肌醇六磷酸酶变体的制作方法

专利名称：：肌醇六磷酸酶变体的制作方法
技术领域：
：本发明涉及与源自布氏柠檬酸杆菌(Citrobacterbraakii)ATCC51113的肌醇六磷酸酶具有至少74%同一性并与该肌醇六磷酸酶相比包含至少一个变化的肌醇六磷酸酶(即，是其变体)。本发明还涉及编码这些肌醇六磷酸酶的DNA,它们的制备方法，以及它们的用途，例如在动物饲料和动物饲料添加剂中的用途。布氏柠檬酸杆菌ATCC51113肌醇六磷酸酶的成熟部分作为SEQIDNO:2包括于序列表中。
背景技术：
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背景技术：
：来自布氏柠檬酸杆菌的phyA基因的序列已经由Zinin等向EMBL/GenBank/DDBJ数据库提交，登录号为AY390262。相应的肌醇六磷酸酶氨基S吏序列以登录号Q676V7存在于UniProt/TrEMBL数据库。Q676V7预期的成熟部分作为SEQIDNO:4包括在本发明的序列表中。WO-2004/085638以SEQIDNO:7公开了来自保藏为KCCM10427的布氏柠檬酸杆菌YH-15的肌醇六磷酸酶的氨基酸序列。将该氨基酸序列的成熟部分作为SEQIDNO:3包括于此。该序列还存在于凄t据库Geneseqp中，登录号为ADU50737。WO2006/037328公开了布氏柠檬酸杆菌ATCC51113的野生型肌醇六磷酸酶(即，本文的SEQIDNO:2)，以及同样包括在本序列表中的它的变体，即作为SEQIDNO:6。WO2006/038062和WO2006/038128都公开了以登录号NCIMB41247保藏的弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacterfreundii)P3-42肌醇六磷酸酶基因的氨基酸序列。该氨基酸序列作为SEQIDN0:9被包括于此。本发明的一个目的是提供具有修改的，优选改进的特性的肌醇六磷酸酶。这些特性的非限制性实例是热稳定性，温度曲线，pH曲线，比活性，在动物饲料中的性能，蛋白酶敏感性和/或糖基化模式。发明概述本发明涉及肌醇六磷酸酶，其与SEQIDNO:2具有至少74%同一性并与SEQIDNO:2相比在选自下组中的至少一个位置上包含至少一个变化1，2,3，4,5，31,41，46,52，53,55，57,59，74，76,82，84，91，99,100，104，105，107，109，111，114,115，116,117，118,119，120，121，122，123,124，136,137，141，154，161，162，164,167,m，176，177,179，180，181，182,183，184，185，186，196，199，200,202，203，218,223，239,240，241，247，273，276,281，282,283，284，285,286，289,294,299，308，314，316,324,331，339，351，355,362,379,385,406，409,410和411;条件是该肌醇六磷酸酶不是SEQIDNO:3，不是SEQIDNO:4，并且不是SEQIDNO:6。本发明还涉及fl醇六磷酸酶，其与SEQIDNO:2具有至少74%同一性并包含至少一个下列变化1H,K,R,60P,105E，106A，G，155F,157F,173P,175L,188P，205P，215M，231P,254Y,280P,330D和/或371P;条件是该肌醇六磷酸酶不是SEQIDNO:3，不是SEQIDNO:4，不是SEQIDNO:6，并且不是SEQIDNO:9及在图1中列出的它的变体。本发明还涉及编码这些肌醇六磷酸酶的DNA，它们的制备方法，以及它们的用途，例如在动物饲料和动物饲料添加剂中的用途。附图筒述图1对应于WO2006/038062的表2并公开了具有SEQIDNO:9氨基酸序列的弗氏柠檬酸杆菌NCIMB41247肌醇六磷酸酶的多种变体；图2是SEQIDNO:2和9的肌醇六磷酸酶的比对。图1中的位置号参考SEQIDNO:9的编号方式。相对应的SEQIDNO:2位置可以通过减去22得到(例如，应用本申请的编号方式图1的变体P229S的意思是变体P207S)。7发明详述第一方面，本发明涉及肌醇六磷酸酶，其与SEQIDNO:2具有至少74%同一性并与SEQIDNO:2相比在选自下组中的至少一个位置上包含至少一个变化1，2,3，4，5，31,41,46,52,53,55，57，59，74，76，82，84,91,99,100，104，105,107，109,111，114,115，116,117，118，119，120，121,122,123,124,136，137，141，154，161,162,164，167，171，176,177，179，180,181，182，183,184，185,186,196，199，200，202,203，218,223,239，240，241，247，273,276,281，282,283,284,285，286，289，294，299，308，314，316，324，331，339，351,355,362，379,385，406,409，410和411;条件是该月几醇六磷酸酶不是SEQIDNO:3，不是SEQIDNO:4，并且不是SEQIDNO:6。如在"肌醇六磷酸酶多肽，同一性百分比"一节中所述来确定同一性百分比。位置号参考SEQIDNO:2的位置编号方式，如在"位置编号方式"一节中所述。其它肌醇六磷酸酶中与这些SEQIDNO:2位置号相对应的位置如"确定相应位置号"一节中所述来确定。本发明的肌醇六磷酸酶是SEQIDNO:2的肌醇六磷酸酶的变体，即其与SEQIDNO:2不同，因为其与SEQIDNO:2相比包含至少一个变化。在一具体实施方式中，本发明的肌醇六磷酸酶与SEQIDNO:2相比在选自下组的至少一个位置上包含至少一个变化1，2，3,4,5,31,46，52，53，55，57,59，76,82，99,100，107,109，111,114，115，116,117，118，119，120,121,122,123,124,137，141，161，162，164，167，179,180，181，182，183,184，185,186,196,199,200，202，218，223，241,273,276,285,286，299，314，331，339，362,379，385，406,410和411。在另一具体实施方式中，本发明的肌醇六磷酸酶不是SEQIDNO:9。在更进一步的具体实施方式中，本发明的肌醇六磷酸酶不是图l列出的SEQIDNO:9的变体。在一优选实施方式中，本发明的肌醇六磷酸酶包含至少一个下列变化1*,2*，3*，4P,5P，31C，T，41P，46C,D,E，52C,E，53V,Q，55D,I，57Y59C，74A,76G,82E，84Y,91C,P，99C，IOOC，104A，105F，107D，E，G，109A，G,111P,114H,N,T，115Q,116A,E，P,T,Q，117D,E,K,1181,L,M,T,119G，K,R,S，120K,S，T，Q，121A，D，M,P,T，V,122D，123P,S，124L,T，V,136P，137P，141C，154P，161P,162C，164D,E，167Q，171T,176C，177C,179QI,K,N,Q,180A，E,G，T，181D,QI，K，182H，K，S，Q,183A,L,P,S,V，Q，184*,185*,186*，196Q，199C,200K，R,202N,203T，218Q，223E，239Q,240P，241Q,247C，273L,Q，276K,R,281H,282P，283P，284P,285QN，R,286K,Q,289P,294T,299L,308A3314，，316D,324N,331K,339D，351Y，355P,362K，R,379K，R,385D，406A，409D，E，410D，E和/或411R,K。本文对于变化用到的命名法在"变化，如取代，缺失，插入。"一节中详纟田4苗述。本发明的肌醇六磷酸酶优选包含至少一个下列变化1*,2*,3*，4P，5P，31C，46E,52C，E，53V，55D,57Y，59C，76G,82E，99C，IOOC，107D,E，G,109A,111P,114T,115Q,116AT,117D,118T,119K,R，S，120S，121D，P，T，122D,123P，124L,137P,141C,161P，162C，164E,167Q，179K，180E,T，181D,K，182H，K,Q,183L,V,Q,184*，185*,186*，196Q,199C,200K，202N，218Q，223E，241Q,273L，276K,R，285G，R，286Q,299L，314QN，331K,339D，362K,R,379K,R，385D,406A，410D，E和/或411R，K;和/或其中位置179，180，181,182，183,184，185和186的氨基酸已经由KEKHQ,KEKQQ,KEKKV或KTDKL取代。在另一优选实施方式中，位置179,180,181,182,183,184,185和186的氨基酸已经由QADKP,GEDKP，NGISA,IAGKS，KEKHQ，KEKQQ，KEKKV或KTDKL取代。本发明还涉及与SEQIDNO:2具有至少74%的同一性并包含至少一个下列变化的肌醇六磷酸酶1H，K，R，60P,105E,106A,G,155F,157F，173P，175L，188P,205P，215M，231P,254Y,280P,330D和/或371P;条件是该肌醇六磷酸酶不是SEQIDN0:3，不是SEQIDNO:4，不是SEQIDNO:6，并且不是SEQIDNO:9及在图1中列出的它的变体。在一优选的实施方式中肌醇六磷酸酶包含变化1K。在其他的优选实施方式中，肌醇六磷酸酶包含下列变化组合280P/282P/283P，155F/254Y和/或155F/157F/254Y。本发明优选的MJf六磷酸酶包含选自下列的一个变化52C，141C,162C，31C，52C,99C,59C,IOOC，141C/199C，4P,5P,lllP，137P，161P，52E,57Y，76G,107D，107G,109A，1*,1*/2*,1*/2*/3*,121T，273L，285G,286Q，299L，362K，331K/55D，107E，46E,82E,119R，119K，164E，223E，276R，276K，362R,379R，379K，385D,410D,410E，411R,411K,53V，121D，167Q，196Q，200K,202N，218Q，241Q,285N,314N,314G，顿A，179K/180E/181K/182H/183Q/184*/185*/186*，179K/180E/181K/182Q/183Q/184*/185*/186*，179K/180E/18IK/182K/183V/l84*/185*/186*,179K/180T/181D/182K/183L/184*/185*/186*，111P/241Q,IK,本发明的肌醇六磷酸酶可以是任何野生型的或变体肌醇六磷酸酶的变体。在具体的实施方式中，它是SEQIDNO:2，SEQIDNO:3，SEQIDNO:4，SEQIDNO:6，SEQIDNO:9的肌醇六磷酸酶的变体，或与SEQIDNO:9相关的并在图1中列出的任何一种肌醇六磷酸酶变体的变体。本发明的肌醇六磷酸酶可以进一步包含一个变化(取代)或多个变化(取代)的组合，它们选自图1各行中所列出的变化(取代)或变化(取代)的组合。尤其优选的SEQIDNO:2的肌醇六磷酸酶的变体是下列R339D，N4P,G5P，Q111P，El*，El*/E2*，El*/E2*/Q3*，M273L和N286K;以及它们的任意组合；以及SEQIDNO:3，4和6的相应变体。本发明尤其优选的肌醇六磷酸酶包含至少一个下列变化339D,4P，5P，111P，1*，1*/2*，1*/2*/3*，273L和/或286K。本发明还涉及与SEQIDNO:2具有至少74%同一性并包含至少一个下列变化的肌醇六磷酸酶(i)141C/199C,91C/46C，52C/99C，31C/176C，31C/177C,59C/100C和/或162C/247C;(ii)41P,91P,136P,137P,154P，161P，355P,111P，240P,282P,283P，284P,289P,4P和/或5P;(iii)52E,551，57Y，104A/105F,107D,G,109A,G,76G,84Y，121T，362K，273L，Q，285QR，286K,Q，294T，299L，331K/55D和/或351Y;(iv)1*，1*/2*或1*/2*/3*;(v)其中K179,T180，T181,E182,K183,S184,T185和K186已经由QADKP，GEDKP，NGISA，IAGKS,KEKHQ，KEKQQ,KEKKV或KTDKL取代；(vi)119R,K和/或411R,K;(vii)107E和/或164E，D;(viii)362R，K,276R，K,379R,K，409D,E，223E,385D,46D,E,410D，E和/或82E;(ix)218Q,324N,200R，K，121D，196Q，202N,杨A，167Q,53V，Q，241Q,314N,G,239Q和/或285N;(xi)31T,74A,171T，203T,281H，316D和/或308A;和/或(xii)339D。制备变体的策略通过同源性建模(modeling),利用大肠杆菌(E.coli)AppA肌醇六磷酸酶的结构作为模板(ProteinDataBankid.:IDKO;Lim等，Nat.Struct.Biol.(2000):vol.2，pp.108-113(第二巻，第108-113页))构建布氏柠檬酸杆菌ATCC51113肌醇六磷酸酶的结构。对该结构进行分子动力学(MD^莫拟和静电计算。还鉴定了推定的二硫4建(disulfidebridges)和脯氨酸的位置，以及与各种合乎需要的酶特性有关的潜在重要性的其他位点。最后，鉴定了推定的糖基化位点(NXT或NXS的伸展(stretches))。在模型化结构和模拟结果的框架之内对所有的这些提议进行评估，尤其着重在高温端评估热稳定性。相对应的肌醇六磷酸酶变体通过本领域所熟知的方法制备并如在实验部分中所述进行测试。li肌醇六磷酸酶多肽，同一性百分比在本文中肌醇六磷酸酶是具有肌醇六磷酸酶活性的多肽，即催化肌醇六磷酸(盐)(phytase)(肌醇六磷酸盐(myo-inositolhexakisphosphate))的水解生成(1)肌醇(myo-inositol)和/或p)它的单，二，三，四和/或五磷酸盐以及(3)无机磷酸。在本文中术语肌醇六磷酸酶底物包括，但不限于(i.a.)，肌醇六磷酸和任何肌醇六磷酸盐(肌醇六磷酸的盐)，以及在上面的(2)中所列出的磷酸盐。网络上的ENZYME网站(http:〃www.expasy.ch/enzyme/)是酶的命名法相关的信息库。它主要依据国际生物化学和分子生物学协会命名委员会andMolecularBiology)的建议，它描述了提供有EC(酶委员会)号的经表征的酶的各种类型(BairochA.TheENZYMEdatabase,2000，NucleicAcidsRes28:304-305)。还可参见NC-IUBMB的酶命名手册，1992。根据ENZYME网站，已知有三种不同类型的肌醇六磷酸酶所谓的3-肌醇六磷酸酶(别名l-肌醇六磷酸酶；肌醇六磷酸盐3-磷酸水解酶，EC3.1.3.8),所谓的4-肌醇六磷酸酶(别名6-肌醇六磷酸酶，基于1L编号系统而不是ID编号的名称，EC3.1.3.26),以及所谓的5-肌醇六磷酸酶(EC3.1.3.72)。就本发明而言，将全部三种包括在肌醇六磷酸酶的定义中。在一具体实施方式中，本发明的肌醇六磷酸酶属于酸性组氨酸磷酸酶家族，包括大肠杆菌pH2.5酸性磷酸酶(基因appA)以及真菌的肌醇六磷酸酶如泡盛曲霉(Aspergillusawamorii)肌醇六磷酸酶A和B(EC:3.1,3.8)(基因phyA和phyB)。各组氨酸酸性磷酸酶共同具有两个区的序列相似性，每个区围绕着一个保守的组氨酸残基中心。这两个组氨酸看起来象参与了酶的催化机制。第一个组氨酸位于N-末端部分并形成磷-组氨酸中间体，而第二个位于C-末端部分并且可能作为质子供体发挥作用。在更具体的实施方式中，本发明的肌醇六磷酸酶具有保守的活性位点基序，即R-H-G-X-R-X-P，其中X代表任何氨基酸(参见SEQIDNOs:2，3,4,6的氨基酸16到22以及SEQIDNO:9的氨基酸38-44)。在一优选实施方式中，保守的活性位点基序为R-H-G-V-R-A-P，即氨基酸16-22(参考SEQIDNO:2)是RHGVRAP。就本发明而言，肌醇六磷酸酶的活性以FYT单位来确定，一个FYT是12在下列条件下每分钟释放1微摩尔无机正磷酸的酶量pH5.5;温度37。C;底物浓度为0.0050mo1/1的肌醇六磷酸钠(C6H6024P6Na！2)。适当的肌醇六磷酸酶测定法是在WO00/20569的实施例1种描述的FYT和FTU测定法。FTU用于测定饲料和预混合物中的肌醇六磷酸酶活性。还可以利用实施例1("磷酸酶活性的测定"或"肌醇六磷酸酶活性的测定")中的测定法来确定肌醇六^l酸酶的活性。在一具体实施方式中本发明的肌醇六磷酸酶是分离的。本文所用的术语"分离的"是指如由SDS-PAGE确定的，至少20%纯的，优选至少40%纯的，更优选至少60%纯的，还更优选至少80%纯的，最优选至少90%纯的，甚至最优选至少95%纯的多肽。具体的，优选多肽为"基本上(essentially)纯的形式"，即，所述多肽制备物基本上不含(essentiallyfreeof)与其天然结合(nativelyassociated)的其他多肽原料。例如，这可以通过用熟知的重组方法或经典的纯化方法制备多肽来实现。两个氨基酸序列之间的相关性通过参数"同一性，，来描述。就本发明而言，两个氨基酸序列的比对通过利用来自EMBOSS软件包(http:〃emboss,org)版本2.8.0的Needle程序来确定。Needle程序执行在NeedlemanS.B.和Wunsch,C.D.(1970)J.Mol.Biol.48,443-453中描述的全局比对算法(globalalignmentalgorithm)。所用的取代矩阵是BLOSUM62,缺口开启罚分(gapopeningpenalty)是10，并且缺口延伸罚分(gapextensionpenalty)是0.5。本发明的氨基酸序列("发明序列")和权利要求中涉及的氨基酸序列(SEQIDNO:2)之间的同一性程度，是通过两个序列比对中精确匹配的数目，除以"发明序列，，的长度或SEQIDNO:2的长度中最短的一个来计算。结果以百分比同一性表示。当"发明序列"和SEQIDNO:2在重叠的相同位置具有相同的氨基酸残基时发生精确匹配(在下文的比对实例中用T代表这种情况)。序列的长度是序列中的氨基酸残基数(例如SEQIDNO:2的氨基酸1-411的长度是411)。实施例13是SEQIDNO:2的肌醇六磷酸酶和SEQIDNO:9的月几醇六磷酸酶的比对实例，该实例说明了如何计算这两条主链的同一性百分比。在下面另一个纯假定的比对实例中，重叠是序列1的氨基酸序列"HTWGER-NL，，；或序列2的氨基S^歹'J"HGWGEDANL"。在该实例中缺口用"-"表示。13有支定的比对实例序歹'J1:ACMSHTWGER-NLIIIIII序列2:HGWGEDANLA丽PS在一具体实施方式中，多肽的氨基酸序列与或相对于SEQIDN0:2的同一性百分比如下测定i)使用Needle程序，用BLOSUM62取代矩阵，缺口开启罚分10和缺口延伸罚分0.5，比对两个氨基酸序列；ii)计数比对中精确匹配数；iii)用两个氨基酸序列中的最短序列的长度除精确匹配数，iv)将iii)除得的结果转换成百分比。在上面的假定实例中，精确匹配数是6，两个氨基酸序列中最短序列的长度是12;因此同一性百分比是50%。本发明的肌醇六磷酸酶的具体实施方式中，与SEQIDNO:2的同一性程度为至少75%，76%，77%,78%，79%,80%,81%，82%,83%，84%,85%，86%,87%,88%，89%,90%，91%,92%,93%，94%,95%,96%，97%,98%或至少99%。在更具体的实施方式中，同一性程度为至少98.0%,98.2%,98.4%,98.6%，98.8%，99.0%,99.1%，99.2%,99.3%,99.4%，99.5%,99.6%,99.7%，99.8%或至少99.9%。在可选择的实施方式中，同一性程度为至少70%，71%,72°/。或至少73%。在更进一步的具体实施方式中，本发明的肌醇六磷酸酶如与SEQIDNO:2相比具有不超过1，2，3，4,5，6，7,8，9或不超过10个变化；如与SEQIDNO:2相比具有不超过11，12,13，14,15，16，17,18,19或不超过20个变化；如与SEQIDNO:2相比具有不超过21，22,23，24,25，26,27，28,29或不超过30个变化；如与SEQIDNO:2相比具有不超过31,32，33，34,35，36,37，38,39或不超过40个变化；如与SEQIDNO:2相比具有不超过41，42，43,44,45，46，47,48，49或不超过50个变化；如与SEQIDNO:2相比具有不超过51，52，53，54，55,56,57,58，59或不超过60个变化；如与SEQIDNO:2相比具有不超过61,62，63，64，65，66，67，68，69或不超过70个变化；如与SEQIDNO:2相比具有不超过71,72，73，74，75,76，77,78,79或不超过80个变化；如与SEQIDNO:2相比具有不超过81，82,83，84，85，86，87，88，89或不超过90个变化；如与SEQIDNO:2相比具有不超过91,92，93，94，95，96，97，98，99或不超过IOO个变化；如与SEQIDNO:2相比具有不超过101，102，103，104，105,106，107,108，109或不超过110个变化；如与SEQIDNO:2相比具有不超过lll,112，113,114,115，116，117，118，119或不超过120个变化；如与SEQIDNO:2相比具有不超过121，122，123或124个变化。位置编号本文所用的定义氨基酸位置的命名法是基于源自布氏柠檬酸杆菌ATCC51113的肌醇六磷酸酶氨基酸序列，其成熟序列在序列表中作为SEQIDNO:2给出(SEQIDNO:2的氨基酸1-411)。因此,在本文中，用于编号位置的基础是SEQIDNO:2，从El开始到E411终止。当用于本文时术语"成熟"部分(或序列)是指由含有编码该多肽的多核苷酸作为其部分遗传部件(geneticequipment)的细胞分泌的多肽部分。换句话说，成熟多肽部分是指在已经切掉信号肽部分，以及前肽部分(如果存在任何前肽部分的话)以后所剩余的多肽部分。信号肽部分可以通过本领域所熟知的程序软件进行预测(例如SignalP)。将预期的SEQIDNO:2信号肽部分作为SEQIDNO:8包含在本发明的序列表中，SEQIDNO:8由SEQIDNO:7编码。