常见的荧光染料就是碘化丙啶(PI)。这种小分子不能够穿过活细菌的细胞膜，但是可以透过死细菌破损的细胞膜与内部的DNA结合并发出荧光，从而来反映细菌死亡。然而该分子具有很大的生物毒性，对人体及生态环境都存在潜在的危害。
[0005]此外，基于碘化丙啶的检测手段要求在对细菌进行染色后的短时间内就必须进行观察，否则会对检测结果造成偏差。由于含有较多苯环结构，此类染料分子的水溶性很差，必须用二甲基亚砜等有机溶剂来溶解。因此，非常有必要开发一种水溶性良好，生物相容性好且灵敏度高的细菌及真菌活性荧光检测试剂。
【发明内容】
[0006]有鉴于此，为解决现有技术存在的上述问题，
【申请人】提供了一种检测细菌及真菌死活状态的荧光染色试剂。更进一步的目的是提供一种制备上述荧光染色试剂的方法。
[0007]本发明提供的技术方案具体为:一种用于检测细菌及真菌死活状态的荧光染色试剂，该荧光染色试剂包括染料分子，该染料分子可通过在聚乙二醇分子两端分别化学连接胆固醇分子和荧光分子获得。或者说，染料分子由在聚乙二醇分子的两端分别化学连接胆固醇分子和荧光单元形成。
[0008]同时需要说明的是，在本文中，“用于检测细菌和真菌……”，“细菌及真菌……”等表述中，其含义是指该荧光染色试剂可以用于检测细菌的死活状态，也可以用于检测真菌的死活状态。
[0009]优选的，所述焚光分子为原P卜啉或二氢P卜吩e6。
[0010]优选的，所述聚乙二醇的分子量为1000-10000。进一步优选的，所述聚乙二醇的分子量为1800-2200 O更进一步优选的，所述聚乙二醇的分子量为2000。
[0011]进一步的，本发明还提供了一种制备用于检测细菌及真菌死活状态的荧光染色试剂的方法，包括如下步骤:
[0012]步骤1、活化荧光分子的羧基:称取荧光分子、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，并将其分别溶于二甲基亚砜，制得混合溶液;将1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺溶液和N-羟基琥珀酰亚胺溶液依次加入荧光分子溶液中，混合并在室温条件下反应2?4小时，得到羧基活化后的荧光分子溶液；
[0013]步骤2、将所述羧基活化后的荧光分子溶液与胆固醇-聚乙二醇-氨基分子混合，室温反应12小时以上；
[0014]反应结束后，用预定截留分子量的透析袋在二甲基亚砜中透析纯化，再用超纯水透析纯化，然后冷冻干燥，于-20°C中冷冻保存，备用。
[0015]优选的，在所述步骤I中，荧光分子、1-(3-二甲氨基丙基)-3_乙基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为I: (4-40): (4-50)。
[0016]进一步优选的，在所述步骤I中，荧光分子、1-(3-二甲氨基丙基)-3_乙基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1: (8-12): (8-12)。更进一步优选的，所述摩尔比为1:10:10。
[0017]优选的，所述荧光分子与胆固醇-聚乙二醇-氨基分子的摩尔比为(1:1)?(100:1)。更进一步优选的，所述摩尔比为10:1。
[0018]更进一步的，本发明还提供了一种荧光染色试剂在检测细菌及真菌死活状态中的应用，所述荧光染色试剂包括染料分子，该染料分子可通过在聚乙二醇分子两端分别化学连接胆固醇分子和荧光分子获得。该染料分子的制备方法如上文所述，此处不再重新描述。
[0019]优选的，所述焚光分子为原B卜啉或二氢B卜吩e6，所述聚乙二醇的分子量为1000-10000。进一步优选的，所述聚乙二醇的分子量为1800-2200，更进一步优选的，所述聚乙二醇的分子量为2000。
[0020]实施本发明，可获得的有益效果是:组成成分安全，对细菌或动物细胞的毒性低，几乎无生物毒性，能够实现对细菌和真菌死活状态的长时间检测;本发明的试剂具有良好的水溶性;在进一步的实施例中，可通过替换不同的荧光分子实现不同发射波段的荧光检测。
【附图说明】
[0021]图1是本发明的结构示意图。
[0022]图2a和图2b分别是对活大肠杆菌和死大肠杆菌的染色结果。
[0023]图3a和图3b分别是对活金黄色葡萄球菌和死金黄色葡萄球菌的染色结果。
[0024]图4a和图4b分别是对活酵母菌和死酵母菌的染色结果。
【具体实施方式】
[0025]结合一下实施例和附图进一步描述本发明的状态。
[0026]实施例1:
[0027](I)首先以原卟啉(PpIX)、l-(3_二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC.HCl)以及N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)为原料对原卟啉分子的羧基进行活化。称取1mg PpIX、20.4mg EDC.HCl和 12.3mg NHS并分别溶于ImL二甲基亚砜(DMSO)，PpIX先与EDC.HCl混合随后再加入NHS于室温下反应2小时使羧基活化完全。