SEQIDNO:2是预期的成熟部分。通常地，酶的成熟部分的第一个氨基酸可以通过对纯化酶的N-末端测序来确定。则信号肽部分和成熟部分之间的任何差异必然归因于前肽的存在。变化，如取代，缺失，插入肌醇六磷酸酶的变体相对于模板(即参照或比较的氨基酸序列如SEQIDNO:2)可以包含各种类型的变化一个氨基酸可以用另一个氨基酸所取代；可以缺失一个氨基酸；可以插入一个氨基酸；以及任意数目的这些变化的任意组合。在本文中术语"插入，，意在还包括N-末端和/或C-末端的延伸。本文对单独变化所用的一般命名法如下XDcY，其中"X，，和"Y"各自独立地代表单字母的氨基酸代码，或"*，，(氨基酸的缺失)，"D，，代表数字，而"c"代表字母顺序计数(a，b，c等等)，其只存在于插入中。以下面的表1作为参考，其描述了该命名法应用于各种类型的变化的完全假定的实例。图表l类型描述实例取代x^莫板中的氨基酸D—莫板中的位置c空缺Y二变体中的氨基酸G80A80AA固SIGVLGVAPSAELYAVKVLGASGSGlimil:llllllllllllllllllllllAALNNSIAVLGVAPSAELYAV跳GASGSG插入x—"*"D二模板中在插入之前的位置c="a"表示在该位置的第一个插入，"b"表示下一个，等等*80aT*80bY*85aS8085AALNNSIG..VLGVA.PSAELYAVKVLGASGiiiiiiiimil111111111111mAALNNSIGTYVLGVASPSAELYAVKVLGASG删除x—莫板中的氨基酸D—莫板中的位置c空缺Y="*"V81*80AALNNSIGVLGVAPSAELYAVKVLGASGSGIIIIIIII11111111111111ill1111AA固SIG.LGVAPSAELYAV跳GASGSGN-末端延伸在位置"o"的插入*OaA*ObT*OcG1...AQSVPWGISRVQ111111111111ATGAQSVPWGISRVQC-末端延伸在N-末端氨基酸后的插入*275aS*275bT270275ATSLGST亂YGSGLVNAEAATR..1111111111111111111111ATSLGSTNLYGSGL職EAATRST如上面所解释的，位置数("D")是从SEQIDN0:2的第一个氨基酸残基开始计数。在同一序列中的几个变化用"/"(斜线)分隔开，例如标识"1*/2*/3*"表示在16位置号1,的氨基酸全部缺失，标识"104A/105F，表示位置号104的氨基酸被A取代，并且位置号105的氨基酸被F取代。可选择的变化用"，，，(逗号)分隔开，例如，标识"119R，K，，表示位置119上的氨基酸被R或K取代。本文在各种其他不胜枚举的可能性中所用的逗号(，)表示它们通常在语法上的作用，即通常是和/或。例如，列表"53V,Q，121D和/或167Q"中第一个逗号表示二中选一(ViQ),而后面的两个逗号应理解为和/或的选择:53V或Q，和/或121D，和/或167Q。在本文中，"至少一个"(例如变化)表示一个或多个，例如l，2,3，4，5，6,7，8，9或IO个变化；或12，14，15,16，18,20，22，24,25，28或30个变化；等等，直至最多的变化数目125，130，140,150，160，170，180，l卯或200个。然而，本发明的肌醇六磷酸酶变体还必需与SEQIDNO:2具有至少74%的同一性，这个百分比如上所述确定。对用什么取代或延伸没有进行任何指定的取代或延伸是指插入任何天然的，或非天然的氨基酸，除了占据模板中该位置的氨基酸以外。实施例13为如何应用这种命名法提供了进一步的解释说明。鉴定相应的位置号如上面所解释，使用布氏柠檬酸杆菌ATCC51113(SEQIDNO:2)的成熟肌醇六磷酸酶作为位置编号的标准，因此也是命名法的标准。对于其他肌醇六磷酸酶，尤其是本发明的肌醇六磷酸酶变体，对应于SEQIDNO:2中位置D的位置通过在名为"肌醇六磷酸酶多肽，同一性百分比"一节中所详细说明的方法比对两个序列来查找到。从比对中，本发明序列中与SEQIDNO:2的位置D相对应的位置可以清晰地和明白地鉴定出来(在比对中互在对方顶部的那两个位置)。实施例13是SEQIDNO:2的肌醇六磷酸酶与SEQIDNO:9的肌醇六磷酸酶的比对实例，该实例展示了这两条主链中的相应位置是如何鉴定的。其他一些的完全假设的实例也包括在内，这些实例源自上文的表l，表1在第三列中包括一批两条序列的比对参照表l的第一行的第三格上面的序列为模板，下面的是变体。位置号80是指模板中的氨基酸残基G。氨基酸A占据了变体中的相应位置。因此，该取f^表示为G80A。17现在参照表l的第二行的第三格上面的序列还是模板而下面是变体。位置号80仍是指模板中的氨基酸残基G。变体有两个插入，即，TY,在模板的G80后而V81前。而T和Y当然会有它们自己在变体氨基酸序列中"实际"的位置号，就目前的情况而言我们总是参照模板中的位置号，于是将T和Y称为分别在位置号80a和80b。最后，参照表l的最后一行第三格位置号275是指模板的最后一个氨基酸。C-末端的延伸ST分别称为在位置号275a和275b,同样尽管它们当然也具有它们自己"实际"的在变体氨基酸序列中的位置号。修改的特性，参考肌醇六磷酸酶在一具体实施方式中，本发明的肌醇六磷酸酶具有修改的，优选是改进的特性。术语"修改"和"改进，，意指与另一种肌醇六磷酸酶相比较。这些其他的用于参考或比较的肌醇六磷酸酶实例是SEQIDNO:3和/或SEQIDNO:4。参考肌醇六磷酸酶的更进一步的实例可以是SEQIDNO:2和/或SEQIDNO:6。参考肌醇六磷酸酶的更进一步的实例可以是SEQIDNO:9，以及在图1中公开的它的变体。修改的，优选为改进的特性的非限定性实例如下热稳定性，pH曲线，比活性，在动物饲料中的性能，蛋白酶敏感性和/或糖基化模式。本发明的肌醇六磷酸酶还可以具有修改的，优选改进的，温度曲线，和/或其可以掺入潜在蛋白酶切割位点的变化。热稳定性热稳定性，或温度稳定性，可以如实施例l题目为"温度稳定性的测定"部分所述来测定。因此，在一优选实施方式中，本发明的肌醇六磷酸酶具有比参考肌醇六磷酸酶高的剩余活性，其中剩余活性如下测定将发酵上清分成两部分，一部分在预期提高的温度下温育30分钟，另一部分在5。C温育30分钟，然后于37。C和pH5.5测定二者针对对硝基苯磷酸的活性，用在提高的温度下温育的样品的活性除以在5。C温育的相同样品的活性。优选的提高的温度是50。C，55。C,60。C,65°C,70。C，75。C,80°C或85。C。如果需要的话，含酶的样品可以在0.1MNaAcpH5.5中稀释。本发明的肌醇六磷酸酶的剩余活性优选是参考肌醇六磷酸酶剩余活性的至少105%，或至少110%，120%，130%，140%，150%。在更进一步的实施方式中，本发明的肌醇六磷酸酶的剩余活性是参考肌醇六磷酸酶剩余活性的至少200%,或至少250%，300%,400%或至少500%。在更进一步的实施方式中，本发明的肌醇六磷酸酶的剩余活性是参考肌醇六磷酸酶剩余活性的至少2倍，3倍，4倍，5倍，6倍，7倍，10倍，15倍，20倍或至少25倍。热稳定性还可以通过实施例5中所述来测定。因此，在一优选实施方式中，本发明的肌醇六磷酸酶具有比参考肌醇六磷酸酶高的剩余活性，其中剩余活性如下测定将发酵上清分成两部分，一部分在50。C温育30分钟，另一部分在5。C温育30分钟，接着在37。CpH5.5测定二者针对对硝基苯磷酸的活性，用在提高的温度下温育的样品的活性除以在5。C温育的相同样品的活性。如果需要，含酶的样品可以在0.1MNaAcpH5.5中稀释。本发明的肌醇六磷酸酶的剩余活性优选是SEQIDN0:3的参考肌醇六磷酸酶剩余活性的至少2倍，3倍，4倍，5倍，6倍，7倍，10倍，15倍，20倍或至少25倍。本发明的肌醇六磷酸酶的剩余活性优选是SEQIDN0:2的参考肌醇六磷酸酶剩余活性的至少105%，或至少110%,120%,130%，140%，150%,160%，170%，180%,190%或至少200%。下列取代是尤其优选的，因为它们使热稳定性与SEQIDNO:3的肌醇六磷酸酶以及SEQIDNO:2的肌醇六磷酸酶相比有所改进(见表3):4P，5P，111P,1*，1*/2*，1*/2*/3*，273L和/或286Q。热稳定性还可以如实施例8中所述来测定。因此，在一优选的实施方式中，本发明的肌醇六磷酸酶具有比参考肌醇六磷酸酶高的剩余活性，其中剩余活性如下测定将发酵上清分成两部分，一部分在60。C温育30分钟，另一部分在5°C温育30分钟，接着在37。CpH5.5测定二者针对对硝基苯磷酸的活性，用在提高的温度下温育的样品的活性除以在5°C温育的样品的活性。如果需要，含酶的样品可以在任选包含0.005%Tween-20的O.lMNaAcpH5.5中稀释。本发明的肌醇六磷酸酶和参考肌醇六磷酸酶可以在枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)宿主菌林中表达。宿主菌林可以在500ml摇瓶中的100mlPS1培养基(100g/L蔗糖，40g/L大豆薄片(Soyflakes),lOg/LNa2HP04.12H20,O.lml/LDowfax63N10(Dow))中以300rpm在30。C培养四天。本发明的肌醇六磷酸酶的剩余活性优选是SEQIDNO:2的参考肌醇六磷酸酶的剩余活性的至少32%，或至少34%,36%，38%或至少40%。更优选地，本发明的肌醇六磷酸酶的剩余活性是SEQIDNO:2的参考肌醇六磷酸酶的剩余活性的至少50%，或至少60%，70%,80%，90%或至少100%。还更19优选地本发明的肌醇六磷酸酶的剩余活性是SEQIDN0:2的参考肌醇六磷酸酶的剩余活性的至少120%，140%，160%，180%或至少200%。最优选地，本发明的肌醇六磷酸酶的剩余活性是SEQIDNO:2的参考肌醇六磷酸酶的剩余活性的至少2倍，或至少3倍，4倍或至少5倍。下列取代尤其优选(见表5):(i)409E，136P;(ii)411K,331K/55D，167Q，179K/180T/181D/182K/183L/184*/185*/186*，107E;(iii)196Q,276R,285G,299L,200K;(iv)l服，121D，107D，179K/180E/181K/182H/183Q/184*/185*/186*;(v)314N，161P,410D,141C,179K/180E/181K/182Q/183Q/184*/185*/186*，285N;(vi)164E，411R，52C，137P,314G;(vii)IK,l*/2*/3*,121T,4Q6A，82E,109A;(iix)5P,57Y,379R，l*/2*;(ix)410E,1*,119K,52E;(x)4P,362K，202N，276K，385D;(xi)111P/241Q,162C,179K/180E/181K/182K/183V/184*/185*/186*，241Q;(xii)223E,286Q,107G，114T/115Q/116A/117D/118T/119S/120S/121P/122D/123P/124L,379K,273L;(xiii)31C，53V,59C/100C;(xiv)46E，11IP,114T/115Q/116T/117D/118T/119S/120S/121P/122D/123P/124L,76G,362R;(xv)141C/199C,52C/99C。热稳定性还可以如实施例9中所述来测定，即应用DSC测量法来测定纯化的肌醇六磷酸酶蛋白的变性温度Td。Td对于蛋白的热稳定性具有指示性Td越高则热稳定性越高。因此，在一优选实施方式中，本发明的肌醇六磷酸酶具有比参考肌醇六磷酸酶高的Td，其中针对纯化的肌醇六磷酸酶样品使用差示扫描量热法从20-90。C以90。C/h的扫描率在20mM乙酸钠緩20沖液，pH4.0中测定Td(优选用纯度为至少95%，通过SDS-PAGE测定)，在此测定之前在20mM乙酸钠pH4.0中透析(优选在2-3小时的步骤后接着过夜步骤)，再进行0.45um过滤并用透析緩沖液将蛋白浓度稀释至相当于约2个吸光单位(A，)。在一优选实施方式中，本发明肌醇六磷酸酶的Td比SEQIDNO:4的肌醇六磷酸酶的Td高，更优选是它的至少101%，或至少102%，103%,104%，105%,106%，107%,108°/。，109%或是它的至少110%。还更优选地，本发明的肌醇六磷酸酶的Td是SEQIDNO:4的肌醇六磷酸酶Td的至少120%,130%,140%，150%，160%，170%，180%或至少190%。下列取代尤其优选(见表6):362K，362R，111P和/或273L。在更进一步的具体实施例中，如使用实施例2中所述的差示扫描量热法(DSC)(即在20mM乙酸钠，pH4.0中)测定，本发明的热稳定的肌醇六石粦酸酶具有至少50。C的解链温度Tm(或变性温度，Td)。在更进一步的具体实施方式中，Tm是至少51，52，53，54,55,56，57,58,59，60，61，62，62.5，63,64,65，66，67，68，69，70，71，72,73，74，75,76,77，78,79,80，81,82,83，84,85，86,87，88,89,90，91，92，93，94,95,96，97,98,99或至少100。C。DSC测量法还可以如实施例1("DSC测量法")中所述来进行，或如实施例2("通过DSC测定热稳定性")中所述来进行。热稳定性还可以如实施例12中所述来测定。因此，在一优选的实施方式中，在70。C和pH4.0条件下温育60分钟后，本发明的肌醇六磷酸酶与按照同样方式处理的参考肌醇六磷酸酶相比具有改进的剩余活性，对于每种肌醇六磷酸酶而言所述剩余活性是相对于温育前(在第0分钟)存在的活性来计算的。剩余活性优选针对肌醇六磷酸钠在pH5.5和3"C时进行测量。温育优选在0.1M乙酸钠，pH4.0中。肌醇六磷酸酶优选是纯化的，更优选地纯化至通过SDS-PAGE测定为至少95%的纯度。优选的肌醇六磷酸酶活性测试缓冲液是0.25M乙酸钠pH5.5。应用本方法，本发明的肌醇六磷酸酶的剩余活性优选是参考肌醇六磷酸酶的剩余活性的至少105%，更优选至少110%,115%,120%,130%，140%，150%,160%,170%,180o/o,190%或至少200%。或者，相对于第O分钟的活性的剩余活性优选是至少31%或至少32%。下列提供了改进的热稳定性的取代是优选的(见表9):273L,46E，362R和/或53V。在一具体实施方式中，本发明的肌醇六磷酸酶变体与参考肌醇六磷酸酶相比对热更加稳定，其中热稳定性通过应用上述四种试验中的任何试验来测定(基于实例1,5，8，9或12)。在具体实施方式中，预期SEQIDN0:2的肌醇六磷酸酶的下列变体具有改进的热稳定性(在各分组内，以优选的顺序)(i)K141C/V199C，Q91C/W46C,G52C/A99C,N31C/E176C,N31C/T177C，G59C/F100C，S162C/S247C;(ii)D41P，Q91P,N136P,T137P，L154P,S161P，T355P,Q111P,K240P,G282P，T283P,T284P，G289P,N4P，G5P;(iii)G52E，V55I，E57Y,L104A/A105F,K107D,G，Q109A,G，T76G，A84Y，N121T,B62K，M273L,Q，E285GR，N286Q,V294T,I299L,E331K/V55D,F351Y;(iv)El*，El*/E2*，El*/E2*/Q3*;(v)用更短的环取代C178和C187之间包含的环，所述更短的环选自例如，QADKP，GEDKP,NGISA,IAGKS,KEKHQ,KEKQQ,KEKKV，KTDKL;(vi)E119R,K，E411R，K;(vii)K107E,R164E,D;(iix)1362R，K，T276R,K，B79R，K，V409D，E，Q223E,N385D,W46D，E，T410D,E，Q82E。(ix)用选自例如，HQEKMGTMDPT,HQQDIKQVDSL，HQPEIGKMDPV,TQADTSSPDPL,HQQDIKQADPL,TQTDTSSPDPL，NQADLKKTDPL的环取代残基114和124之间面对活性位点的环(YQKDEEKNDPL);(x)R339D。温度曲线本发明的肌醇六磷酸酶与参考肌醇六磷酸酶相比是否具有修改的温度可以如实施例10中所述来确定。因此，在一具体实施方式中本发明的肌醇六磷酸酶与参考肌醇六磷酸酶相比具有修改的温度曲线，其中将温度曲线测定为在20-90。C范围内(以10。C为一级)pH5.5时肌醇六磷酸酶针对肌醇六磷酸钠的活性相对于温度的函数。优选的緩冲液是在0.25M乙酸钠緩冲液，pH5.5中。各温度的活性优选表示为相对于在最佳温度的值标准化后的相对22活性(以％表示)。最佳温度是测试的温度(即以10°C为一次跨越的那些温度)中活性最高时的温度。在一优选实施方式中，本发明的肌醇六磷酸酶在70。C时具有至少18%,或至少19%，20%，21%,22%,23%，24%,或至少25%的相对活性。如上面所解释，这是相对于在最佳温度时的活性。更优选地，本发明的肌醇六磷酸酶在70°C时具有至少26%，27%，28%,29%,30%,31%，或至少32%的相对活性。提供修改的温度曲线的优选取代(以在70。C具有更高相对活性的形式)是(见表7》57Y，76G,107G,273L,362K，46E，362R，53V和/或241Q。它们在70。C时的相对活性与SEQIDNO:3和4的参考肌醇六磷酸酶相比更高，并且在一些情况下(57Y,76G，107G，273L,362K,362R和/或53V)与SEQIDNO:2的参考肌醇六磷酸酶相比也是这样。。H曲线本发明的肌醇六磷酸酶与参考肌醇六磷酸酶相比是否具有修改的pH曲线可以如在实施例11中所述来测定。因此，在一具体实施方式中本发明的肌醇六磷酸酶与参考肌醇六磷酸酶相比具有修改的pH曲线，其中将pH曲线确定为在37°C时在pH2.0至7.5范围内(以0.5个pH单位为一级)针对肌醇六磷酸钠的肌醇六磷酸酶活性作为pH的函数。优选的緩冲液是50mM甘氨酸，50mM乙酸和50mMBis-Tris的混合液(cocktail)。另一个优选的緩沖液是0.25M乙酸钠。在每个pH的活性优选表示为相对于在最佳pH的值标准化后的相对活性(以％表示)。修改的pH曲线的实例是pH曲线(相对活性作为pH的函数)向更高或更低的pH偏移。与SEQIDNO:2，3或4的参考肌醇六磷酸酶相比，提供向更高pH偏移0.5pH单位的优选取代是(见表8):46E和/或218Q。修改的pH曲线的其他实例是其中最佳pH向上方或向下方改变。与SEQIDNO:2，3或4相比，提供更低的最佳pH的优选取代是(见表8):46E，121D和/或200K。与SEQIDNO:2，3或4相比，提供更高的最佳pH的优选取代是(见表8):218Q和/或241Q。修改的pH曲线还可以如实施例1("修改的pH曲线pH3.5/5.5活性比的测定")中所述测定，即，通过比较在pH3.5和5.5时的磷酸酶活性。可供选择地，pH3.5时的活性可以与pH4.0,4.5或5.0时的活性比较。在更进一步的可供选择的实施方式中，比较的是肌醇六磷酸酶活性而非磷酸酶活性。在一具体实施方式中，本发明的肌醇六磷酸酶与参考肌醇六磷酸酶相比具有修改的pH曲线。更具体的，pH曲线在pH3.5-5.5范围内修改。进一步更具体的，在pH4.0，4.5,5.0和/或5.5时的活性是在最佳pH(pH3.5)时的活性的至少50%，55%，60%,65%，70%,75%,80%,85%，90°/。或至少95%的水平。多肽的pH曲线，以及最佳pH可以通过在各种pH值下温育该多肽来测定，所述温育应用事先确定好浓度的底物并在固定的温育温度下进行。pH曲线是肌醇六磷酸酶活性相对于pH的图解，最佳pH从该pH曲线中确定。在一具体实施方式中，应用了实施例1的磷酸酶或月几醇六石寿酸酶测定法，例如底物是5mM肌醇六磷酸钠，反应温度37。C,并且在各pH值测定活性，例如pH2-12，用合适的緩冲液替换pH5.5乙酸緩冲液。合适的緩冲液的实例是0.1M甘氨酉^/HC1(pH2.0-3.5)，0.1MNaAc/Ac(pH4.0-5.0)，0.1MBis画Tris/HCl(pH5.5-6.5),0.1MTris/HCl(pH7.0)。緩冲液的其他实例是用HCl或NaOHi周节至pH^(直2.0，2.5,3.0，3.5,4.0，5.0,6.0,7.0，8.0,9.0,10.0,ll.O和12.0的100mM琥珀酸，100mMHEPES，100mMCHES，100mMCABS。在具体实施例中，预期SEQIDNO:2的肌醇六磷酸酶的以下变体具有修改的pH曲线(在各分组内，以优选的顺序)(i)E218Q，D324N，T200R，K，N121D，E196Q，D202N，E406A，E167Q，E53V,Q，E241Q,D314N，G,E239Q，E285N;(ii)用选自例如HQEKMGTMDPT，HQQDIKQVDSL,HQPEIGKMDPV，TQADTSSPDPL，HQQDIKQADPL，TQTDTSSPDPL，NQADLKKTDPL的环取代残基114和124之间面对活性位点的环(YQKDEEKNDPL)。比活性在一具体实施例中，本发明的肌醇六磷酸酶相对于参考肌醇六磷酸酶具有改进的比活性。更具体的，本发明的肌醇六磷酸酶的比活性是相对于通过相同步骤测定的参考肌醇六磷酸酶的比活性的至少105%。在更进一步的具体实施方式中，相对的比活性是至少110，115,120,125，130,140,145,150，160,170，180,l卯，200，220，240，260，280，300，350或甚至400%，仍相对于通过相同步骤测定的参考肌醇六^l酸酶的比活性。在可供选择的情况下，术语高的比活性指的是至少200FYT/mg酶蛋白(EP)的比活性。在具体实施方式中，比活性是至少300，400,500，600,700,800，900，1000，1100，1200，1300，1400,1500，1600，1700,1800，1900,2000，2100,2200，2300，2400,2500,2600，2700，2800,2900或3000FYT/mgEP。比活性是针对高度纯化的样品(SDS聚丙烯酰胺凝胶应显示只有一种成分存在)测量的。酶蛋白的浓度可以通过氨基酸分析来测定，以FYT单位表示的肌醇六磷酸酶活性通过如实施例1中所述测定。比活性是所讨论的具体肌醇六磷酸酶变体的一种特征，并且将其作为以如下单位测量的肌醇六磷酸酶活性来计算，即每毫克肌醇六磷酸酶变体酶蛋白的FYT单位数。进一步细节参见实施例7。在具体实施方式中，预期SEQIDNO:2的肌醇六磷酸酶的下列变体具有修改的比活性，其中以优选的顺序，将残基114和124之间面对活性位点的环(YQKDEEKNDPL)用选自下列的环取代，例如，HQEKMGTMDPT,HQQDIKQVDSL，HQPEIGKMDPV,TQADTSSPDPL,HQQDIKQADPL，TQTDTSSPDPL，NQADLKKTDPL。在动物饲料中的性能在一特定实施方式中本发明的肌醇六磷酸酶在动物飼料中与参考肌醇六磷酸酶相比具有改进的性能。在动物飼料中的性能可以通过实施例6中的体外模型来测定。