[0028](2)称取 4.2mg 胆固醇-聚乙二醇 2000-氨基(cholesterol-PEG2000-NH2)和 43yL 三乙胺共溶于DMSO中，并与上述反应体系混合。室温下反应过夜后，用截留分子量为2k的透析袋在DMSO中透析2天，随后在超纯水中透析I天进行纯化。最后在冻干机中冷冻干燥制成cholesterol-PEG2000-PpIX，于-20°C 中冷冻保存。
[0029]上述方法所得的试剂记为:胆固醇-聚乙二醇2000-原卟啉，其分子结构见图1。
[0030]实施例201至 206:
[0031]实施例201中，聚乙二醇的分子量为1000，荧光分子原卟啉(PpIX)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC.HCl)以及N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的摩尔比为1:4:48;室温反应时间为3小时；荧光分子与胆固醇-聚乙二醇-氨基分子的摩尔比为2:1。透析袋的截留分子量为1000。
[0032]实施例202中，聚乙二醇的分子量为5000，荧光分子原卟啉(PpIX)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC.HCl)以及N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的摩尔比为1:10:20;室温反应时间为2小时；荧光分子与胆固醇-聚乙二醇-氨基分子的摩尔比为10:1。透析袋的截留分子量为1000。
[0033]实施例203中，聚乙二醇的分子量为10000，荧光分子原卟啉(PpIX)、1-(3_二甲氨基丙基)-3_乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC.HCl)以及N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的摩尔比为1:4:10;室温反应时间为4小时；荧光分子与胆固醇-聚乙二醇-氨基分子的摩尔比为20:1。透析袋的截留分子量为10000。
[0034]实施例204中，聚乙二醇的分子量为8000，荧光分子原卟啉(PpIX)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC.HCl)以及N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的摩尔比为1:40:40;室温反应时间为2.5小时;荧光分子与胆固醇-聚乙二醇-氨基分子的摩尔比为5:1。透析袋的截留分子量为8000。
[0035]实施例205中，聚乙二醇的分子量为7000，荧光分子原卟啉(PpIX)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC.HCl)以及N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的摩尔比为1:20:30;室温反应时间为3.5小时；荧光分子与胆固醇-聚乙二醇-氨基分子的摩尔比为80:1。透析袋的截留分子量为7000。
[0036]实施例206中，聚乙二醇的分子量为4000，荧光分子原卟啉(PpIX)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC.HCl)以及N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的摩尔比为1:40:10;室温反应时间为2.5小时；荧光分子与胆固醇-聚乙二醇-氨基分子的摩尔比为100:1。透析袋的截留分子量为4000。
[0037]实施例301?实施例306
[0038]在实施例301至306中，荧光分子为二氢卟吩e6分子，其他反应参数分别对应实施例201至实施例206。
[0039]实施例4:
[0040]测试实施例1的染料分子对于大肠杆菌死活状态的鉴别能力，方法如下:在生长有大肠杆菌的LB固体培养板上挑取单菌落，然后转移至3mL的液体培养基中于37°C条件下培养至细菌在600nm的浊度为0.5左右。将细菌悬浊液等分为两份，8000^11?离心5分钟收集细菌。其中一份用500yL70%异丙醇重悬并在室温下静置I?2小时处死细菌，另一份用500yL生理盐水重悬并静置同等时间。处死完成的细菌用生理盐水清洗2遍。随后，在两个离心管中分别加入ImL 50yg/mL的胆固醇-聚乙二醇2000-原卩卜啉并重悬细菌，放置于37°C摇床中孵育30分钟。
[0041]最后，将细菌悬液滴片并与激光扫描共聚焦显微镜下观察(激发光波长:552nm，接收波段:610-650nm)。实验结果见附图2a和图2b。实验结果表明，该染料分子能够明显区分大肠杆菌的死活状态，其中死的大肠杆菌发出明亮的红色荧光，如图2b所示。而活的大肠杆菌则几乎不发出荧光，如图2a所示。