因此，在一优选实施方式中本发明的肌醇六磷酸酶在动物饲料中具有改进的性能，其中所述性能在体外模型中测定，通过制备由30%大豆粉(soybeanmeal)和70。/。玉米粉(maizemeal)组成的饲料样品，向该饲料样品添加CaCl2至每千克饲料5克钩的浓度；在40。C和pH3.0条件下预温育它们30分钟，接着添加胃蛋白酶(3000U/g饲料)和肌醇六磷酸酶；在40°C和pH3.0条件下预温育样品60分钟接着在pH4.0条件下30分钟；终止反应；通过添加HC1至终浓度0.5M并在40。C温育2小时，接着进行一次冻融循环并在40。C温育1小时来提取肌醇六磷酸和磷酸肌醇；通过高效离子层析(highperformanceionchromatography)来分离月几醇六磷酸和磷酸月几醇；测定残余的肌醇六磷酸磷(IP6-P)的量；计算经肌醇六磷酸酶处理的和未经肌醇六磷酸酶处理的空白样品之间残余IP6-P的差异(该差异是降解的IP6-P);相对于参考肌醇六磷酸酶(例如具有SEQIDNO:3和4的肌醇六磷酸酶)的降解的IP6-P来表示本发明的肌醇六磷酸酶的降解的IP6-P。当然本发明的肌醇六磷酸酶和参考肌醇六磷酸酶是以相同的量，优选基于肌醇六磷酸酶活性单位(FYT)来给药。优选的剂量是125FYT/千克飼料。另一个优选的剂量是250FYT/千克饲料。肌醇六^f岸酸酶可以以纯化的MJ享六磷酸酶形式，或以发酵上清的形式给药。纯化的肌醇六磷酸酶优选具有至少95%的纯度，如由SDS-PAGE测定。在优选的实施方式中，本发明的纯化肌醇六磷酸酶的降解的IP6-P值，相对于参考肌醇六磷酸酶的降解的IP6-P值，是至少101%，或至少102%,103%,104%，105%,110%,115%,或至少120%。在更进一步的优选实施方式中，本发明的纯化肌醇六磷酸酶的降解的IP6-P值，相对于参考肌醇六磷酸酶的降解的IP6-P值，是至少125%,130%,140%，150%，160%,170%，180%，190%，或至少200%。优选地，本发明的肌醇六磷酸酶的降解的IP6-P值，相对于SEQIDNO:2肌醇六磷酸酶的降解的IP6-P值，是至少105%,110%,113%,115%,120%，125%,或至少130%。与SEQIDNO:3的肌醇六磷酸酶相比，下列取代提供了改进的或至少同样优秀的在体外动物饲料中的性能(见表4A):4P,5P，111P,1*，1*/2*,1*/2*/3*,273L，286Q。与SEQIDNO:3的肌醇六磷酸酶相比，下列取代也提供了改进的或至少同样优秀的在体外动物饲料中的性能(见表4A):57Y,76G，107G，362K，362R，121D,196Q，200K,202N，314N,406A和关于动物飼料性能的更加优选的取代是57Y,76G，362K,362R,121D,196Q，200K，202N和406A。本发明的肌醇六磷酸酶的相对性能还可以作为由参考肌醇六磷酸酶释放的磷的百分比来计算。在更进一步的具体实施方式中，本发明的肌醇六磷酸酶的相对性能可以作为由本发明的肌醇六磷酸酶释放的磷相对于由参考肌醇六磷酸酶释放的磷量的百分比来计算。在更进一步的具体实施方式中，本发明的肌醇六磷酸酶的相对性能是至少105%,优选至少110,120，130,140，150,160,170，180，190，或至少200%。降低的蛋白酶敏感性在一具体实施方式中，本发明的肌醇六磷酸酶具有降低的蛋白酶敏感性。更具体的，它对Kex2蛋白酶具有降低的敏感性，意味着发生通过这种蛋白酶的切割的趋势降低。变体339D，优选R339D，是具有降低的蛋白酶敏感性的本发明的肌醇糖基化模式糖基化是仅在真核细胞如真菌和转基因植物中表达蛋白时观察到的现象，但未在原核细胞如细菌中观察到。有各种类型的糖基化，但在本文中最相关的是N-糖基化，即天冬酰胺连接的糖基化，其中从N-乙酰葡糖胺分子附接于天冬酰胺起始，使糖附接于蛋白。已经发现N-糖基化只发生于在序列中是下列三肽的一部分的天冬酰胺N-X-T或N-X-S，其中X代表任何氨基酸。令人惊讶地，当SEQIDNO:2的肌醇六磷酸酶在真菌(酵母)巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)中表达时，与在枯草芽孢杆菌中表达时相比，发现了更低的热稳定性，见实施例2。该发现引起了本发明的提议，即通过改变潜在的糖基化位点，可以改进在真菌中表达的肌醇六磷酸酶的热稳定性。因此本发明还涉及具有修改的糖基化模式，优选修改的N-糖基化位点的肌醇六磷酸酶变体。期望当在真菌中表达时，修改的糖基化会赋予肌醇六磷酸酶变体改进的热稳定性。肌醇六磷酸酶的实例是细菌肌醇六磷酸酶，例如革兰氏-阴性(Gram-negative)肌醇六磷酸酶，如大肠杆菌(E.coli)和柠檬酸杆菌属(Citrobacter)肌醇六磷酸酶及其变体，包括本发明的月几醇六磷酸酶以及本文SEQIDNO:2，SEQIDNO:3，SEQIDNO:4，SEQIDNO:6和SEQIDNO:9的肌醇六磷酸酶。真菌的表达宿主的实例是毕赤酵母属(Pichia)，酵母属(Saccharomyces)和曲霉属(Aspergillus)菌种。在具体的实施方式中，下列本发明的肌醇六磷酸酶(例如SEQIDNO:2的变体)期望具有修改的糖基化模式，以优选的顺序N31T,N74A,N171T，N203T，N281H,N316D,N308A。下列是取代N-X-T型模式N31T,N74A,N281H。下列是取代N画X-S型模式N171T，N203T，N308A，N316D。低变应原性的变体27在一具体实施方式中，本发明的肌醇六磷酸酶(也)是低变应原性的变体，计划当与动物，包括人接触时，可引起降低的免疫应答。术语免疫应答应理解成由接触肌醇六磷酸酶变体的动物的免疫系统产生的任何反应。一个类型的免疫应答是变应性应答，其导致被接触的动物体内IgE水平的增高。低变应原性的变体可以使用本领域已知的技术来制备。例如肌醇六磷酸酶变体可以与聚合物基团屏蔽部分(polymermoietiesshieldingportions)或免疫应答涉及的肌醇六磷酸酶变体的表位结合。与聚合物的结合可涉及聚合物对肌醇六磷酸酶变体的体外化学偶联，例如，如在WO96/17929,WO98/30682，WO98/35026和/或WO99/00489中所述。结合可以额外或可选择地涉及聚合物与肌醇六磷酸酶变体在体内的偶联。这种结合可以通过下述方法实现基因工程处理编码肌醇六磷酸酶变体的核酸序列，在肌醇六磷酸酶变体中插入编码其他糖基化位点的共有序列，和在能够使肌醇六磷酸酶变体糖基化的宿主中表达肌醇六磷酸酶变体，参见例如WO00/26354。^是供低变应原性的变体的另一种途径是以基因工程处理编码肌醇六磷酸酶变体的核苷酸序列从而引起肌醇六磷酸酶变体的自寡聚，导致所述肌醇六磷酸酶变体单体可屏蔽其他肌醇六磷酸酶变体单体的表位并且由此降低寡聚体的抗原性。这些产品和它们的制备在例如WO96/16177中描述。可以通过各种方法如WO00/26230和WO01/83559所述的噬菌体展示法，或EP561907中所述的随4/L方法来鉴定参与免疫应答的表位。一旦鉴定了表位，可通过已知的基因操作技术如定向诱变(参见例如WO00/26230，WO00/26354和/或WO00/22103)来改变它的氨基酸序列以产生改变的肌醇六磷酸酶变体的免疫性质，和/或可在足够接近表位处进行聚合物的结合，以使聚合物屏蔽所述表位。核酸序列和构建体本发明还涉及包含编码本发明肌醇六磷酸酶变体的核酸序列的核酸序列。术语"分离的核酸序列"是指基本上(essentially)不含其他核酸序列的核酸序列，例如如通过琼脂糖凝胶电泳测定，至少约20%纯的，优选至少约40%纯的，更优选至少约60%纯的，甚至更优选至少约80%纯的，最优选至少约90%纯的。例如，分离的核酸序列可以通过在基因工程中所用的标准克隆方法获得，以使核酸序列从其天然位置重新定位到其将进行复制的不同位置。克隆方法可以涉及切除和分离包含编码多肽的核酸序列的期望核酸片段，将片段插入载体分子，以及将重组载体并入宿主细胞，在该宿主细胞中将复制该核酸序列的多个拷贝或克隆。核酸序列可以是基因组的，cDNA，RNA,半合成的，合成的来源，或它们的任意组合。本发明的核酸序列可以通过引入至少一个突变到模板肌醇六磷酸酶编码序列或其亚序列内来制备，其中突变的核酸序列编码变体肌醇六磷酸酶。向核酸序列中引入突变，以用一个核酸替换另一个核酸，这可以通过本领域4壬何已知的方法完成，例如通过定向i秀变，通过随4几-漆变，或通过掺入的(doped),楔入的(spiked)，或局部的随才几"i秀变(localizedrandommutagenesis)。基酸序列的基因的至少三个部分上进行，或在完整基因内进行。当通过使用寡核苷酸来进行诱变时，可以在寡核苦酸的合成过程中在将要改变的位置将所述三个非亲本(non-parent)核香酸掺入(doped)或楔入(spiked)该寡核苷酸。进行掺入或楔入从而避免不想要的氨基酸的密码子。掺入的或楔入的寡核苷酸可以通过任何技术并入编码肌醇六磷酸酶的DNA中，例如，PCR,LCR或认为合适的任何DNA聚合酶和连接酶。优选地，掺入用"恒定随机掺入(constantrandomdoping)"来进行，其中在每个位置的野生型和突变的百分比是预先定义的。此外，可以使掺入致力于优选引入特定核苷酸，并因此优选引入一种或多种特定的氨基酸残基。掺入可以做成例如，使其允许在每个位置引入90°/。野生型和10%突变。在掺入设计的选择方面的另一个考虑是基于遗传的以及蛋白结构的限制。随枳3秀变可以有利地局限于所讨^r的亲本"几醇六》粦酸酶的部分。例如，当已经鉴定了酶的某些区域对于该酶的特定特性尤其重要时，这种方式可能是有利的。提供本发明变体的可供选择的方法包括基因改组(shuffling)，例如如WO95/22625或WO96/00343中所述，以及如EP897985中所述的共有序列衍生方法(consensusderivationprocess)。核酸构建体核酸构建体包含本发明的核酸序列，该序列与一个或多个调控序列可操作地连接，所述调控序列在合适的宿主细胞内在与该调控序列相容的条件下指导编码序列的表达。应将表达理解为包括多肽生成中涉及的任何步骤，包括但不限于，转录，转录后修饰，翻译，翻译后修饰和分泌。29这里所用的术语"核酸构建体，，是指单链或双链的核酸分子，所述核酸分子分离自天然存在的基因，或者修饰所述核酸分子以使其以本来不会存在于自然界中(wouldnototherwiseexistinnature)的方式含有核酸的片l殳。当核酸构建体包含表达本发明的编码序列所需的调控序列时，术语核酸构建体与术语"表达盒"(expressioncassette)同义。术语"调控序列"在本文定义为包括对于编码本发明的多肽的多核苷酸表达是必需的或有利的所有成分。对于编码多肽的核酸序列而言每个调控序列可以是天然的或外源的。这样的调控序列包括，但不限于，前导序列，多腺苦酸化序列，前肽序列，启动子，信号肽序列和转录终止子。最少的情况，调控序列包括启动子，和转录的和翻译的终止信号。调控序列可以和用于引入特异性限制位点的接头一起提供，所述特异性限制位点促进调控序列与编码多肽的核苷酸序列编码区的连接。术语"可操作地连接"在本文表示这样的构型，其中将调控序列置于相对于多核苷酸序列的编码序列的恰当位置，从而使调控序列指导多肽编码序列的表达。当用于本文时术语"编码序列"(CDS)表示直接指定其蛋白产物的氨基酸序列的核苷酸序列。编码序列的边界一般由开读框决定，通常以ATG起始密码子或其他的起始密码子如GTG和TTG开始。编码序列可以是DNA，cDNA或重组核苦酸序列。表达载体术语"表达"包括多肽生成中涉及的任何步骤，但不限于，转录，转录后修饰，翻译，翻译后修饰以及分泌。术语"表达载体"在本文定义为线性的或环状的DNA分子，其包含编码本发明的多肽的多核苷酸，并且所述多核苷酸与提供用于其表达的额外核苷酸可操作地连接。编码本发明的肌醇六磷酸酶变体的核酸序列可以使用表达载体表达，所述表达载体通常包括调控序列，其编码启动子，操纵子，核糖体结合位点，翻译起始信号，和任选地阻抑基因或各种活化基因。携带编码本发明的肌醇六磷酸酶变体的DNA序列的重组表达载体可以是任何载体，其可以方便地进行重组DNA方法，载体的选择经常取决于其将导入的宿主细胞。载体可以是这样一种载体，当将其导入宿主细胞时，该载体整合进宿主细胞基因组并与整合了它的染色体一起复制。肌醇六磷酸酶变体还可以与在动物饲料方面感兴趣的至少一种其他的酶一起共表达，所述其他的酶例如肌醇六磷酸酶，磷酸酶，木聚糖酶，半乳聚糖酶，a-半乳糖苷酶，蛋白酶，磷脂酶，淀粉酶，和/或P-葡聚糖酶。酶可以从不同载体共表达，从一个载体共表达，或应用两种技术的组合。当使用不同载体时，载体可以有不同的选择标记，以及不同的复制起点。当仅使用一个载体时，各基因可以从一个或多个启动子表达。如果在一个启动子的调控下克隆(二或多顺反子的)，基因克隆的顺序可能影响蛋白的表达水平。还可以将肌醇六磷酸酶变体作为融合蛋白来表达，即已经将编码肌醇六磷酸酶变体的基因符合读框地(inframe)融合到编码另一蛋白的基因中。该蛋白可以是其他酶或来自其他酶的功能结构域。宿主细胞术语"宿主细胞"，如本文所用的，包括对于使用包含本发明的多核苷酸的核酸构建体的转化，转染，转导等易感的任何细胞类型。本发明还涉及适合用于多肽的重组生产的重组宿主细胞，其包含本发明的多核苷酸。将包含本发明的多核苷酸的载体导入到宿主细胞，从而使该载体作为染色体整合体或作为如早先所述的自复制染色体外载体保持。术语"宿主细胞"包括亲本细胞的任何子代，其由于在复制期间发生的突变而与亲本细胞不完全相同。宿主细胞的选择将很大程度上依赖于编码多肽的基因及其来源。宿主细胞可以是单细胞微生物，例如原核细胞，或非单细胞微生物，例^口4才亥纟田月包。有用的单细胞微生物是细菌细胞，例如革兰氏阳性细菌，包括，但不限于，芽孢杆菌属(Bacillus)细胞，例如，嗜碱芽孢杆菌(Bacillusalkalophilus)，角罕淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens),短芽孢杆菌(Bacillusbrevis),环状芽孢杆菌(Bacilluscirculans),克劳氏芽孢杆菌(Bacillusclausii)，凝结芽孢杆菌(Bacillussoagulans)，杣烂芽孢杆菌(Bacilluslautus)，迟緩芽孢杆菌(Bacilluslentus),地衣芽孑包杆菌(Bacilluslicheniformis),巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium),嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)，枯草芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis);或链霉菌属(Streptomyces)细胞，例如，浅青紫链霉菌(Streptomyceslividans)和鼠灰链霉菌(Streptomyces31murinus);或革兰氏阴性细菌，例如大肠杆菌(E.coli)和假单胞菌属菌种(Pseudomonassp)。在优选的方面，细菌宿主细胞是迟緩芽孢杆菌，地衣芽孢杆菌，嗜热脂肪芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌细胞。在另一优选的方面，芽孢杆菌属细胞是嗜碱芽孢杆菌(alkalophilicBacillus)。向细菌宿主细胞导入载体可以通过如下方法来完成例如原生质体转化(参见，例如，Chang和Cohen，1979,MolecularGeneralGenetics168:111-115),利用感受肽细胞(参见，例如，Young和Spizizin，1961，JournalofBacteriology81:823-829,或Dub腿和Davidoff-Abelson，1971,JournalofMolecularBiology56:209-221)，电穿孔(参见，例如，Shigekawa和Dower,1988,Biotechniques6:742-751)，或4妄合(conjugation)(参见，Koehler和Thorne,1987，JournalofBacteriology169:5771-5278)。宿主细胞还可以是真核生物，例如哺乳动物，昆虫，植物或真菌细胞。在优选的方面，宿主细胞是真菌细胞。这里用到的"真菌，，包括以下门子嚢菌门(Ascomycota)，4旦子菌门(Basidiomycota),壶菌门(Chytridiomycota)禾口4妻合菌门(Zygomycota)0口由Hawksworth等,在AinsworthandBisby，sDictionaryofTheFungi,她edition,1995,CABInternational,UniversityPress,Cambridge,UK中所定义)以及卵菌门(Oomycota)(如在Hawksworth等，1995,同上，171页中所引用)，和所有有丝分裂孢子真菌(mitosporicfUngi)(Hawksworth等，1995，同上)。在更优选的方面，真菌的宿主细胞是酵母细胞。"酵母"如本文所用包括产子嚢酵母(ascosporogenousyeast)(内孢霉目(Endomycetales))，产担子酵母(basidiosporogenousyeast)，和属于半知菌类(FungiImperfecti)(芽孑包纟冈(Blastomyetes))的酵母。由于酵母的分类在将来可能改变，就本发明而言，酵母应该定义为如在酵母生物学和活性(BiologyandActivitiesofYeast)(Skinner,F.A.，Passmore,S.M.禾口Davenport,R.R.，eds,Soc.App.Bacteriol.SymposiumSeriesNo.9,1980)中所述。在更优选的方面中，酵母宿主细胞是念珠菌属(Candida),汉逊酵母属(Hansenula)，克鲁维酵母属(Kluyveromyces),毕赤酵母属(Pichia),酵母属(Saccharomyces)，裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)或西洋蓍霉属(Yarrowia)细胞。在最优选的方面中，酵母宿主细胞是巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)，曱醇毕赤酵母(Pichiamethanolica)，卡尔酵母(Saccharomycescarlsbergensis),酉良酒酵母(Saccharomycescerevisiae)，并唐化酵母(Saccharomycesdiastaticus)，道格拉氏酵母(Saccharomycesdouglasii)，克鲁维酵母(Saccharomyceskluyveri),诺地酵母(Saccharomycesnorbensis)或卵形酵母(Saccharomycesoviformis)细胞。在另一最优选的方面中，酵母宿主细胞是乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyceslactis)细胞。在另一最优选方面中，酵母宿主细胞是解脂西;羊着雾(Yarrowialipolytica)纟田月包。在另一优选方面中，真菌宿主细胞是丝状真菌细胞。"丝状真菌"包括真菌(Eumycota)和卵菌(Oomycota)亚门中的全部丝状形态(如Hawksworth等,1995,同上所定义)。丝状真菌的特征通常在于由壳多糖，纤维素，葡聚糖，壳聚糖，甘露聚糖，以及其他复杂多糖所组成的菌丝体壁。营养生长是通过菌丝延长来实现并且碳分解代谢是专性需氧的。相反地，酵母例如酿酒酵母的营养生长是通过单细胞菌体的出芽来实现的并且碳分解代谢可以是发酵的。在更优选的方面中，丝状真菌宿主细胞是枝顶孢霉属(Acremonium)，曲霉属，短梗霉属(Aureobasidium)，烟管菌属(Bjerkandera)，拟蜡菌属(Ceriporiopsis)，鬼伞属(Coprinus)，革盖菌属(Coriolus),隐J求菌属(Cryptococcus)，网孢菌属(Filobasidium)，镰孢属(Fusarium),腐质霉属(Humicola)，瘟病菌属(Magnaporthe)，毛霉属(Mucor),毁丝霉属(Myceliophthora),新考玛脂霉属(Neocallimastix),脉孢菌属(Neurospora)，拟青霉属(Paecilomyces)，青霉属(Penicillium)，平革菌属(Phanerochaete)，射脉菌(Phlebia),瘤胃壶菌属(Piromyces),侧耳属(Pleurotus),裂褶菌属(Schizophyllum),踝节菌属(Talaromyces)，嗜热子嚢菌属(Thermoascus),梭孢壳属(Thielavia),弯颈霉属(Tolypocladium)，栓菌属(Trametes)或木霉属(Trichoderma)细胞。在最优选的方面中，丝状真菌宿主细胞是泡盛曲霉，烟曲霉(Aspergillusfumigatus),臭曲霉(Aspergillusfoetidus),曰本曲霉(Aspergillusjaponicus),斗勾巢曲霉(Aspergillusnidulans)，，繁、曲霉(Aspergillusniger)或米曲霉(Aspergillusoryzae)细胞。在另一个最优选的方面中，丝状真菌宿主细胞是杆孑包一夫镰孑包(Fusarmmbactridioides)，禾谷镰孑包(Fusariumcerealis),库威镰孑包(Fusariumcrookwellense),大刀镰孑包(Fusariumculmorum),禾本牙牛镰孑包(Fusariumgraminearum),禾赤嫌孢(Fusariumgraminum)，异孑包嫌孑包(Fusariumheterosporum)，合欢木嫌孑包(Fusariumnegundi)，尖嫌孑包(Fusariumoxysporum)，多枝镰孑包(Fusariumreticulatum),粉红嫌孑包(Fusariumroseum)，接骨木嫌孑包(Fusariumsambucinum)，月夫色镰孑包(Fusariumsarcochroum)，拟分4支孑包镰孑包(Fusariumsporotrichioides),疏色嫌孑包(Fusariumsulphureum)，圆錄孢(Fusariumtorulosum)，拟丝孑包镰孑包(Fusariumtrichothecioides)或镶片镰孑包(Fusariumvenenatum)细胞。在另一个最优选的方面，丝状真菌宿主细胞是黑刺烟管菌(Bjerkanderaadusta)，干4以堵菌(Ceriporiopsisaneirina)，干4以错菌,Ceriporiopsiscaregiea,Ceriporiopsisgilvescens，Ceriporiopsispannocinta，Ceriporiopsisrivulosa,Ceriporiopsissubrufa或虫4以蜡菌(Ceriporiopsissubvermispora)，灰盖鬼伞(Coprinuscinereus)，毛革盖菌(Coriolushirsutus)，特异腐质霉(Humicolainsolens)，疏棉状腐质霉(Humicolalanuginose)，米黑毛霉(Mucormiehei)，嗜热毁丝霉(Myceliophthorathermophila)，粗糙脉孢菌(Neurosporacrassa)，产紫青霉(Penicilliumpurpurogenum)，黄孑包原毛平革菌(Phanerochaetechrysosporium)，辐射射月7jc菌(Phlebiaradiata),刺芽侧耳(Pleurotuseryngii)，土生梭孢霉(Thielaviaterrestris)，长绒毛栓菌(Trametesvillosa),杂色栓菌(Trametesversicolor)，哈茨木霉(Trichodermaharzianum)，康宁木霉(Trichodermakoningii),长枝木霉(Trichodermalongibrachiatum)，里氏木霉(Trichodermareesei)或绿色木霉(Trichodermaviride)菌林的纟田胞。真菌细胞可以通过涉及原生质体形成，原生质体转化以及细胞壁再生的方法以本身已知的方式来转化。转化曲霉属和木霉属宿主细胞的合适方法在EP238023和Yelton等,1984,ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA81:1470-1474中有描述。转化镰孢属菌种的合适方法由Malardier等，1989，Gene78:147-156和WO96/00787描述。可以利用Becker和Guarente，在Abelson，J.N.禾口Simon,M.I.纟扁寿專的GuidetoYeastGeneticsandMolecularBiology,MethodsinEnzymology，巻194,182-187页，AcademicPress,Inc.,NewYork;Ito等，1983,JournalofBacteriology153:163;和Hinnen等，1978,ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA75:1920.中所述的方法将酵母转化。制备方法
技术领域：
：本发明还涉及用于制备本发明的肌醇六磷酸酶的方法，其包括(a)在有益培养宿主细胞；以及(b)回收肌醇六磷酸酶。在本发明的制备方法中，应用本领域所熟知的方法在适合多肽产生的营养培养基中培养细胞。例如，可以通过摇瓶培养，以及在实验室或工业发酵罐中的小规模或大规模发酵(包括连续的，分批，补料分批(fed-batch)，或固态发酵)，在合适的培养基中并在允许所述多肽表达和/或分离的条件下进行。利用本领域已知的方法，在合适的营养培养基中进行培养，所述培养基包含碳源和氮源和无机盐。合适的培养基可从供应商处获得，或可以按照公开的成分制备(例如，在美国典型培养物保藏中心(AmericanTypeCultureCollection)的目录中)。如果多肽分泌到营养培养基中，则可以从培养基直接回收多肽。如果多肽没有分泌，则可以从细胞裂解物中回收。得到的多肽可以用本领域已知方法回收。例如，可以通过常规的方法包括，但不限于，离心，过滤，提取，喷雾干燥，蒸发或沉淀，从营养培养基中回收多肽。本发明的多肽可以通过多种本领域已知的方法来纯化，包括但不限于，层析(例如，离子交换，亲和，疏水，层析聚焦，和大小排阻)，电泳方法(例如，制备型等电聚焦)，差示溶解度(例如，硫酸铵沉淀)，SDS-PAGE或提取(参见，例i口，ProteinPurification,J,-C,Janson和LarsRyden,编4辱，VCHPublishers,NewYork,1989)。转基因植物本发明还涉及转基因植物，植物部分或植物细胞，其已经使用编码具有本发明的肌醇六磷酸酶活性的多肽的核香酸序列转化，从而以可回收的量表达和产生所述多肽。多肽可以从植物或植物部分中回收。可供选择地，包含重组多肽的植物或植物部分可以如这样应用，用以改进食物或饲料的质量，例如，改进营养价值，适口性和流变性质，或破坏抗营养(antinutritive)因子。在具体实施方式中，多肽靶向种子中的胚乳储藏泡(endospermstoragevacuole)。这可以通过将其合成为具有合适信号肽的前体来实现，参见Horvath等，在PNAS，2000年2月15日，97巻，4号，1914-1919页中。转基因植物可以是双子叶的(双子叶植物)或单子叶的(单子叶植物)或它们基因工程化的变体。单子叶植物的实例为草，例如草地早熟禾(meadowgrass)(蓝草(bluegrass),禾本一牛(Poa))，斗文草(foragegrass)侈'Ji口羊茅属(Festuca),黑麦草属(Lolium)，温带草例如剪股颖属(Agrostis)，以及谷类，35例如，小麦，燕麦，黑麦，大麦，稻，高粱，黑小麦(triticale)(小麦(小麦属(Triticum))和黑麦(黑麦属(Secale))的稳定杂合体)，以及玉米(maize)(玉米(corn))。双子叶植物的实例为烟草，豆类，例如向日葵(向日葵属(Helianthus)),棉花(棉属(Gossypium》，羽扇豆，马铃薯，糖甜菜(sugarbeet)，豌豆，菜豆(bean)以及大豆，和十字花科植物(十字花科(familyBrassicaceae))，例如花椰菜，油菜籽(rapeseed)，以及紧密关联的模式生物拟南芥(Arabidopsisthaliana)。低肌醇六磷酸盐植物如例如美国专利no.5,689,054和美国专利no.6,111,168所述的为基因工程化^f直物的实例。植物部分的实例为茎，愈伤组织，叶，根，果实，种子和块茎，以及包含这些部分的独立组织，例如表皮，叶肉，薄壁组织，维管组织，分生组织。特定的植物细胞区室，例如叶绿体，质外体(apoplast)，线粒体，液泡，过氧化物酶体，以及细胞质也被认为是植物部分。此外，任何植物细胞，不管组织来源如何，均认为是植物部分。同样，植物部分，例如为促进本发明的应用而分离的特定组织和细胞也被认为是植物部分，例如胚，胚乳，糊粉和种皮(seedcoats》在本发明范围内还包含这些植物，植物部分和植物细胞的子代。可以按照本领域已知的方法构建表达本发明多肽的转基因植物或植物细胞。简要地，如下构建转基因植物或植物细胞，通过将一个或多个编码本发明多肽的表达构建体掺入植物宿主基因组，并使得到的经修饰的植物或植物细胞增殖成为转基因植物或植物细胞。方便地，表达构建体是核酸构建体，其包含编码本发明的多肽的核酸序调控序列可操作地连接。此外，表达构建体可以包含选择标记用于鉴定整合了表达构建体的宿主细胞以及对于将构建体导入所述植物所必需的DNA序列(后者依赖于所应用的DNA导入方法)。调控序列，例如启动子和终止子序列和任选地信号或转运序列的选择，基于例如期望何时，何处以及如何表达多肽来决定。例如,编码本发明的多肽的基因的表达可以是组成型或诱导型，或可以是发育，阶段或组织特异性的，并且基因产物可以靶向特定细胞区室，组织或植物部分如种子或叶。调控序列是，例如，由Tague等，1988，PlantPhysiology86:506所描述的。对于组成型表达，可以使用下列启动子35S-CaMV启动子(Franck等,361980,Cell21:285-294)，玉米泛素1(ChristensenAH,SharrockRA和Quail1992.Maizepolyubiquitingenes:structure,thermalperturbationofexpressionandtranscriptsplicing,andpromoteractivityfollowingtransfertoprotoplastsbyelectroporation),或稻肌动蛋白1启动子(PlantMo.Biol.18,675-689.;ZhangW，McElroyD.和WuR1991,AnalysisofriceActl5，regionactivityintransgenicriceplants.PlantCell3,1155-1165)。器官特异性的启动子可以是，例如，贮存库组织(storagesinktissue)例如种子，马铃薯块茎和果实的启动子(Edwards&Coruzzi，1990,Ann.Rev.Genet.24:275-303),或来自代谢库组织(metabolicsinktissue)例如分生组织的启动子(Ito等，1994,PlantMol.Biol.24:863-878)，种子特异性的启动子例如来自稻的谷蛋白，醇溶谷蛋白，球蛋白或白蛋白的启动子(Wu等，1998，PlantandCellPhysiology39:885-889),来自豆球蛋白B4和来自蚕豆(Viciafaba)的未知种子蛋白基因的蚕豆启动子(Conrad等，1998，JournalofPlantPhysiology152:708-711),来自种子油体蛋白(seedoilbodyprotein)的启动子(Chen等，1998,PlantandCellPhysiology39:935-941),来自欧洲油菜(Brassicanapus)的贮存蛋白napA启动子，或本领域已知的其他任何种子特异性的启动子，例如，如WO91/14772中所述。此外，启动子可以是叶特异启动子例如来自稻或番茄的rbcs启动子(Kyozuka等，1993,PlantPhysiology102:991-1000),小球藻病毒腺嘌呤曱基转移酶基因启动子(Mitra和Higgins,1994,PlantMolecularBiology26:85-93),或来自稻的aldP基因启动子(Kagaya等，1995，MolecularandGeneralGenetics248:668-674)，或损伤诱导型启动子例如马铃薯pin2启动子(Xu等，1993,PlantMolecularBiology22:573-588)。同样，启动子可以通过非生物(abiotic)处理例如温度，干旱或盐度变化来诱导，或可以通过外源施用的激活启动子的物质来诱导，所述物质例如乙醇，雌激素，植物激素如乙烯，脱落酸，赤霉酸和/或重金属。启动子增强元件还可以用于在植物中获得多肽更高的表达。例如，启动子增强元件可以是内含子，其置于启动子和编码本发明的多肽的核苷酸序列之间。例如，上述Xu等，1993，公开了利用稻肌动蛋白l基因的第一内含子来增强表达。更进一步，可以相对于研究的植物种类优化密码子选择以改进表达(参见上面提到的Horvath等)。选择标记基因和表达构建体的任何其他部分可以从本领域那些可获得的选取。按照本领域已知的常规技术将核酸构建体并入进植物基因组，这些技术包括农杆菌(Agrobacterium)介导的转化，病毒介导的转化，显微注射，粒子轰击，生物弹射转化以及电穿孔(Gasser等，1990，Science244:1293;Potrykus,1990,Bio/Technology8:535;Shimamoto等，1989,Nature338:274)。目前，根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)介导的基因转移是用于制备转基因双子叶植物的优选方法(参见综述Hooykas和Schilperoort，1992,PlantMolecularBiology19:15-38),并且它还可以用于转化单子叶植物，尽管对于这些植物更通常使用其他转化方法。目前，制备转基因单子叶植物的优选方法，除了农杆菌方法外，是胚俞伤组织或发育中的胚的粒子轰击(用转化DNA涂覆的精细金(microscopicgold)或鴒颗粒)(Christou,1992,PlantJournal2:275-281;Shimamoto,1994,CurrentOpinionBiotechnology5:158-162;Vasil等，1992,Bio/Technology10:667-674)。可供选择的单子叶植物转化方法基于原生质体转化，如Omimlleh等，1993,PlantMolecularBiology21:415-428所述。转化之后，按照本领域所熟知的方法选"f奪并入了表达构建体的转化体并代中可以选择性地去除选择基因，其通过利用例如使用两个分离的T-DNA构建体的共转化或者通过特定重组酶对选择基因进行位点特异性切除。本发明还涉及制备本发明的多肽的方法，其包括在有益于所述多肽生成的条件下培养转基因植物或植物细胞，所述转基因植物或植物细胞包含编码具有本发明肌醇六磷酸酶活性的多肽的核酸序列。转基因动物本发明还涉及转基因的非人动物以及它们的产品或成分，其实例为体液例如乳和血，器官，肉和动物细胞。用于表达蛋白的技术，例如在哺乳动物细胞中表达蛋白的技术，是本领域已知的，参见例如手册ProteinExpression:APracticalApproach(蛋白表达实用方法)，Higgins和Hames(编辑)，OxfordUniversityPress(牛津大学出版社)(1999)，以及该系列涉及基因转录，RNA加工和翻译后加工的三个手册。通常来说，为了制备转基因动物，用编码具有本发明的肌醇六磷酸酶活性的多肽的核酸序列转化所选动物的所选细胞，从而表达并制备多肽。可以从动物体中回收多肽，例如从雌性动物的乳中，或可以将多肽表达为有益于动物本身，例如辅助动物消化。动物的实例在下面标题为动物铜料的部分中提到。为了制备以从动物乳中回收多肽为目的的转基因动物，可以将编码多肽的基因插入到所讨论的动物的受精卵中，例如通过使用包含合适的乳蛋白启动子和编码所述多肽的基因的转基因表达载体。将转基因表达载体显微注射进受精卵，优选永久整合入染色体。一旦卵开始生长和分裂，就将潜在的胚胎植入代用的母体(surrogatemother),并且鉴定出携带该转基因的动物。获得的动物随即可以通过常规饲养来繁殖。多肽可以从动物乳中纯化，参见例^口Meade,H.M.等(1999):Expressionofrecombinantproteinsinthemilkoftransgenicanimals,Geneexpressionsystems:Usingnaturefortheartofexpression.(在转基因动物乳中表达重组蛋白，基因表达系统将自然性质用于表达技术).J,MFernandez和J,P,Hoeffler(编辑)，AcademicPress。在另一方面，为了制备在其体细胞和/或干细胞的基因组中携带有包含异源转基因构建体的核酸序列的非人转基因动物，其中所述异源转基因构建体包含编码多肽的转基因，可以将该转基因与用于多肽的唾液腺特异性表达的第一调控序列可操作地连接，如WO00/064247所公开。组合物和用途在更进一步的方面中，本发明涉及包含本发明的多肽的组合物，以及应用这些组合物的方法。多肽组合物可以按照本领域已知的方法来制备，并且可以以液体或干组合物的形式。例如，多肽组合物可以以颗粒或微颗粒形式存在。将要包括在组合物中的多肽可以按照本领域已知的方法来稳定化。本发明的肌醇六磷酸酶可以在任何工业环境中用于降解，例如，肌醇六磷酸盐，fl醇六磷酸和/或单，二，三，四和/或五磷酸"几醇。熟知这些化合物的磷酸部分螯合二价和三价的阳离子例如金属离子，包括但不限于(i.a.)营养必需离子钙，铁，锌和镁，以及痕量金属锰，铜和钼。此外，肌醇六磷酸还在某种程度上通过静电相互作用结合蛋白。因此，本发明的多肽的优选用途是在动物饲料制备物中(包括人类食物)或用于这些制备物的添加剂。在一具体实施方式中，本发明的多肽可以用于改进动物饲料的营养价值。改进动物饲料(包括人类食物)的营养价值的非限定性实例是改进饲料消化性；促进动物生长；改进饲料应用；改进蛋白的生物利用度；提高可消化磷酸盐的水平；改进肌醇六磷酸盐的释放和/或降解；改进痕量矿物质的生物利用度；改进大矿物质的生物利用度；消除添加补充性的磷酸盐，痕量矿物质和/或大矿物质的需要；和/或改进卵壳质量。饲料的营养价值因此增加，并且可以改进动物的生长速率和/或重量增加(weightgain)和/或饲^F转化率(即摄入的饲料重量相对于重量增加)。进而，本发明的多肽可以用于降低粪便中的肌醇六磷酸盐水平。动物，动物饲料以及动物祠料添加剂术语动物包括所有动物，包括人类。动物的实例是非反刍动物，和反刍动物。反刍动物包括，例如绵羊，山羊和牛(cattle)，例如奶牛(cow)如肉牛(beefcattle)和奶牛(dairycow)。在一具体实施方式中，动物是非反刍的动物。非反刍动物包括单胃的动物，例如猪(pig)或猪(swine)(包括但不限于，小猪(piglet),生长中的猪(growingpig)和母猪(sow));家禽例如火鸡，鸭和鸡(包括但不限于雏鸡(broilerchick),蛋鸡(layers));鱼(包括但不限于鲑鱼(salmon),鳟鱼(trout),罗非鱼(tilapia)，鯰鱼(catfish)和鲤鱼(carp));和曱壳类(包括但不限于河坏(shrimp)和7于虫下(prawn))。术语饲料或饲料组合物是指适合于动物摄入或意在由动物摄入的任何化合物，制备物，混合物或组合物。在按照本发明的用途中，可以在餐前，餐后或与进餐同时向动物喂食多肽。后者是优选的。在一具体实施方式中，多肽，以其添加到饲料中的形式，或当其包括在饲料添加剂中时，是基本上(substantially)纯的。在一具体实施方式中它是确定的(well-defined)。术语"确定的"意味着肌醇六磷酸酶制备物是至少50%纯的，如由大小排阻层析所测定(参见WO01/58275的实施例12)。在其他具体的实施方式中，如通过这种方法测定，肌醇六磷酸酶制备物是至少60，70,80,85，88,90,92，94或至少95%纯的。基本上纯的，和/或确定的多肽制备物是有利的。例如，以正确剂量给药基本上没有其他多肽干扰或污染的多肽容易得多。术语以正确剂量给药具体是指获得恒定(consistent)和不变的(constant)结果的目的，以及基于期望的效果优化剂量的能力。然而，对于在动物饲料中的应用，本发明的肌醇六磷酸酶多肽不需要那么纯；例如它可以包含其他多肽，在此情况下可以称其为MJI六磷酸酶制备物。肌醇六磷酸酶制备物可以(a)直接添加到饲料(或直接用于蛋白的处理方法)，或(b)可以用于一个或多个中间组分的生产，所述中间组分如随后添加的禾i度是^原始多肽制备物的纯度:无论按照:上面f的(a)或(b)应用。、'具有这种数量级的纯度的多肽制备物尤其可以应用重组生产方法来获得，反之通过传统发酵方法获得它们并不是很容易并且还具有高得多的批间差(batch-to-batchvariation)。这样的多肽制备物当然可以与其他多肽混合。多肽可以以任-f可形式添加到飼津+中，作为相对纯的多肽(beitasarelativelypurepolypeptide),或与意名夂添加到动物祠料中的其他组分混合，即以动物饲料添加剂的形式，例如所谓的动物饲料的预混合料(pre-mixes)。在进一步的方面中本发明涉及在动物祠3+方面使用的组合物，例如动物饲料，和动物饲料添加剂，例如预混合料。除本发明的多肽之外，本发明的动物添加剂含有至少一种脂溶性维生素，和/或至少一种水溶性维生素，和/或至少一种痕量矿物质。动物添加剂还可以包含至少一种大矿物质(macromineral)。另外，可选的，铜料添加剂成分是着色剂，例如类胡萝卜素如P-胡萝卜素，虾青素和叶黄素；芳香化合物；稳定剂；抗微生物肽；多不饱和脂肪酸；;舌'I"生氧生成4勿(reactiveoxygengeneratingspecies);禾口/或选自下歹'J之中的至少一种其他多肽肌醇六磷酸酶(EC3.1.3.8或3丄3.26);磷酸酶(EC3.1.3.1;EC3丄3.2;EC3丄3.39);木聚糖酶(EC3.2丄8);半乳聚糖酶(EC3.2.1.89);a-半乳糖芬酶(EC3.2.1.22);蛋白酶(EC3.4,,);磷脂酶Al(EC3丄1.32);磷脂酶A2(EC3丄1.4);溶血磷脂酶(EC3丄1.5);磷脂酶C(3丄4.3);磷脂酶D(EC3丄4.4);淀粉酶例如a-淀粉酶(EC3.2.1.1);和/或P-葡聚糖酶(EC3.2.1.4或EC3.2.1.6)。在一具体实施方式中这些其他的多肽是确定的(如上面对肌醇六磷酸酶制备物所定义的)。本发明的肌醇六磷酸酶还可以与其它肌醇六磷酸酶組合，例如子嚢菌类(ascomycete)肌醇六磷酸酶如曲霉属肌醇六磷酸酶，例如源自无花果曲霉(Aspergillusficuum)，黑曲霉或泡盛曲霉；或担子菌类(basidiomycete)肌醇六磷酸酶，例如源自Peniophoralycii,平田头恭(Agrocybepediades),绒毛栓菌(Trametespubescens)或巻边桩菇(Paxillusinvolutus);或具有肌醇六石舞酸酶活性的它们的衍生物，片段或变体。因而，在本发明的在动物饲料中的用途的优选实施方式中，以及在本发明的动物饲料添加剂和动物飼料的优选实施方式中，将本发明的肌醇六磷酸酶与这些肌醇六磷酸酶组合。抗微生物肽(AMP，s)的实例是CAP18，LeucocinA，Tritrpticin,Protegrin-l,Thanatin，防卫素(Defensin)，吝丄4夹蛋白(Lactoferrin)，Lactoferricin和Ovispirin如Novispirin(RobertLehrer,2000)，Plectasins和他汀类药物(Statins)，包才舌在WO03/044049和WO03/048148中所公开的化合物和多肽，以及保持抗微生物活性的上述各项的变体或片段。抗真菌多肽(AFP，s)的实例是巨大曲霉(Aspergillusgiganteus)和黑曲霉肽，以及保持抗真菌活性的它们的变体和片段，如在WO94/01459和WO02/090384中所公开的。多不饱和脂肪酸的实例是C18,C20和C22多不饱和脂肪酸，如花生四烯酸,二十二碳六烯酸(docosohexaenoicacid),十二碳五烯酸和y-亚油酸。活性氧生成物的实例是化学试剂例如过硼酸盐，过碌^酸盐或过^^酸钾；以及多肽例如氧化酶，加氧酶或合成酶。通常脂溶性和水溶性维生素，以及痕量矿物质形成意;&夂向饲料添加的所谓的预混合料的部分，而大矿物质则通常单独添加到饲料中。这些组合物类型中的任一种当加入有本发明的多肽时便成为本发明的动物饲料添加剂。在一具体实施方式中，意名夂将本发明的动物饲料添加剂以0.01至10.0%的水平包含于(或规定必须包含于)动物饮食或伺料中；更具体地以0.05至5.0%的水平；或0.2至1.0%的水平(％代表每100克饲料中添加剂的克数)。在预混合料中尤其是这样。下列是这些组分的非排他性实例列表脂溶性维生素的实例是维生素A，维生素D3，维生素E和维生素K，例如维生素K3。水溶性维生素的实例是维生素B12,生物素和胆碱，维生素Bl，维生素B2,维生素B6,烟酸，叶酸和泛酸盐(panthothenate),例如D-泛酸4丐42(Ca-D-panthothenate)。痕量矿物质的实例是锰，锌，铁，铜，碘，硒和钴。大矿物质的实例是钙，磷和钠。对这些组分的营养要求(用家禽和小猪/猪为例)在WO01/58275的表A中列出。营养要求意味着这些组分在饮食中应该以规定的浓度提供。在另一方面，本发明的动物饲料添加剂包含至少一种在WO01/58275的表A中指定的个体组分。至少一个意味着，一个或多个，一个，或两个，或三个，或四个和以此类推多至全部的十三个，或多至全部的十五个个体组分的任意一种。更具体地，这至少一种的个体组分以这样的量包括在本发明的添加剂中，该量提供在表A的第四列，或第五列，或第六列中说明的范围内的饲料中浓度(in画feed-concentration)。