[0042]实施例5:
[0043]测试实施例1的染料分子对于金黄色葡萄球菌死活状态的鉴别能力，方法如实施例5所述。实验结果见附图3a和图3b。实验结果表明，该染料分子能够明显区分金黄色葡萄球菌的死活状态，其中死的金黄色葡萄球菌发出明亮的红色荧光，如图3b所示。而活的金黄色葡萄球菌发出的荧光非常微弱，如图3a所示。
[0044]实施例6:
[0045]测试实施例1的染料分子对于酵母菌死活状态的鉴别能力，方法如下:取生长状态良好，浊度为0.5的酵母菌液2mL，等分为两份。SOOOrpm离心并弃除上清液后，其中一份用500yL70%异丙醇重悬并在室温下静置I?2小时处死真菌，另一份用500yL生理盐水重悬并静置同等时间。处死完成的酵母菌用生理盐水清洗2遍。随后，在两个离心管中分别加入ImL50yg/mL的胆固醇-聚乙二醇2000-原卟啉并重悬酵母菌，放置于37°C摇床中孵育30分钟。
[0046]最后，将酵母菌悬液滴片并与激光扫描共聚焦显微镜下观察(激发光波长:552nm，接收波段:610-650nm)。实验结果见附图4a和图4b。实验结果表明，该染料分子能够明显区分酵母菌的死活状态，其中死的酵母发出明亮的红色荧光，如图4b所示。而活的酵母菌则不发出焚光，如图4a所不。
[0047]需要说明的是，可以根据实际情况选择或替换荧光分子，以改变发射波长，实现不同发射波段的荧光检测。总之，本发明至少有以下优点:本发明试剂的组成成分均非常安全。聚乙二醇具有良好的生物相容性，是经美国食品药品监督管理局认证的、可用作临床药物辅料的高分子材料。疏水单元如胆固醇和磷脂分子都是细胞膜的固有成分，而原卟啉分子更是人体血红素的组成成分。因此该试剂无论对于细菌本身或动物细胞的毒性都非常低。相对于传统的PI分子或目前市售的细菌死活检测试剂，本发明试剂具有良好的水溶性。本发明试剂能够实现对于死亡的细菌和真菌细胞的免清洗成像，并且具有良好的检测灵敏度。由于本发明试剂几乎无生物毒性，该染料能够实现对细菌和真菌死活状态的长时间动态检测。
【主权项】
1.一种用于检测细菌及真菌死活状态的荧光染色试剂，其特征在于，该荧光染色试剂包括染料分子，该染料分子可通过在聚乙二醇分子两端分别化学连接胆固醇分子和荧光分子获得。2.根据权利要求1所述的用于检测细菌及真菌死活状态的荧光染色试剂，其特征在于，所述焚光分子为原P卜啉或二氢P卜吩e6。3.根据权利要求1或2所述的用于检测细菌及真菌死活状态的荧光染色试剂，其特征在于，所述聚乙二醇的分子量为1000-10000。4.根据权利要求1或2所述的用于检测细菌及真菌死活状态的荧光染色试剂，其特征在于，所述聚乙二醇的分子量为1800-2200。5.制备用于检测细菌及真菌死活状态的荧光染色试剂的方法，其特征在于，包括如下步骤: 步骤1、活化荧光分子的羧基:称取荧光分子、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，并将其分别溶于二甲基亚砜，制得混合溶液;将卜(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺溶液和N-羟基琥珀酰亚胺溶液依次加入荧光分子溶液中，混合并在室温条件下反应2?4小时，得到羧基活化后的荧光分子溶液； 步骤2、将所述羧基活化后的荧光分子溶液与胆固醇-聚乙二醇-氨基分子混合，室温反应12小时以上； 反应结束后，用预定截留分子量的透析袋在二甲基亚砜中透析纯化，再用超纯水透析纯化，然后冷冻干燥，于-20 0C中冷冻保存，备用。6.根据权利要求5所述的制备用于检测细菌及真菌死活状态的荧光染色试剂的方法，其特征在于，在所述步骤I中，荧光分子、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为I: (4-40): (4-50)。7.根据权利要求5所述的制备用于检测细菌及真菌死活状态的荧光染色试剂的方法，其特征在于，在所述步骤I中，荧光分子、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为I: (8-12): (8-12)。8.根据权利要求5、6或7所述的制备用于检测细菌及真菌死活状态的荧光染色试剂的方法，其特征在于，所述荧光分子与胆固醇-聚乙二醇-氨基分子的摩尔比为(1:1)?(100:l)o9.一种荧光染色试剂在检测细菌及真菌死活状态中的应用，其特征在于，所述荧光染色试剂包括染料分子，该染料分子可通过在聚乙二醇分子两端分别化学连接胆固醇分子和焚光分子获得。10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述荧光分子为原卟啉或二氢卟吩e6，所述聚乙二醇的分子量为1000-10000。
【文档编号】C09K11/06GK105969334SQ201610296680
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2016年5月6日
【发明人】吴富根, 贾浩然, 祝雅璇
【申请人】东南大学