本发明还涉及动物饲料的组合物。动物飼料组合物或々大食具有相对高的蛋白含量。家禽和猪的饮食的特征可以如WO01/58275表B第2-3列中所述。鱼的饮食的特征可以如该表B的第4列中所述。此外这样的鱼类饮食通常具有200-310g/kg的粗脂肪含量。WO01/58275对应于US09〃79334,将其通过引用并入。本发明的动物饲料组合物具有50-800g/kg的粗蛋白含量，并且此外还包含至少一种本文要求保护的多肽。此外，或在可供选择的情况下(对于上述的粗蛋白含量)，本发明的动物饲料组合物具有含量为10-30MJ/kg的可代谢能量；和/或0.1-200g/kg的4丐含量；和/或0.1-200g/kg的可用磷(availablephosphorus)含量；和/或0.1-100g/kg的曱硫氨酸含量；和/或0.1-150g/kg的曱硫氨酸加半胱氨酸含量；和/或0.5-50g/kg的赖氨酸含量。在具体实施方式中，可代谢能量，粗蛋白，钓，磷，曱硫氨酸，曱硫氨酸加半胱氨酸，和/或赖氨酸的含量是在WO01/58275的表B中的范围2,3，4或5(R.2-5)中的任一之内。粗蛋白是以氮(N)乘以因子6.25来计算的，即粗蛋白(g/kg"N(g/kg)x6.25。氮含量由凯氏定氮法测定(A.O.A.C.，1984,OfficialMethodsofAnalysis14thed.,AssociationofOfficialAnalyticalChemists,WashingtonDC)。可代谢能量的计算可以基于NRC出版物猪的营养需求，第九次修订版1988，猪营养学小组委员会，动物营养学委员会，农业部，国家科学委员会。国家学术出版社，华盛顿特区，第2-6页(Nutrientrequirementsinswine,ninthrevisededition1988，subcommitteeonswinenutrition,committeeonanimalnutrition,boardofagriculture,nationalresearchcouncil.NationalAcademyPress:Washington,D.C.,pp.2_6),以及欧洲家禽饲料能量值表，Spelderholt家禽研究与拓展中心，7361DABeekbergen,荷兰。GrafischbedrijfPonsen&looijenbv,Wageningen.ISBN90-71463-12-5(EuropeanTableofEnergyValuesforPoultryFeed-stuffs,Spelderholtcentreforpoultryresearchandextension,7361DABeekbergen,TheNetherlands.GrafischbedrijfPonsen&looijenbv,Wageningen.ISBN90-71463-12-5)。在完整动物饮食中的钙，可用磷和氨基酸的饮食含量的计算是基于飼料表，例^口Veevoedertabel1997，gegevensoverchemischesamenstelling,verteerbaarheidenvoederwaardevanvoedermiddelen,CentralVeevoederbureau,Runderweg6,8219pkLelystad.ISBN90-72839-13-7。在一具体实施方式中，本发明的动物饲料组合物包含至少一种蛋白。所述蛋白可以是动物蛋白，例如肉和骨粉，和/或鱼粉；或其可以是植物蛋白。本文所用的术语植物蛋白是指任何化合物，组合物，制备物或混合物，其包括至少一种从植物衍生或起源的蛋白，包括经修饰的蛋白和蛋白衍生物。在具体实施方式中，植物蛋白的蛋白含量是至少10，20，30,40,50或60%(w/w)植物蛋白可以源自植物蛋白源，例如豆类和谷类，例如来自豆科(Fabaceae)(豆科(Leguminosae))，十字花科(Cruciferaceae)，藜科(Chenopodiaceae)和禾本科(Poaceae)的植物的材料，例如大豆粉，羽扇豆粉(lupinmeal)和油菜籽粉(rapeseedmeal)。在一具体实施方式中，植物蛋白源是来自豆科的一种或几种植物的材料，例如大豆，羽扇豆，豌豆或菜豆。在另一具体实施方式中，植物蛋白源是来自藜科的一种或几种植物的材料，例如甜菜，糖甜菜，菠菜或昆诺阿藜(quinoa)。植物蛋白源的其他实例是油菜籽，向日葵子(sunflowerseed)，棉籽(cottonseed)和甘蓝(cabbage)。大豆是优选的植物蛋白源。植物蛋白源的其他实例是谷类例如大麦，小麦，黑麦，燕麦，玉米(玉米)，稻，黑小麦和高粱。在更进一步的具体实施方式中，本发明的动物饲料组合物包含0-80%玉米；和/或0-80%高粱；和/或0-70%小麦；和/或0-70%大麦；和/或0-30%燕麦；和/或0-40%大豆粉；和/或0-25%鱼粉；和/或0-25%肉粉或骨粉；和/或0-20%乳清。可以将动物饮食例如生产为糊状饲料(mashfeed)(非颗粒的(nonpelleted))或颗粒飼料(pelletedfeed)。通常地，将磨碎的饲料混合并根据对所讨论的物种的规范(specification)添加足量的必需维生素和矿物质。多肽可以作为固体或液体多肽制剂的形式添加。例如，固体多肽制剂通常在混合步骤之前或期间添加；液体多肽制剂通常在造粒步骤之后添加。多肽也可以#^在饲料添加剂或预混合料中。饮食中多肽的终浓度在每千克饮食0.01-200mg多肽蛋白范围内，例如每千克动物饮食5-30mg多肽蛋白的范围。本发明的肌醇六磷酸酶应当以有效的量应用，即以足够改进溶解和/或改进饲料营养价值的量。目前考虑多肽以一个或多个下列量(剂量范围)来施用0.01-200;0.01-100;0.5-100;1-50;5-100;10-100;0.05-50或0.10-10——所有的这些范围均为每千克饲料中的肌醇六磷酸酶多肽蛋白的毫克数(ppm)。对于测定每千克飼料的肌醇六磷酸酶多肽蛋白的毫克数，将肌醇六磷酸酶从飼料组合物中纯化出来，纯化的肌醇六磷酸酶的比活性应用相关测定法来测定。象这样的伺料组合物的肌醇六磷酸酶活性也应用相同的测定法来确定，并基于这两种测定，来计算每千克饲料中肌醇六磷酸酶蛋白的毫克剂量。相同的机理适用于测定饲料添加剂中的肌醇六磷酸酶多肽蛋白的毫克数。当然，如果可以获得用于制备伺料添加剂或饲料的肌醇六磷酸酶的样品，则从该样品中测定比活性(无需从饲料组合物或添加剂中纯化肌醇六磷酸酶)。具体实施例方式本发明还涉及下列具体实施例方式I.肌醇六磷酸酶，其与SEQIDNO:2具有至少74%同一性，并且其与SEQIDNO:2相比包含在选自以下的至少一个位置上的至少一个变化1,2,3，4，5,31,41，46，52,53，55，57，59,74，76，82，84，91，99,100,104，105,107,109，111，114,115，116,117，118，119,120，,121，122,123,124，136，137，141,154，161,162，164,167，171,176，177，179，180,181，182，183，184，185，186，196，199，200，202,203，218,223，239，240，241，247,273，276，281,282，283，284,285，286,289,294,299，308,314，316,324，331，339,351,355，362,379,385，406,409，410和411;优选在选自以下的至少一个位置1，2,3，4,5，31，46，52,53,55，57，59,76，82，99,100,107,109,111，114,115，116，117,118，119,120，121，122，123，124,137，141，161，162，164,167，179，180，181，182，183，184，185，186，196，199，200,202，218,223,241,273,276，285,286，299,314,331，339,362，379，385，406,410和411;条件是该肌醇六磷酸酶不是SEQIDNO:3，不是SEQIDNO:4，并且不是SEQIDNO:6。II.肌醇六磷酸酶，其与SEQIDNO:2具有至少74%同一性，并且其与SEQIDNO:2相比包含在选自以下的至少一个位置上的至少一个变化1，2,3,4,5，41，46,52，53，55，57,59，74,76，82,84，91,99，100，104，105，107，109，111,114,115，116，117,118,119，120,122，123,124，136,137,141,154,161，162，164,167,171,176，177，179,180，181，182，183,184，185，186，196，199,200，202，203，218，223，239，240,241，247，273，276，281，282，283，284，285，286，289，294,299，308,314，324，339,351，355，362，379,385，406，409，410和411;优选在选自以下的至少一个位置1,2，3，4，5,46，52,53，55,57,59，76,82,99，100,107，109，111，114，115，116，117，118,119,120,122，123，124，137,141，161，162，164,167,179,180,181，182，183，184，185，186,196,199，200，202，218，223，241,273，276，285，286，299,314，339，362，379，385,406,410和411。III.MJ享六磷酸酶，其与SEQIDNO:2具有至少74%同一性，并且其与SEQIDNO:2相比包含在选自以下的至少一个位置上的至少一个变化1,2，3，4，5，31，41，46,52,53,55,57，59,74,76，82,84，91,99，100，104,105,107,109，111，114，115，116，117,118，119，120，121，122，123，124，136,137,141,154，161，162，164，167，171，176，177,179，180,181,182,183，184，185，186,196，199,200,202,203，218，223，239,240，241,247，273，276，281，282，283,284,285，286,289，294，299,308，314，316,324,331,339,351,355,362,379，385,406，409，410和411;优选在选自以下的至少一个位置优选在选自以下的至少一个位置1,2，3，4，5，31，46,52,53，55,57,59,76，82，99，100,107，109，111，114,115,116,117，118，119，120，121，122,123，124，137，141，161，162,164,167，179,180，181,182，183，184，185,186,196，199，200，202，218,223,241,273，276,285，286，299,314,331，339，362,379,385,406,410和411;条件是该肌醇六磷酸酶不是SEQIDN0:3，不是SEQIDNO:4，不是SEQIDNO:6，并且不是SEQIDNO:9以及图1中所列的它的变体。IV.肌醇六磷酸酶，其与SEQIDNO:2具有至少74%同一性，并且其与SEQIDNO:2相比包含在选自以下的至少一个位置上的至少一个变化1，2，3，4,5，41,46，52,53，55，57,59，74,76，82,84，91，99，100,104，105，107,109，111，114，115，116，117,118，119,120，122,123124，136,137，141，154，161，162，164，167,171,176,177，179，180，181，182，183，184,185,186，196，199，200,202，203，218，223,239，240,241,247,273，276,281，282，283,284,285,286，289，294，299，308，314,324，339,351，355,362，379,385，406，409，410和411优选在选自以下的至少一个位置1，2，3，4,5，46，52，53，55，57,59，76,82,99，100，107,109，111,114，115，116，117，118'119，120,122，123,124,137，141，161，162,164，167,179,180，181,182，183，184，185，186,196，199,200,202，218,223,241，273，276,285，286，299，314，339，362，379，385，406，410和411;条件是该肌醇六磷酸酶不是SEQIDNO:9和图1中所列的它的变体。V.肌醇六磷酸酶，其与SEQIDNO:2具有至少74%同一性，并且其与47SEQIDN0:2相比包含在选自以下的至少一个位置上的至少一个变化4，5,41,46,59，82，84，91,99,105,107，109，111,115，116，117，119,122，123，124,136，137，141，161,162，164，167，171，176，179,180，186，196,199,200，218，223,239，240，241,247，273,276,281，282，283,284,289,294，299，308，314，324,339，351,355,379，385,406,409，410和411;优选在选自以下的至少一个位置4，5，46，59，82，99，107,109,111,115，116，117,119，122，123,124，137，141,161,162，164,167,179，180,186，196，199，200，218，223，241，273,276，299，314,339,379，385,406，410和411。VI.肌醇六磷酸酶，其与SEQIDNO:2具有至少74%同一性并且其包含至少一个下列变化1*,2*,3*，4P，5P，31C,T,41P，46C，D,E,52C,E,53V,Q，55D,I，57Y，59C，74A,76G,82E，84Y，91C，P，99C,100C，104A，105F,107D,E，G，109A，G,111P，114H,N，T,115Q，116A,E，P,T,Q,117D,E,K1181,L,M,T,119G，K,R，S，120K，S,T，Q，121A，D，M，P，T，V,122D,123P，S，124L，T,V，136P，137P，141C,154P，161P，162C,164D，E,167Q，171T，176C，177C，179G，I，K,N,Q，180A，E,GT,181D,QI，K，182H,K，S,Q,183A，L，P，S,V,Q,184*，185*,186*，196Q，199C，200K，R，202N,203T,218Q，223E，239Q，240P,241Q，247C,273L，Q,276K，R，281H，282P，283P,284P,285G,N,R，286K,Q，289P，294T，299L,308A,314QN,316D,324N，331K,339D,351Y，355P,362K，R,379K，R,385D,杨A,409D，E,410D,E和/或411R,K;和/或其中位置179，180，181,182，183，184,185和186的氨基酸被QADKP，GEDKP,NGISA，IAGKS,KEKHQ，KEKQQ,KEKKV或KTDKL所取代；优选至少一个下列变化1*,2*,3*，4P，5P，31C，46E,52C,E，53V,55D,57Y,59C，76G，82E，99C，IOOC，107D，E，G,109A，111P,114T,115Q，116AT,117D,118T,119K,R,S,120S，121D,P，T，122D，123P，124L,137P，141C，161P,162C，164E，167Q,179K,180E,T，181D，K，182H,K,Q，183L,V,Q，184*,185*，186*，196Q,199C,200K，202N，218Q，223E,241Q,273L，276K，R,285QR,286Q,299L，314G,N，331K，339D,362K，R，379K，R,385D,406A,410D，E和/或411R,K;和/或其中在位置179,180,181,182,183，184，185和186的氨基酸被KEKHQ，KEKQQ，KEKKV或KTDKL所取代；条件是该肌醇六磷酸酶不是SEQIDNO:3，不是SEQIDNO:4，并且不是SEQIDNO:6。VII.肌醇六磷酸酶，其与SEQIDNO:2具有至少74%同一性并且其包含至少一个下列变化1*,2*,3*，4P，5P,31C，T,41P,46C,D，E，52C,E，53V,Q，55I，D，57Y,59C,74A，76G,82E,84Y,91C,P,99C,100C,104A，105F，107D，E,G，109A，G，111P,114H,N，T，115Q,116A,E，P,T,Q117D,E，K，1181,M，L，T，119GK,R，S，120K，S，T，Q，121A,D,M，P,V，122D，123P,S，124L，T,V,136P，137P，141C,154P，161P，162C，164D,E,167Q，171T，176C,177C，179QI，K，N,Q,180A,E，GT,181D,GI，K，182H,K，S,Q，183A,L，P,S，V,Q,184*，185*，186*，196Q，199C，200K,R，202N，203T，218Q,223E,239Q，240P,241Q,247C，273L,Q，276K，R，281H,282P，283P,284P,285G,N,R，286K，Q,289P,294T，299L，308A，314QN，316D，324N,339D,351Y，355P,362K，R，379K,R，385D,406A，409D,E，410D,E和/或411K,R;和/或其中在位置179，180，181，182，183，184，185和186的氨基酸被QADKP,GEDKP，NGISA，IAGKS，KEKHQ，KEKQQ，KEKKV或KTDKL所取代；优选至少一个下列变化1*,2*，3*,4P,5P，31C,46E，52C,E,53V，55D，57Y,59C，76G，82E,99C，100C,107D,E,G,109A，111P，114T，115Q，116AT,117D，118T，119K，R，S，120S,121D，P，122D，123P,124L，137P，141C，161P，162C，164E，167Q，179K,180E，T,181D,K，182H，K，Q，183L，V，Q,184*，185*,186*,196Q，199C,200K202N,218Q,223E,241Q，273L,276K，R，285G，R,286Q,299L,314QN,339D，362K，R,379K，R,385D，406A，410D,E和/或411R，K;和/或其中在位置179，180，181，182,183，184，185和186的氨基酸被KEKHQ,KEKQQ,KEKKV或KTDKL所取代。IIX.肌醇六磷酸酶，其与SEQIDNO:2具有至少74%同一性并且其包含至少一个下列变化1*，2*,3*，4P，5P,31C,T，41P,46C，D，E,52C，E,53V，Q,55D,I，57Y，59C，74A，76G，82E,84Y，91C,P,99C，IOOC，104A,105F，107D，E，G，109A,G，111P,114H，N,T,115Q,116A，E,P,T,Q，49117D，E，K,1181，L，M,T,119G，K，R,S，120K，S,T,Q，121A，D,M,P,T，V,122D，123P,S，124L，T,V,136P，137P，141C，154P,161P,162C，164D，E,167Q，171T，176C,177C,179QI,K,N，Q,180A，E,G，T,181D,QI,K，182H，K，S,Q，183A，L,P，S,V,Q,184*，185*，186*,196Q，199C，200K,R，202N，203T，218Q，223E,239Q，240P，241Q，247C，273L,Q,276K，R，281H，282P,283P,284P,285G，N，R，286K,Q，289P，294T,299L,308A,314，，316D，324N，331K，339D，351Y,355P,362K，R，379K,R，385D,406A，409D，E，410D，E和/或411R,K;和/或其中在位置179,180，181,182,183,184，185和186的氨基酸被QADKP，GEDKP，NGISA,IAGKS，KEKHQ，KEKQQ,KEKKV或KTDKL所取代；优选至少一个下列变化1*，2*，3*,4P,5P,31C，46E，52C,E，53V,55D，57Y,59C,76G,82E，99C,IOOC，107D，E，G,109A，111P，114T,115Q,116AT，117D，118T,119K，R,S,120S，121D,P，122D,123P,124L,137P，141C，161P，162C,164E，167Q，179K,180E，T，181D，K,182H，K,Q,183L,V,Q,184*,185*，186*,196Q，199C，200K202N，218Q，223E，241Q,273L,276K，R，285QR，286Q,299L,314QN，339D，362K,R,379K,R,385D,406A,410D,E和/或411R,K;和/或其中在位置179,180，181,182，183，184，185和186的氨基酸被KEKHQ，KEKQQ，KEKKV或KTDKL所取代。条件是该肌醇六磷酸酶不是SEQIDN0:3,不是SEQIDNO:4，不是SEQIDNO:6，并且不是SEQIDNO:9以及图1所列的它的变体。IX.肌醇六磷酸酶，其与SEQIDNO:2具有至少74%同一性并且其包含至少一个下列变化1*,2*,3*，4P，5P，31C，T，41P,46C,D，E,52C,E，53V，Q,55I，D，57Y,59C,74A，76(3，82E，84Y，91C，P,99C，廳C,104A，105F,107D,E,G，109A，G，111P,114H，N,T,115Q,116A，E,P,T,Q117D,E，K,1181，M，L，T，119G，K，R，S，120K，S,T,Q，121A,D,M，P，V,122D，123P，S，124L，T,V，136P,137P,141C,154P,161P，162C，164D，E，167Q,171T,176C,177C，179G，I，K,N,Q,180A,E,(VT，181D，QI,K，182H，K,S,Q,183A,L,P,S,V,Q,184*，185*，186*，196Q，199C，200K,R，202N，203T,218Q,223E，239Q，240P,241Q,247C,273L，Q，276K，R，281H，282P，283P，284P,285GN,R，286K,Q,289P，294T，299L，308A,314G，N，316D,324N,339D,351Y,355P,362K,R，379K,R，385D,406A，409D，E,410D，E和/或411K,R;和/或其中在位置179，180，181，182，183,184，185和186的氨基酸被QADKP,GEDKP，NGISA，IAGKS，KEKHQ，KEKQQ，KEKKV或KTDKL所取代；优选至少一个下列变化1*,2*,3*，4P，5P，31C，46E，52C,E，53V，55D,57Y,59C，76G，82E，99C,IOOC，107D,E，G，109A，111P，114T,115Q,116AT,117D,118T，119K,R，S，120S,121D，P，122D，123P，124L，137P,141C,161P，162C，164E,167Q，179K,180E,T，181D,K，182H,K,Q，183L，V，Q，184*,185*,186*，196Q，199C,200K202N，218Q,223E,241Q，273L,276K，R，285QR,286Q，299L,314QN，339D，362K，R，379K，R，385D,406A，410D，E和/或411R，K;和/或其中在位置179，180，181,182，183，184，185和186的氨基酸被KEKHQ,KEKQQ，KEKKV或KTDKL所取代。条件是该肌醇六磷酸酶不是SEQIDN0:9和图1所列的它的变体。X.肌醇六磷酸酶，其与SEQIDNO:2具有至少74%同一性并且其包含至少一个下列变化1*,2*,3*，4P，5P，31C，T，41P,46C，D，E,52C,E，53Q，55D，57Y,59C，74A，82E，84Y,91C，P，99C,100C,104A,105F，107D,E,G,109A,G，111P,114H,T,115Q，116A,E,P，T，Q，117D,E,K,1181,M,L,T，119G,K,R,S,120K，S,T，Q，121A，D,M，V，122D，123P，S，124L，T，V，136P,137P,141C，154P，161P,162C，164D，E,167Q，171T,176C，177C,179GI,K,N,Q，180A，E,G,T，181D,G，K，182K，S,Q，183A，L,S,V,Q，184*，185*,186*,196Q，199C,200K,R，202N，203T,218Q，223E，239Q,240P,241Q，247C，273L，Q,276K，R,281H，282P,283P,284P,285G,N，R，286K，Q，289P，294T,299L，308A，314，，316D,324N,339D,351Y，355P，362K，R,379K，R,385D，406A，409D，E,410D,E和/或411K，R;和/或其中在位置179，180，181，182,183，184，185和186的氨基酸被QADKP,GEDKP,NGISA,IAGKS,KEKHQ，KEKQQ，KEKKV或KTDKL所取代；优选至少一个下列变化1*，2*，3*，4P，5P，31C，46E，52C,E,55D，57Y，59C，82E，99C，画C，107D,E，G，109A,111P，114T,115Q,116AT，117D，118T，119K,R,S，120S,121D,122D,123P，124L，137P,141C,161P，162C，164E，167Q，179K,180E，T，181D，K,182K,Q,183L,V,Q,184*,185*，186*,196Q，199C,200K202N,218Q,223E,241Q,273L,276K，R，285G，R,286Q，299L，314G,N，339D，362K,R，379K，R,385D，406A，410D,E和/或411R，K;和/或其中在位置179，180,181，182,183，184，185和186的氨基酸被KEKHQ,KEKQQ，KEKKV或KTDKL所取代。XI.肌醇六磷酸酶，其与SEQIDNO:2具有至少74%同一性并且其包含至少一个下列变化1H，K，R,60P，105E，106A,G,155F，157F,173P，175L，188P，205P，215M，231P,254Y，280P，330D和/或371P;优选1K;条件是该肌醇六磷酸酶不是SEQIDNO:3，不是SEQIDNO:4，不是SEQIDNO:6，并且不是SEQIDNO:9以及图1中列出的它的变体。XII.肌醇六磷酸酶，其与SEQIDNO:2具有至少74%同一性并且其包含至少一个下列变化1H,R,60P，105E,106A,G，157F，173P，175L，188P,205P，215M,231P，254Y,280P。XIII.肌醇六磷酸酶，其与SEQIDNO:2具有至少74%同一性并且其包含至少一个下列变化52C,141C，162C,31C，52C,99C,59C，100C,141C/199C，4P，5P，111P，137P,161P,52E,57Y，76G,107D，107G,109A,1*，1*/2*，1*/2*/3*,121T,273L，285G，286Q，299L，362K,331K/55D，107E，46E,82E，119R，119K，164E，223E，276R,276K，362R，379R，379K，385D，410D，410E，411R,411K,53V，121D，167Q,196Q，200K,202N,218Q,241Q,285N，314N,314G,406A,179K/180E/181K/182H/183Q/184*/185*/186*，179K/180E/181K/182Q/183Q/184*/185*/186*，179K/180E/18IK/182K/183V/184*/185*/186*,179K/180T/181D/182K/183L/184*/185*/186*，111P/241Q，1K，XIV.实施方式1-13中任一项的肌醇六磷酸酶，其是SEQIDNO:2的肌醇六》粦酸酶的变体。XV.实施方式1-13中任一项的肌醇六磷酸酶，其是SEQIDNO:3的肌醇六磷酸酶的变体。XVI.实施方式1-13中任一项的肌醇六磷酸酶，其是SEQIDN0:4的肌醇六磷酸酶的变体。XVII.实施方式1-13中任一项的肌醇六磷酸酶，其是SEQIDNO:6的肌醇六磷酸酶的变体。IIXX.实施方式1-13中任一项的肌醇六磷酸酶，其是SEQIDNO:9的肌醇六磷酸酶的变体。IXX.实施方式1-13中任一项的肌醇六磷酸酶，其是与SEQIDNO:9相关并在图1中列出的肌醇六磷酸酶变体中的任一种的变体。XX.实施方式1-19中任一项的肌醇六磷酸酶，其进而包含选自图1中每行列出的取代和取代组合中的取代或取代组合。XXI.实施方式1-20中任一项的肌醇六磷酸酶，其具有改进的热稳定性，改进的pH曲线，改进的比活性，修改的糖基化模式，改进的温度曲线，改进的在动物饲料中的性能，和/或其含有(incorporate)潜在的蛋白酶切割位点的改变。XXII.分离的核酸序列，其包含编码实施方式I-XXI中任一项的肌醇六磷酸酶的核S交序列。xxni.核酸构建体，其包含实施方式xxn的核酸序列，该核酸序列可操作地连接于指导在恰当表达宿主中产生肌醇六磷酸酶的一个或多个调控序列。XXIV.重组表达载体，其包含实施方式XXIII的核酸构建体。XXV.重组宿主细胞，其包含实施方式XXIII的核酸构建体和/或实施方式XXIV的表达载体。XXVI.制备实施方式I-XXI中任一项的肌醇六磷酸酶的方法，其包括(a)培养实施方式XXV的宿主细胞以产生包含肌醇六磷酸酶的上清液；和(b)回收fl醇六磷酸酶。XXVII.转基因植物，或植物部分，其能够表达实施方式I-XXI中任一项的l几醇六^粦酸酶。IIXXX.转基因的，非人动物，或它的产物，或组分(dement),其能够表达实施方式I-XXI中任一项的肌醇六磷酸酶。IXXX.组合物，其包含实施方式I-XXI中任一项的至少一种肌醇六磷酸酶,和(b)至少一种水溶性维生素；和/或(c)至少一种痕量矿物质。XXX.实施方式IXX的组合物，其进一步包含选自下组的酶中的至少一种酶淀粉酶，肌醇六磷酸酶，磷酸酶，木聚糖酶，半乳聚糖酶，a-半乳糖苦酶，蛋白酶，磷脂酶和/或(3-葡聚糖酶。XXXI.实施方式IXX-XXX中任一项的组合物，其是动物饲料添加剂。XXXII.动物飼料组合物，其具有50至800g/kg的粗蛋白含量并且包含实施方式I-XXI中任一项的肌醇六磷酸酶或实施方式IXXX-XXXI中任一项的纟且合物。XXXIII.用于改进动物飼料营养价值的方法，其中将实施方式I-XXI中任一项的肌醇六磷酸酶或实施方式IXXX-XXXI中任一项的组合物添加到饲料中。XXXIV.用于降低动物粪便中肌醇六磷酸盐水平的方法，其包括以有效量的实施方式XXXII的饲料喂养动物。XXXV.用于处理植物蛋白的方法，其包括向至少一种植物蛋白或蛋白源添加实施方式I-XXI中任一项的肌醇六磷酸酶或实施方式IXXX-XXXI中任一项的组合物的步骤。XXXVI.实施方式I-XXI中任一项的肌醇六磷酸酶或实施方式IXXX-XXXI中任一项的组合物在动物饲料中的用途；在动物饲料的制备中的用途；用于改进动物饲料的营养价值的用途；用于降低动物粪便中的肌醇六磷酸盐水平的用途；用于植物蛋白的处理的用途；或用于从肌醇六磷酸酶底物中释放磷的用途。a).肌醇六磷酸酶，其与SEQIDN0:2具有至少70%同一性并且其与SEQIDNO:2相比包含选自下列的至少一个变化1,2，3，4，5,31,41，46,52，53,55,57，59，74，76，82，84，91，99，100,104，105，107，109，111，114，115，116，117，118，119，120，121，122，123,124，136，137,141，154,161,162，164，167,171，176，177，179,180,181,182，183，184，185，186，196,199，200,202,203，218，223，239，240，241，247，273,276,281，282,283,284,285,286，289,294,299，308，314，316，324,331，339,351,355，362，379，385,406,54409，410和411;条件是该肌醇六磷酸酶不是SEQIDN0:3，不是SEQIDN0:4，并且不是SEQIDNO:6。al).肌醇六磷酸酶，其与SEQIDNO:2具有至少70%同一性并且其与SEQIDNO:2相比包含选自下列的至少一个变化1，2,3，4，5，31,41，46，52，53，55,57，59，74,76,82,84，91,99，100，104，105，107，109，111,114，115,116，117，118，119，120,121,122，123，124,136,137，141,154，161，162,164，167，171,176,177，179，180，181,182，183,184，185，186，196，199,200，202，203，218，223，239,240，241,247，273,276，281,282，283，284,285，286,289，294，299，308,314，316，324，331，339,351，355，362，379,385，406，409，410和411;条件是该变体不包含(i)31D/121T/316N/331E,并且不包括(ii)31D/121N/316K/331E,并且不包括(iii)31N/121N/316N/331K。a2).肌醇六磷酸酶，其与SEQIDNO:2具有至少70%同一性并且其与SEQIDNO:2相比包含选自下列的至少一个变化1,2，3，4,5,41,46，52，53，55，57，59，74,76,82，84，91，99，100,104，105，107,109,111，114，115，116，117，118,119，120,122，123，124,136，137，141，154,161,162,164,167,171，176，177，179，180，181,182，183,184,185,186，196，199，200，202,203，218,223，239，240，241,247，273，276，281,282,283，284，285,286，289，294，299,308，314，324,339，351，355，362，379,385，406,409,410和411。a3).实施方式a2)的肌醇六磷酸酶，其包含至少一个下列变化1*，2*，3*,4P，5P，31C,T，41P，46C,D,E,52C,E，53V,Q，55I,D，57Y，59C,74A，76G，82E,84Y，91C，P,99C,100C，104A，105F,107D,E,G,109A,G，111P，114H，N，T,115Q,116A，E,P，T,Q117D，E，K，1181，M,L,T，119G，K,R,S,120K,S,T,Q，121A,D，M，P，V，122D,123P，S，124L,T，V，136P，137P，141C,154P，161P，162C，164D，E,167Q，171T,176C，177C,179GJ，K,N，Q，180A，E,G，T，181D，G，I,K,182H,K，S,Q,183A，L，P,S，V，Q，184*,185*，186*,196Q，199C，200K，R,202N，203T,218Q，223E，239Q,240P,241Q，247C，273L,Q,276K，R，281H，282P,283P，284P,285G，N,R,286K,Q,289P,294T，299L，308A,314G，N,316D，324N,339D,351Y，355P，362K，R，379K,R,385D,406A,409D,E，410D,E和/或411K,R;和/或其中55在位置179,180,181,182,183，184，185和186的氨基酸被QADKP，GEDKP,NGISA，IAGKS,KEKHQ，KEKQQ，KEKKV或KTDKL所取代。a4).实施方式a2)-a3)中任一项的肌醇六磷酸酶,其包含至少一个下列变化(i)31C,46C，52C，59C,91C，99C,謂C,141C，162C,176C，177C,199C和/或247C;(ii)4P,5P，41P，91P，111P，136P,137P，154P，161P,240P,282P，283P,284P，289P和/或355P;(iii)52E，55D,I,57Y,76G，84Y,104A，105F,107D，G，109A,G,273L，Q，285G，R,286Q,294T，299L，351Y和/或362K;(iv)1*,1*/2*或1*/2*/3*;(v)其中K179，T180,T181，E182,K183,S184，T185和K186已经被QADKP,GEDKP,NGISA，IAGKS,KEKHQ，KEKQQ,KEKKV或KTDKL所取代；(vi)119K,R和/或411K,R;(vii)107E和/或164D,E;(viii)46D，E，82E，223E,276K，R，362K，R，379K，R，385D，409D，E和/或410D，E;(ix)53V，Q，121D，167Q,196Q,200K，R,202N，218Q，239Q，241Q,285N,314G,N，324N和/或406A;(x)114H，N,T115Q,116A,E,P,T,Q，117D，E，K，1181,L，M,T119QK，S，120K,S,T,Q,121A，M,P，V,122D，123P,S和/或124L，T，V(xi)31T，74A,171T，203T,281H,308A和/或316D;和/或(xii)339D。a5).实施方式a2)-a4)中任一项的肌醇六磷酸酶，其包含至少一个下列变化(i)141C/199C，91C/46C,52C/99C,31C/176C，31C/177C，59C/100C和/或162C/247C;(ii)41P,91P,136P，137P，154P，161P，355P，111P,240P，282P,283P,284P，289P，4P和/或5P;(iii)52E，551，57Y,104A/105F,107D,G,109A，G，76G,84Y，362K，273L，Q,285QR，286Q,294T,299L，331K/55D和/或351Y;(iv)1*，1*/2*或1*/2*/3*;(v)其中K179，T180,T181,E182，K183,S184，T185和K186已经被QADKP,GEDKP,NGISA，IAGKS，KEKHQ，KEKQQ,KEKKV或KTDKL取代；(vi)119R，K和/或411R,K;(vii)107E和/或164E,D;(viii)362R,K，276R,K，379R,K，409D,E，223E，385D,46D，E，410D，E和/或82E;(ix)218Q，324N,200R,K，121D,196Q，202N，406A,167Q,53V,Q,241Q,314N,G，239Q和/或285N;(x)114H/115Q/116P/117E/1181/119G/120K/121M/122D/123P/124V,114T/115Q/116A/117D/118T/119S/120S/121P/122D/123P/124L,(xi)31T，74A，171T,203T，281H,308A，和/或316D;和/或(xii)339D。b).实施方式a)或al)的肌醇六磷酸酶，其包含至少一个下列变化1*，2*,3*，4P,5P，31C,T，41P,46C,D，E，52C,E,53V，Q，55D，I，57Y，59C,74A,76G，82E，84Y，91C,P,99C，IOOC，104A,105F,107D,E，G,109A,G，111P，114H,N，T，115Q,116A，E，P，T，Q,117D,E,K1181,L，M,T119QK,R，S，120K，S,T,Q，121A,D,M,P,T,V，122D，123P,S，124L，T,V,136P，137P,141C,154P,161P，162C,164D，E，167Q,171T,176C,177C，179QI,K,N,Q,180A，E,G,T，181D,G,I,K,182H,K，S,Q，183A，L，P，S，V,Q,184*,185*，186*，196Q,199C，200K，R，202N，203T，218Q,223E，239Q,240P,241Q,247C,273L,Q,276K,R,281H,282P，283P,284P，285G,N,R，286K，Q，289P,294T,299L，308A，314，，316D，324N,331K,339D，351Y，355P，362K,R，379K，R,385D，406A，409D,E,410D，E和/或411R,K;和57/或其中在位置179，180,181，182，183,184,185和186的氨基酸被QADKP，GEDKP,NGISA，IAGKS，KEKHQ,KEKQQ，KEKKV或KTDKL所取代。c).上面实施方式中任一项的肌醇六磷酸酶，其包含至少一个下列变化(i)31C,46C,52C,59C，91C，99C,IOOC，141C,162C,176C，177C,199C和/或247C;(ii)4P,5P,41P，91P，111P,136P,137P，154P,161P,240P，282P,283P，284P,289P和/或355P;(iii)52E,55D，I,57Y，76G,84Y,104A,105F,107D,G，109A,G，121T，273L，Q,285QR，286Q，294T，299L，331K,351Y和/或362K;(iv)1*，1*/2*或1*/2*/3*;(v)其中K179，T180,T181，E182，K183，S184，T185和K186被QADKP,GEDKP,NGISA，IAGKS,KEKHQ，KEKQQ，KEKKV或KTDKL取代；(vi)119K，R和/或411K,R;(vii)107E和/或164D，E;(viii)46D，E,82E，223E，276K，R,362K，R，379K，R，385D，409D,E和/或410D,E;(ix)53V,Q，121D，167Q,196Q,200K,R，202N，218Q,239Q，241Q，285N，314G,N，324N和/或406A;(x)114H,N,T115Q，116A,E,P,T,Q，117D，E,K,簡,L,M,T119G,K,S,120K，S,T，Q，121A,M，P,T，V，122D,123P,S和/或124L,T，V;(xi)31T,74A，171T,203T，281H，308A和/或316D;和/或(xii)339D。cl).上述实施方式中任一项的肌醇六磷酸酶，其包含至少一个下列变化(i)31C,46C,52C，59C，91C,99C，100C,141C，162C，176C，177C，199C和/或247C，优选52C，99C,141C和/或199C;(ii)4P,5P，41P,91P,111P，136P，137P,154P,161P,240P，282P，283P，284P,289P和/或355P,优选4P，5P，111P;(iii)52E，55D,I，57Y，76G，84Y，104A，105F，107D,G,歸A，G,58121T,273L，Q，285G,R，286Q，294T,299L,331K,351Y和/或362K，优选57Y，76G,107G,273L，286Q和/或362K;(iv)1*，1*/2*或1*/2*/3*;(v)其中K179，T180,T181,E182,K183，S184，T185和K186被QADKP,GEDKP,NGISA,IAGKS，KEKHQ，KEKQQ，KEKKV或KTDKL，优选KEKKV取代；(vi)119K,R和/或411K,R，优选119K;(vii)107E和/或164D,E;(viii)46D，E,82E，223E，276K,R，362K,R，379K,R,385D,409D，E和/或410D,E优选46E,223E362K，R和/或379K，R;(ix)53V，Q，121D，167Q,196Q,200K，R，202N，218Q,239Q，241Q，285N，314GN，324N和/或406A，优选53V，121D,196Q，200K，202N，218Q,241Q,314N和/或406A;(x)114H，N,T115Q，116A，E，P,T,Q,117D,E，K,1181，L，M,T，119G，K,S，120K，S,T,Q,121A，M,P，T，V，122D，123P,S和/或124L,T，V优选114T115Q，116A，T,117D,118T119K，S,120S,121P，122D，123P和/或124L;(xi)31T，74A,171T，203T,281H,308A和/或316D;和/或(xii)339D。d).上面实施方式中任一项的肌醇六磷酸酶，其具有改进的特性。e).实施方式c)或cl)的肌醇六磷酸酶，其包含实施方式3的特性(i)，(ii)，(iii),(iv)，(v)，(vi),(vii)，(viii)，(x)，(xi)和/或(xii)的一个或多个变化中的至少一个，并具有改进的热稳定性。f).实施方式c)或cl)的肌醇六磷酸酶，其包含实施方式c)的特性(ix)和/或(x)的一个或多个变化中的至少一个，并具有改进的pH曲线。g).实施方式c)或cl)的肌醇六磷酸酶，其包含实施方式c)的特性(x)的一个或多个变化中的至少一个，并具有改进的比活性。h).实施方式c)或cl)的肌醇六磷酸酶，其包含实施方式c)的特性(xi)的一个或多个变化中的至少一个，并具有修改的糖基化模式。i).实施方式c)或cl)的肌醇六磷酸酶，其包含实施方式c)的特性(xii)的变化，其改变了潜在的蛋白酶切割位点。j).包括al)-a5)和cl)的实施方式a)-d)中任一项的肌醇六磷酸酶，其包含至少一个下列变化(i)141C/199C,91C/46C，52C/99C，31C/176C,31C/177C,59C/100C和/或162C/247C;(ii)41P,91P，136P，137P，154P，161P，355P，111P,240P,282P，283P,284P,289P，4P和/或5P;(iii)52E,551，57Y，104A/105F,107D,G，109A,G，76G，84Y，121T，362K，273L,Q,285QR，286Q,294T，299L，331K/55D和/或351Y;(iv)1*，1*/2*或1*/2*/3*;(v)其中K179,T180，T181,E182，K183,S184,T185和K186被QADKP，GEDKP,NGISA，IAGKS，KEKHQ,KEKQQ,KEKKV或KTDKL取代；(vi)119R,K和/或411R，K;(vii)107E和/或164E,D;(viii)362R，K,276R，K,379R，K，409D，E,223E，385D，46D,E，410D，E和/或82E;(ix)218Q，324N，200R,K,121D,196Q，202N，406A,167Q，53V,Q，241Q，314N,G,239Q和/或285N;114H/115Q/116Q/117D/1181/119K/120Q/121A/122D/123P/124L，(xi)31T，74A，171T，203T，281H，316D和/或308A;和/或(xii)339D。k).包括al)-a5)和cl)的实施方式a)-d)中任一项的肌醇六磷酸酶，包含至少一个下列变化(i)K141C/V199C，Q91C/W46C,G52C/A99C，N31C/E176C，N31C/T177C,G59C/F100C和/或S162C/S247C;(ii)D41P，Q91P，N136P,T137P，L154P,S161P,T355P，Q111P，K240P,G282P，T283P,T284P，G289P，N4P和/或G5P;(iii)G52E,V55I,E57Y，L104A/A105F，K107D,G，Q109A，G，T76G，A84Y,N121T，I362K,M273L，Q,E285QR，N286Q，V294T,1299L，E331K/V55D和/或F351Y;(iv)El*，EP/E2氺或El*/E2*/Q3*;(v)其中K179，T180，T181,E182，K183，S184,T185和K186被QADKP,GEDKP,NGISA，IAGKS，KEKHQ，KEKQQ，KEKKV或KTDKL所取代；(vi)E119R,K和/或E411R，K;(vii)K107E和/或R164E，D;(viii)1362R,K,T276R,K，1379R,K，V409D,E，Q223E，N385D,W46D，E，T410D,E和/或Q82E;(ix)E218Q,D324N，T200R,K,N121D,E196Q，D202N，E406A，E167Q,E53V，Q，E241Q,D314N，G,E239Q和/或E285N;(x)Y114H/K116E/D117K/E118廳119G/K120T/N121M/L124T，Y114H/K116Q/E118I/E119K/K120Q/N121V/P123S,Y114魔116P/D117E/E118I/E119G/N121M/L124V,Y114T/K116A/E118T/E119S/K120S/N121P，Y114H/K116Q/E118I/E119K/K120Q/N121A,Y114T/K116T/E118T/E119S/K120S/N121P或Yl14N/K116A/E118L/E119K/N121T;(xi)N31T,N74A,N171T,N203T,N281H,N316D和/或N308A;和/或(xii)R339D。1).实施方式k)的肌醇六磷酸酶，其是SEQIDNO:2的变体。m).包括al)-a5)和c)的实施方式a)-d)中任一项的肌醇六磷酸酶，其包含至少一个下列变化Ci)T141C/V199C，Q91C/W46C，G52C/A99C,D31C/E176C,D31C/T177C,G59C/F100C和/或S162C/S247C;(ii)D41P,Q91P,N136P，T137P,L154P，S161P，T355P,Q111P，K240P，G282P，T283P，T284P,G289P，N4P和/或G5P;(iii)G52E，V55I,E57Y,L104A/A105F,K107D，G，Q109A,G,T76G,A84Y,I362K,M273L,Q，E285G,R，丽6Q，V294T,I299L,E331K/V55D和/或F351Y;(iv)E1*,EP/E2承或El*/E2*/Q3*;(v)其中K179，T180,T181,E182，K183，S184,T185和K186被QADKP，GEDKP，NGISA，IAGKS，KEKHQ，KEKQQ，KEKKV或KTDKL;(vi)El19R,K和/或E411R，K;(vii)K107E，R164E，D;(viii)1362R，K,T276R，K,1379R,K，V409D，E,Q223E,N385D，W46D,E，T410D，E,Q82E;(ix)E218Q，D324N，T200R,K，T121D,E196Q，D202N，E406A，E167Q，E53V,Q，E241Q,D314N,G,E239Q和/或E285N;Cx)Y114H/K116E/D117K/E118廳119G/K120T/T121M/L124TY114H/K116Q/E118I/E119K/K120Q/T121V/P123SYl14H/K116P/D117E/E118I/E119G/T121M/L124VYl14T/K116A/E118T/E119S/K120S/T121P/Y114H/K116Q/E118I/E119K/K120Q/T121A/(xi)N74A，N171T，N203T,N281H,N316D和/或N308A;和/或(xii)R339D。n).实施方式m)的肌醇六磷酸酶，其是SEQIDN0:4的变体。o).包括al)-a5)和cl)的实施方式a)-d)中任一项的肌醇六磷酸酶，其包含至少一个下列变化(i)K141C/V199C,Q91C/W46C,G52C/A99C，D31C/E176C，D31C/T177C，G59C/F100C和/或S162C/S247C;(ii)D41P，Q91P,N136P，T137P，L154P，S161P，T355P，Q111P,K240P，G282P，T283P，T284P，G289P，N4P和/或G5P;(iii)G52E，V55I，E57Y，L104A/A105F,K107D，G，Q109A,G，T76G,A84Y,N121T，I362K,M273L,Q,E285QR,N286Q，V294T，I299L,E331K/V55D和/或F351Y;(iv)E1*,E1"E2承或El*/E2*/Q3*;(v)其中K179，T180,T181,E182,K183，S184,T185和K186被QADKP,GEDKP,NGISA，IAGKS,KEKHQ，KEKQQ，KEKKV或KTDKL所取代；(vi)El19R，K和/或E411R,K;(vii)K107E和/或R164E,D;(viii)1362R,K,T276R，K，1379R，K，V409D，E,Q223E，N385D,W46D，E,T410D，E和/或Q82E;(ix)E218Q，D324N,T200R，K，N121D，E196Q，D202N，E406A,E167Q,E53V,Q,E241Q，D314N，G,E239Q和/或E285N;(x)Y114H/K116E/D117K/E118M/E119G/K120T/N121M/L124T，Y114H/K116Q/E118I/E119K/K120Q/N121V/P123S，Y114H/K116P/D117E/E118I/E119G鹿21M/L124V,Y114T/K116A/E118T/E119S/K120S/N121P,Y114H/K116Q/E118I/E119K/K120Q/N121A，Y114T/K116T/E118T/E119S/K120S/N121P或Y114N/K116A/E118L/E119K/N121T;(xi)N74A,N171T，N203T,N281H和/或N308A;和/或(xii)R339D。p).实施方式o)的肌醇六磷酸酶，其是SEQIDN0:3的变体。q).包括al)-a5)和cl)的实施方式a)-d)中任一项的肌醇六磷酸酶，其包含至少一个下列变化(i)K141C/V199C，Q91C/W46C,G52C/A99C，N31C/E176C，N31C/T177C,G59C/F100C和/或S162C/S247C;(ii)D41P，Q91P,N136P，T137P，L154P，S161P，T355P，Q111P，K240P，G282P，T283P,T284P，G289P，N4P和/或G5P;(iii)G52E,V55I,E57Y,L104A/A105F，K107D，G，Q109A,G,T76G，A84Y，N121T,I362K,M273L,Q，E285G,R,N286Q，V294T，I299L,V55D和/或F351Y;(iv)El*，E"/E2承或El*/E2*/Q3*;(v)其中K179，T180，T181,E182，K183,S184,T185和K186被QADKP，GEDKP，NGISA，IAGKS，KEKHQ，KEKQQ，KEKKV或KTDKL63所取代；(vi)E119R,K和/或E411R，K;(vii)K107E和/或R164E，D;(viii)1362R,K，T276R，K，1379R,K，V409D，E，Q223E,N385D，W46D，E，T410D,E和/或Q82E;(ix)E218Q，D324N，T200R，K,N121D，E196Q,D202N,E406A，E167Q,E53V，Q,E241Q,D314N,G,E239Q和/或E285N;(x)Y114H/K116E/D117K/E118M/E119G/K120窗121M/L124T,Y114H/K116Q/E118I/E119K/K120Q/N121V/P123S，Y114H/K116P/D117E/E118I/E119G/N121M/L124V，Y114T/K116A/E118T/E119S/K120S/N121P，Y114跳116Q/E118I/E119K/K120Q/N121A,Y114T/K116T/E118T/E119S/K120S/N121P或Yl14N/K116A/E118L/E119K/N121T;(xi)N31T，N74A，N171T，N203T，N281H，N316D和/或N308A;和/或(xii)R339D。r).实施方式q)的肌醇六磷酸酶，其是SEQIDNO:6的变体。s).包括al)-a5)和cl)的实施方式a)-d)中任一项的肌醇六磷酸酶，其包含至少一个下列变化(i)K141C/V199C,Q91C/W46C，G52C/A99C，D31C/E176C,D31C/T177C,G59C/F100C和/或S162C/S247C;(ii)D41P,Q91P,图6P，T137P,L154P，S161P，T355P,Q111P，K240P，G282P，T283P,T284P,G289P，N4P和/或G5P;(iii)G52E,V55I，E57Y，L104A/A105F,K107D,G，Q109A,G，T76G，A84Y,I362K,M273L，Q，E285G,R，N286Q，V294T,I299L,E331K/V55D和/或F351Y;(iv)El*，E1"E2氺或El*/E2*/P3*;(v)其中K179,T180,T181，E182，K183,S184,T185和K186被QADKP,GEDKP,NGISA，IAGKS,KEKHQ,KEKQQ，KEKKV或KTDKL所取代；(vi)E119R，K和/或E411R，K;(vii)K107E和/或R164E,D;(viii)1362R，K，T276R,K,1379R，K,V409D，E，Q223E，N385D,W46D,E,T410D,E和/或Q82E;(ix)E218Q，D324N，T200R，K，T121D,E196Q，D202N,E406A，E167Q,E53V，Q,E241Q,D314N，G，E239Q和/或E285N;(x)Y114H/K116E/D117K/E118M/E119G/K120T/T121M/L124T，Y114H/K116Q/E118I/E119K/K120Q/T121窗23S，Y114H/K116P/D117E/E1181/E119G/T121M/L124V，Yl14T/K116A/E118T/E119S/K120S/T121P，Y114H/K116Q/E118I/E119K/K120Q/T121A,Y114T/K116T/E118T/E119S/K120S/T121P或Yl14N/K116A/E118L/E119K;(xi)D31T，N74A，N171T，N203T，N281H,N316D和/或N308A;和/或(xii)R339D。t).实施方式s)的肌醇六磷酸酶，其是SEQIDNO:9的变体。u).分离的核酸序列，其包含编码实施方式a)-t)包括al)-a5)和cl)中任一项的肌醇六磷酸酶的核酸序列。v).核酸构建体，其包含实施方式u)的核酸序列，该核酸序列可操作地连接于指导在合适的表达宿主中产生肌醇六磷酸酶的一个或多个调控序列。w).重组表达载体，其包含实施方式v)的核酸构建体。v).X).重组宿主细胞，其包含实施方式v)的核酸构建体和/或实施方式w)的表达载体。y).用于产生实施方式a)-t)包括al)-a5)和cl)中任一项的肌醇六磷酸酶的方法，其包括(a)培养实施方式x)的宿主细胞以产生包含肌醇六磷酸酶的上清液；和(b)回收肌醇六磷酸酶。z).转基因植物，或植物部分，其能够表达实施方式a)-t)包括al)-a5)和C1)中任一项的肌醇六磷酸酶。ae).转基因的，非人动物，或它的产物，或组分，其能够表达实施方式a)-t)包括al)-a5)和cl)中任一项的肌醇六磷酸酶。oe).组合物，其包含实施方式a)-t)包括al)-a5)和cl)中任一项的至少一种肌醇六磷酸酶，和(a)至少一种脂溶性维生素；(b)至少一种水溶性维生素；和/或(c)至少一种痕量矿物质。aa).实施方式oe)的组合物，其进一步包含选自下组的酶中的至少一种酶淀粉酶，肌醇六磷酸酶，磷酸酶，木聚糖酶，半乳聚糖酶，a-半乳糖普酶，蛋白酶，磷脂酶，和/或P-葡聚糖酶。bb).实施方式oe)-aa)中任一项的组合物，其是动物伺料添加剂。cc).动物詞料组合物，其具有50至800g/kg的粗蛋白含量并且包含实施方式a)-t)包括al)-a5)和cl)中任一项的肌醇六磷酸酶或实施方式oe)-aa)中4壬一项的纟且合物。dd).用于改进动物詞料营养价值的方法，其中将实施方式a)-t)包括al)-a5)和cl)中任一项的肌醇六磷酸酶或实施方式oe)-aa)中任一项的组合物添加至饲料中。ee).用于降低动物粪便中肌醇六磷酸盐水平的方法，其包括用有效量的实施方式cc)的饲料喂养动物。ff).用于处理植物蛋白的方法，其包括将实施方式a)-t)包括al)-a5)和c1)中任一项的肌醇六磷酸酶或实施方式oe)-aa)中任一项的组合物添加到至少一种植物蛋白或蛋白源中的步骤。gg).实施方式a)-t)包括al)-a5)和cl)中任一项的肌醇六磷酸酶或实施方式oe)-aa)中任一项的组合物在动物詞料中的用途；在制备动物飼料中的用途；用于改进动物祠料的营养价值的用途；用于降低动物粪^f更中的肌醇六磷酸盐水平的用途；用于处理植物蛋白的用途；或用于/人肌醇六磷酸酶底物中释放磷的用途。本文描迷和要求保护的发明的范围不限制于本文所公开的具体实施方式，因为这些实施方式意在作为本发明的几个方面的说明。任何等同的实施方式应该在本发明的范围内。确实，除本文所展示和描述之外的对本发明的各种修饰对本领域技术人员而言将是显而易见的。这些修饰也应该在所附权利要求的范围之内。在有沖突的情况下，以包括定义在内的本公开为准。本文引用的各种参考文件，将其公开内容通过引用并入本文。实施例所用的化学剂至少是试剂级商品。实施例l:变体的制备，和温度稳定性和pH曲线的检测肌醇六磷酸酶变体的制备编码具有SEQIDNO:2的氨基酸序列的肌醇六磷酸酶变体的DNA通过本领域已知的方法产生，并且用标准技术将构建体通过PCR融合于由Takami等在Biosci.Biotechnol.Biochem.56:1455(1992)中所描述的编码信号肽的DNA并通过同源重组整合进枯草芽胞杆菌宿主细胞的基因组中(参见Diderichsen等(19卯)，J.Bacteriol.，172，4315-4321)。基因在三启动子系统(如WO99/43835所述)的控制下表达并用常规方法纯化得到的肌醇六磷酸酶蛋白。温度稳定性的测定肌醇六磷酸酶变体的温度稳定性可以通过下列方式测定变体和参考蛋白的500微升蛋白溶液(SEQIDNO:2，SEQIDNO:3，SEQIDNO:4和/或SEQIDNO:6)具有约10微克蛋白每毫升并且溶解在0.1M乙酸钠緩冲液，pH5.5中，将该蛋白溶液分成两部分，一部分在期望的升高的温度(例如50。C，55。C,60。C,65。C,70。C,75。C,80。C或85。C)在塑料容器内温育，另一部分保存于5。C。在升高的温度下温育30分钟之后将蛋白溶液转移到水浴，并且通过下述磷酸酶测定法来测量(扣除緩冲液空白(bufferWindsubtracted))冷却的样品和加热的样品的活性。将残余活性定义为热处理后的活性除以冷却的样品的活性(以％形式)。如果在磷酸酶或肌醇六磷酸酶测定法中的残余活性与参考相比更高，则认为变体对温度更加稳定(热稳定)。磷酸酶活性的测定将75樣i升含肌醇六磷酸酶的酶溶液分配到微量滴定板孔(microtiterplatewell)例如NUNC269620中，并且添加75樣i升底物(对于制备底物，将两个5mg对硝基苯基磷酸片剂(Sigma，目录号N-9389)溶于10ml0.1M乙酸钠緩沖液，pH5.5)。将平板密封然后温育15分钟，在37。C以750rpm摇动培养。在67温育期之后添加75微升终止试剂(终止试剂是水中的0.1M四硼酸二钠)并且在微量滴定板分光光度计上测定在405nm的吸光度。将一个磷酸酶单位定义为在给定反应条件下每分钟释放l微摩尔磷酸根的酶活性(扣除緩沖液空白)。在测试条件下测定l微摩尔对硝基酚的吸光度为56AU(AU-吸收单位)。DSC测量差异扫描量热法(DSC)可以在各种pH-值下用MicroCal的VP-DSC来进行。扫描在恒定的扫描率1.5。C/min下进行，范围20-90。C。在开始DSC之前，将肌醇六磷酸酶用在适宜緩冲液(例如0.1M甘氨酸-HC1，pH2.5或3.0;20mM乙酸钠pH4.0;O.IM乙酸钠，pH5.5;0.1MTris-HCl，pH7.0)中平衡的NAP-5柱(Pharmacia)脱盐。数据处理是使用MicroCalOrigin软件(MicroCalOriginsoftware)(版本4.10)进行，并且将变性温度Td(也称为解链温度，Tm)定义为热解曲线(thermogram)中峰的顶端温度。修正的pH曲线pH3.5/5.5活性比率的测定肌醇六磷酸酶变体的pH曲线的修正可以如下确定在pH3.5时(0.1M乙酸盐緩冲液，pH3.5)和pH5.5时(0.1M乙酸盐緩冲液，pH5.5)测量活性，两种情况下均扣除緩冲液空白。用在pH3.5时测定的活性除以pH5,5时测定的活性，即将两个吸收值相除(见下面)。为测量活性，将变体和参考的上清液在各自緩冲液中适当稀释(例如1:5000)。将75微升各自的酶溶液分配到微量滴定板孔例如NUNC269620中，并且添加75微升具有相应pH的底物(通过分别在10ml0.1M乙酸钠緩冲液，pH5.5以及10ml0.1M乙酸盐緩冲液，pH3.5中溶解两个5mg对硝基苯基磷酸片剂(Sigma,目录号N-93S9)来制备底物)。将平板密封并温育15分钟，在37。C以750rpm摇动培养。在温育期之后添加75微升终止试剂(水中的O.lM四硼酸二钠水溶液)，并且在微量滴定板分光光度计中在405nm测量吸光度。肌醇六磷酸酶活性的测定将适当稀释(例如在0.25M乙酸钠，0.005%(w/v)Tween-20.pH5.5中)的75微升含肌醇六磷酸酶的酶溶液分配到微来那个滴定才反孔例如NUNC269620中，并且添加75樣i升底物(通过在10ml0.25M乙酸钠緩冲液，pH5.5中溶解100mg来自稻的肌醇六磷酸钠(Aldrich目录号274321)来制备)。将平板密封并温育15分钟，在37。C以750rpm摇动培养。温育期之后添加75微升终止试剂(终止试剂通过混合IO1111钼酸盐溶液(10%(\￥)七-钼酸铵于0.25%(w/v)氨溶液中)；10ml钒酸铵(0.24。/oBie&Bemtsen的商业产品，目录号LAB17650)和21.7%(w/v)硝酸来制备)，在微量滴定板分光光度计上测量405nm的吸光度。肌醇六磷酸酶活性以FYT单位来表示，一个FYT是在上述条件下每分钟释放1微摩尔无机正磷酸根的酶量。通过参考从无机磷酸盐的适当稀释液制备的标准曲线或参考从已知活性的肌醇六磷酸酶制备物(这样的具有已知活性的标准酶制备物可从NovozymesA/S,Krogshoejvej36，DK-2880Bagsvaerd索取获得)的稀释液制作的标准曲线来获得测量的肌醇六磷酸酶活性的绝对值。实施例2:表达宿主/糖基化对热稳定性的影响芽孢杆菌属中的表达将SEQIDN0:2的肌醇六磷酸酶如实施例1所述在枯草芽孢杆菌中表达，并用常规方法纯化离心，微生物过滤(germfiltration),硫酸铵沉淀(80%硫酸铵饱和溶液)，离心，在緩冲液A(50mM乙酸钠，1.5M硫酸铵pH4.5)中重悬沉淀，过滤，疏水相互作用层析(hydrophobicinteractionchromatography)(PhenylToyopearl,用緩冲液A上样，用緩冲液B(50mM乙酸钠pH4.5)洗脱)和阳离子交换层析(SP-琼脂糖，用10mM杼檬酸钠pH4.0上样，用线性盐梯度(10mM柠檬酸钠pH4.0+1MNaCl洗脱))。在毕赤酵母属中的表达更进一步，将SEQIDNO:2的肌醇六磷酸酶在巴斯德毕赤酵母中表达，j!口由Rodriguez等在ArchivesofBiochemistryandBiophysics,vol.382，no.1，2000,pp.105-112中概括描述的。从发酵培养液的上清中如下述纯化肌醇六磷酸酶用硫酸铵(80%饱和溶液)沉淀，在10ml25mM乙酸钠緩沖液pH4.5中再溶解，相对于相同緩沖液透析，并通过0.45mm滤器过滤。将150ml的这种溶液加至用相同緩冲液pH4.5平4軒的40mlSPSepharoseFF柱(Pharmacia),将蛋白用线性NaCl梯度(0-0.5M)洗脱。分析来自柱的级分的肌醇六磷酸酶活性。通过SDS-PAGE检测具有肌醇六磷酸酶活性的级分，并汇集(pool)纯的级分。通过^f吏用BCA试剂盒(Pierce)测量蛋白浓度。通过DSC测定的热稳定性对毕赤酵母属和芽孢杆菌属表达的SEQIDNO:2的肌醇六磷酸酶进行通过差异扫描量热法(DSC)的热稳定性的测量。样品制备将样品(体积小于3ml)在冷室中(约5摄氏度)相对于500ml的20mM乙酸钠緩冲液pH4.0透析最少l小时。将样品转移至500ml新鲜的、冷的緩冲液制剂并透析过夜。将样品用0.45微米注射器滤器过滤，用透析緩冲液将体积调节至约1.5ml，并记录A28o(在280nm处的吸光度)。在DSC扫描中使用透析緩沖液作为参考。用真空抽吸并搅拌约1O分钟为样品排气。在毕赤酵母属表达的肌醇六磷酸酶的样品制备期间(相对于20mM乙酸钠(NaAc)pH4.0透析)形成了沉淀。将上清液用于第一个实验。然后将纯化的储液的剩余部分相对于20mMNaAcpH4.0透析，这才羊使得在该批次中存在的一些低Mw杂质沉淀下来。将这个批次用于第二个实验，该实验揭示了与第一个实验非常相似的Tm(54对55。C)。DSC实验应用MicroCaFMVP-DSC设备的实验设置扫描速率90K/h。扫描间隔20-90摄氏度。反馈模式无。过滤期(filteringperiod):16秒。样品的酶浓度约为1-1.5mg/ml，如通过A28o和在280nm的理论计算消光系数(VectorNTI版本9.0.0)来估计的。热解叠温度(Td;thermalunfoldingtemperature)用MicroCalOrigin软件(版本4.10)评估，并将变性温度确定为热解曲线的顶点温度。结果在下面的表2中总结。表2宿主细胞緩沖液扫描率(。C/h)扫描间隔(°C)Td(。C)A280枯草芽孢杆菌20mMNaAcpH4.09020-90621,6巴斯德毕赤酵母20mMNaAcpH4.09020-90551.9表2清楚地显示毕赤酵母属表达的肌醇六磷酸酶比芽孢杆菌属表达的肌醇六磷酸酶的热稳定性差得多。毕赤酵母属表达的肌醇六磷酸酶具有重度糖基化，如使用质谱法(Maldi-TOF)通过宽泛的分子量范围所见的，而芽孢杆菌属表达的肌醇六磷酸酶则没有糖基化。实施例3:肌醇六磷酸酶变体R339D70制备具有取代R339D的SEQIDNO:2的肌醇六磷酸酶蛋白质工程化变体，并在米曲霉中用本领域已知的方法表达。使用如实施例2所述的DSC测定它的变性温度Td为62.5°C(20mM乙酸钠，pH4.0)。此外，R339D取代用于去除与在曲霉属中表达潜在相关的Kex2蛋白酶切割位点。实施例4:包含肌醇六磷酸酶变体的动物铜料和动物饲料添加剂动物铜津+添加剂将包含0.15g肌醇六磷酸酶酶蛋白的SEQIDNO:2的肌醇六磷酸酶变体R339D的配制物添加至下列预混物(每千克预混物)5000000正维生素A1000000IE维生素D313333mg维生素E1000mg维生素K3750mg维生素Bl2500mg维生素B21500mg维生素B67666meg维生素B1212333mg烟酸33333meg生物素300mg叶酸3000mgD-泛酸钓1666mgCu16666mgFe16666mgZn23333mgMn133mgCo66mgI66mgSe5.8%钙25%钠71动物饲料此为动物饲料(小鸡饲料(broilerfeed))的实例，该饲料包含1.5mg/kg(1.5ppm)SEQIDNO:2的肌醇六磷酸酶变体R339D(以肌醇六磷酸酶酶蛋白来计算)62.55%玉米33.8%大豆粉(50。/4且蛋白,CP)1.0%大豆油0.2。/。DL-曱硫氨酸0.22。/。DCP(磷酸二4丐)0.76%CaCO3(碳酸4丐)0.32%沙0.15%NaCl(氯化钠)1%上述预混物将各成分混合，并将饲料在期望的温度(例如60，65，75,80，85,90或甚至95。C)制成颗粒。实施例5:温度稳定性的测定如实施例1的变化在下面表3中显示)。具有SEQIDNO:2和SEQIDNO:3的两个参考肌醇六磷酸酶以相同方式制备。温度稳定性如下测定将变体和参考蛋白各自的200微升上清液分成两部分，一部分在50°C在塑料容器中温育，另一部分保存在5。C。在50。C温育30分钟后将蛋白溶液转移到水浴。以1:100在0.1M乙酸钠緩沖液，pH5.5中稀释后，通过实施例1("磷酸酶活性的测定")中的磷酸酶测定法来测量冷却的和加热的样品的活性，扣除緩冲液空白。结果在下面表3中显示为分别在5。C和50。C温育30分钟后的酶活性(以吸收单位(AU)表示)，而残余活性(RA)计算为以热处理样品(50。C温育)的活性除以冷却样品(5。C温育)的活性，以°/。表示。表3:具有改进的热稳定性的肌醇六磷酸酶变体肌醇六磷酸酶50C(AU)50。C(AU)RA(%)SEQIDN0:20.2100.07033SEQIDNO:31.0520.0273SEQIDNO:2的N4P0.5130.31361SEQIDNO:2的G5P0.5760.28750SEQIDNO:2的Q111P1.0530.57755SEQIDNO:2的E1*0.9090.40144SEQIDNO:2的El*/E2*0.3220.15950SEQIDNO:2的El*/E2*/Q3*0.1010.05151SEQIDNO:2的M273L1.5990.89756SEQIDNO:2的N286Q0.0620.02439实施例6:在体外模型中的在动物飼料中的性能将肌醇六磷酸酶变体在动物饲料中的性能在体外模型中与参考蛋白的性能进行比较，所述参考蛋白如SEQIDNO:2，SEQIDNO:3，SEQIDNO:4和/或SEQIDNO:6。体外模型模拟单胃动物的胃肠条件并与体内动物试验所获得的结果充分关联。比较按如下进行变体样品中的肌醇六磷酸酶活性如实施例l"肌醇六磷酸酶活性的测定"中所述来测定。然后制备由30%大豆粉和70%玉米粉所组成的饲料样品，添加CaCl2至浓度为每千克饲料5g钙，并在40。C和pH3.0预温育30分钟，接下来添加胃蛋白酶(3000U/g飼料)和适当剂量的肌醇六磷酸酶(对于所有要检测的肌醇六磷酸酶应用同一剂量以便比较)，例如0.25至0.75肌醇六磷酸酶单位FYT/g饲料。还包括无肌醇六磷酸酶活性的空白作为参考。其后将样品在40。C和pH3.0温育60分钟，然后在pH4.0温育30分钟。通过添加HC1至终浓度0.5M并在40。C温育2小时，接着进行一个冻融循环和40。C温育1小时，由此将反应终止并提取月几醇六磷酸和磷酸肌醇。通过高效离子层析如Chen等在JournalofChromatographyA(2003)vol.1018,pp.41-52中所述将肌醇六磷酸和磷酸肌醇分离，并如Skoglund等在J.Agric.FoodChem.(1997),vol.45,pp.431-436中所述进行定量。然后将释放的磷计算为肌醇六磷酸酶处理的和未处理的样品之间磷酸肌醇结合的磷(IP-P)的差异。将变体的相对性能计算为相对于对照肌醇六磷73酸酶释放的磷的百分比。如上所述以125FYT/kg饲料的剂量测定SEQIDNO:2的多个肌醇六磷酸酶变体的体外性能。上清液和纯化的肌醇六磷酸酶的结果分别在下面表4A和4B中显示。残余的IP6-P指在体外温育之后剩余的IP6-P(肌醇六磷酸磷)的量，以mg/gDM(干物质)表示。将降解的IP6-P测定为空白的残余IP6-P和各个样品的残余IP6-P之间的差异。最后，在最后一列，相对于具有SEQIDNO:2的肌醇六磷酸酶表示降解的IP6-P。在表4A中空白和参考(SEQIDNO:2)值是多个独立测定的均值，而其他值基于单次测定。在表4B中空白值是多个独立测定的均值，而其他值基于单次测定。表4A.肌醇六磷酸酶变体上清液的体外性能变体号/(相较于残余的降解的降解的SEQIDNO:2的修改)IP6-PIP6-PIP6-Pmg/gDMmg/gDM(%)空白2.462026(SEQIDNO:3)0.1062.35699000(SEQIDNO:2)0.0712.391100008(G52C/A99C)0.3872.07587009(G59C/F100C)0.2722.19092010(K141C/V199C)0.2072.25594015(N4P)0.0642.387100016(G5P)0.0992,35198018(Q111P)0.1002.35098020(T137P)0.3702.09287021(L154P)0.3822細87022(S161P)0.2352.22793023CK240P)0.5811.88179024(T355P)0.7441.71872028(G52E)0.7161.74673030(E57Y)0.6661.79675032(A84Y)0.6671.79575034(L104A)0.7091.75373035(A105E)0.553l細80036(K107D)0.7671.69571037(K107G)0.4502.01284<table>tableseeoriginaldocumentpage75</column></row><table>变体015，016，018,040,041，042,044和050看上去具有与SEQIDNO:2和3的肌醇六磷酸酶相比至少是一样好的或更好的体外性能。表4B:纯化的肌醇六磷酸酶变体的体外性能<table>tableseeoriginaldocumentpage75</column></row><table>0.5861.826114091(E218Q)1.2641.14872095(D314N)0馬1.716107098(E406A)0.5151.897119125(Yl14T/Q115Q/K116A/D117D/E118T/E119S/-K120S/N121P/D122D/P123P/L124L)0.7531.658104127(Yl14T/Q115Q/K116T/D117D/E118T/E119S/-K120S/N121P/D122D/P123P/L124L)0.8611.55097变体030,031,037，056，072，085,087,089,090,095，098和125在体外的表现看起来至少与SEQIDNO:3的月几醇六磷酸酶一样好。实施例7:比活性基于相对于250mM乙酸钠，pH5.5透析的高度纯化的样品来测定肌醇六磷酸酶变体的比活性。预先在SDS聚丙烯酰胺凝胶上检测纯度，显示只存在一个组分。蛋白浓度通过如下氨基酸分析来测定将样品的等分试样在抽空的玻璃管中在6NHC1，0.1%苯酚中在110°C水解16小时。用AppliedBiosystems420A氨基酸分析系统按照制造商的说明书操作来定量所得的氨基酸。从氨基酸的量，能够计算在水解的等分试样中的蛋白的总质量和浓度。如实施例1("肌醇六磷酸酶活性的测定，，)中所述以FYT单位来测定肌醇六磷酸酶活性，而将比活性计算为肌醇六磷酸酶活性，所述肌醇六磷酸酶活性以FYT单位每mg肌醇六磷酸酶变体酶蛋白来测量。SEQIDNO:2和变体072(SEQIDNO:2的1362R)的肌醇六磷酸酶的比活性如上述测定。变体072的比活性是SEQIDNO:2的肌醇六磷酸酶比活性的86%。不确定性(标准差)估计约为10%,主要是由于肌醇六磷酸酶活性测定法基于复杂的底物。实施例8:温度稳定性如实施例1中所述制备SEQIDNO:2的多个变体，并将枯草芽孢杆菌宿主菌株在500ml摇瓶中的100mlPS1培养基(100g/L蔗糖，40g/L大豆薄片，7610g/LNa2HP04.12H20,O.lml/LDowfax63N10(Dow》中在30。C以300rpm培养四天。两个参考肌醇六磷酸酶以相同方式制备，即具有SEQIDNO:3的肌醇六SEQIDNO:4的肌醇六磷酸酶(相应于SEQIDNO:2的变体N31D/N121T/K132T/Q139K)。还包括具有SEQIDNO:9的肌醇六磷酸酶进行对比(相应于SEQIDNO:2的变体Q3P/N31D/N121T/K132T/Q139K)。变体的和参考肌醇六磷酸酶的温度稳定性如下确定通过添加20ulG效升)上清液至180ul0.1M乙酸钠緩沖液，pH5.5+0.005%Tween-20来将上清液稀释十倍。将稀释的酶分成两部分，一部分在60。C在塑料容器中温育，另一部分保存在5。C。在60。C温育30分钟之后将蛋白溶液转移至冰浴。在0.1M乙酸钠緩冲液，pH5.5和0.005%Tween-20中以1:10稀释后，通过实施例1中(磷酸酶活性的确定)的磷酸酶测定法测量冷却的和加热的样品的活性，扣除緩沖液空白。表5是与参考肌醇六磷酸酶相比具有改进的温度稳定性的变体列表。对于每个变体，该表还描述了与SEQIDNO:2相比的变化。分别测定了在5。C和60。C温育30分钟后的酶活性(以吸收单位(AU)表示)，并且将残余活性(RA)计算为以热处理样品(60。C温育)的活性除以冷却样品(5。C温育)的活性来。接下来，将残余活性的结果相对于以相同方式表达和处理的SEQIDNO:2的肌醇六磷酸酶的残余活性标准化。得出的改进因子(IF)在表5中显示。对于SEQIDNO:2的肌醇六磷酸酶，IF是1.0，而SEQIDNO:3和4的两个参考肌醇六磷酸酶与SEQIDNO:2的肌醇六磷酸酶相比则热稳定性较差，这从这两个肌醇六磷酸酶的IF分别仅为0.1和0.3的事实中是显而易见的。表5:具有改进的热稳定性的肌醇六磷酸酶变体No.突变IF026N31D/Q139K/L197F/N316K(SEQIDNO:3)0.1101Q3P/N31D/N121T/K132T/Q139K(SEQIDNO:9的氨基酸23-433)0.3102N31D/N121T/K132T/Q139K(SEQIDNO:4)0.3078V409E0.3019N136P0.3082E411K0.4058E331K/V55D0.4086E167Q0.4110Kl79K/T180T/T181D/E182K/K183L/S184*/Tl85*/Kl86*0.4059K107E0.4087E196Q0.5070T276R0.5048E285G0.5053I299L0.5089T200K0.5065E119R0.6085N121D0.6036K107D0.6107Kl79K/T180E/T181K/E182H/K183Q/S184*/Tl85*/Kl86*0.6095D314N0.7022S161P0.7079T410D0.7004K141C0.7108Kl79K/T180E/T181K/E182Q/K183Q/S184*/Tl85VK186*0.7094E285N0.7068R164E0.8081E411R0.8002G52C0.8020T137P0.8096D314G0.8120E1K0.9042El*/E2*/Q3*0,9043N121T0.9098E406A0.9063Q82E0.9038Q109A0.9000SEQIDN0:21.0016G5P1.0030E57Y1.0074I379R1.0041El*/E2*1.0080T410E1.1040E1*1.2066E119K1.2<table>tableseeoriginaldocumentpage79</column></row><table>实施例9:根据DSC的热稳定性如实施例1中概括所述制备SEQIDNO:2的多个纯化变体。以相同方式制备两个参考肌醇六磷酸酶，即具有SEQIDNO:3的肌醇六磷酸酶(相应于SEQIDNO:2的变体N31D/Q139K/L197F/N316K)，和具有SEQIDNO:4的包括具有SEQIDNO:9的肌醇六磷酸酶用于比较(相应于SEQIDNO:2的变体Q3P/N31D鹿21T/K132T/Q139K)。将蛋白样品的等分试样相对于2x500ml20mM乙酸钠pH4.0在4°C在2-3小时的步骤中透析，接着透析过夜。每个样品经0.45um过滤并用緩沖液稀释至约2个A，单位。测得的确切吸收值在结果表中给出。在MicroCalVP-DSC上进行DSC,在20mM乙酸钠緩冲液,pH4.0中，在20-90。C范围内以90°C/h扫描速率进行。得到的变性温度(Td)在下面表6中显示，总结了三个不同实验的结果。表6:通过DSC的Td测量<table>tableseeoriginaldocumentpage80</column></row><table>实施例10:纯化和温度曲线本文所用的肌醇六磷酸酶变体和参考和比较性的肌醇六磷酸酶如下进行纯化含有肌醇六磷酸酶的发酵上清液先以7200rpm和5°C离心一小时，然后经四层Whatman玻璃微纤维滤纸(2.7,1.6,1.2和0.7微米)的多层装置(sandwich)过滤。接着将溶液进行无菌过滤(或者经过带有0.22(im截留值(cut-off)的快速PES瓶顶部滤器(FastPESBottletopfilter),或者利用压力经过Seitz-EKS深度滤器(Seitz-EKSdepthfilter))。向溶液中添加固态硫酸铵，得到终浓度1.5M,用6MHC1将pH调节至6.0。将含肌醇六磷酸酶的溶液加到丁基-琼脂糖柱上，在XK26柱中约50ml，使用25mMbis-tris(二-(2-轻乙基)亚氨基-三(羟曱基)甲烷(Bis-(2-hydroxyethyl)imino-tris(hydroxymethyl)methan))+1.5M疏酸镇pH6.0作为緩冲液A,使用25mMbis-trispH6.0作为緩冲液B。使用磷酸酶测定法(参见实施例1，"磷酸酶活性的测定，，)分析来自柱子的级分的活性，并汇集具有活性的级分。将汇集的级分相对于10mM乙酸钠pH4.5充分(extensively)透析。接着，将含肌醇六磷酸酶的溶液在S琼脂糖上通过层析纯化，约75ml于XK26柱中，用50mM乙酸钠pH4.5作为緩沖液A,和50mM乙酸钠+1MNaClpH4.5作为緩冲液B。同样，分析来自柱子的级分的活性并且汇集有活性的级分。最后，用带有10kDa截留值的膜的Amiconultra-15过滤装置将含有纯化的肌醇六磷酸酶的溶液浓缩。在所有情况下，所有肌醇六磷酸酶的分子量(如由SDS-PAGE估计的)为约40kDa,且纯度大于95%。变体的温度曲线(肌醇六磷酸酶活性作为温度的函数)基本上如实施例1所述("肌醇六磷酸酶活性的测定")在20-90°C的温度范围确定，然而，酶反应(100微升含肌醇六磷酸酶的酶溶液+100樣l升底物)不在微量滴定板上而在PCR管内进行。在预期温度的15分钟反应期结束后，将管冷却至20。C持续20秒，将150微升反应混合物转移到微量滴定板上。添加75微升终止试剂并在微量滴定板分光光度计中测量在405nm的吸光度。结果在下面表7中总结。对于每个温度(20-90。C,以10。C为一级)给出的数字是相对于最优值标准化的相对活性(以％表示)。表7:温度曲线No.肌醇六磷酸酶40温jWe)70809020305060026SEQIDNO:31832527410044-l102SEQIDN0:42237557910017104000SEQIDNO:22034546810021115SEQIDNO:9的氨基酸10123-43316285065100126-l81018SEQIDN0:2的Q111P2034537510017104030SEQIDNO:2的E57Y21355779訓28104031SEQIDNO:2的T76G2034557710023104037SEQIDNO:2的K07G2134557710032114041SEQIDNO:2的El*/E2*213456781001594044SEQIDNO:2的M273L21355679100269050SEQIDNO:2的N286Q163244841006-1-7056SEQIDNO:2的I362K203554781002593062SEQIDNO:2的W46E274265841001812072SEQIDNO:2的I362R213556791002311083SEQIDNO:2的E53V203253761002210093SEQIDNO:2的E241Q2237598310020103变体030,031，037，044，056,062，072,083和093存70。C时与参考肌醇六磷酸酶026和102相比具有较高的相对活性。实施例11:pH曲线在前面实施例中用到的多个变体及相同参考以及比较性的肌醇六磷酸酶的pH曲线(肌醇六磷酸酶活性作为pH的函数)在37°C在2.0至7.5的pH范围(以0.5个pH单位为一级)如实施例1所述("肌醇六磷酸酶活性的测定")来确定，只是使用緩冲液混合液(cocktail)(50mM甘氨酸，50mM乙酸和50mMBis-Tris)取代了0.25M乙酸钠pH5.5緩冲液。结果在下面表8中总结。对于每个pH(2.0-7.5)给出的数字是相对于最优值标准化的相对活性(以％表示)。表8:pH曲线No.肌醇六磷酸酶pH2.02.53.03.54.04.55.05.56.06.57.07.5026SEQIDNO:3306287991009584654014-1-2102SEQIDNO:42665879710093826643170-4000SEQIDNO:2336089100999580613511-2-4101SEQIDNO:9的氨基酸23-43337658797100938065421920018SEQIDN0:2的Q111P276189971009075573210-2-4030SEQIDNO:2的E57Y3560869710092796036131一3031SEQIDNO:2的T76G3460869910093796236121-1037SEQIDNO:2的K107G335987100999378603410-2-4041SEQIDN0:2的E1"E2承296289100100937959341221044SEQIDNO:2的M273L3163871009994816236120-l82<table>tableseeoriginaldocumentpage83</column></row><table>对YC062和YC091,pH曲线(相对活性作为pH的函数)，看起来向较高pH偏移了0.5pH单位。进而，当对于表8的肌醇六磷酸酶(包括参考肌醇六磷酸酶026和102)的多数而言最优值在pH3.5-pH4.0时，观察到对于编号062,085和O89的最适pH为3.5，)见察到对于编号091和093的最适pH为4.0。实施例12:温度稳定性通过在70。C和pH4.0(0.1M乙酸钠)温育后测量残余肌醇六磷酸酶的活性来测定如前面实施例中的多个纯化的变体和相同的参考以及比较性的肌醇六磷酸酶的温度稳定性。将肌醇六磷酸酶温育，样品在0,10，30和60分钟后撤出并在水上冷却。使用实施例1中所述("肌醇六磷酸酶活性的测定")的方法来测定pH5.5的残余活性。将结果相对于在0分钟时的活性标准化，在下面表9中显示。表9:温度稳定性<table>tableseeoriginaldocumentpage84</column></row><table>上面结果显示编号044，062,072和083在这些条件下(70。C和pH4)可能比参考肌醇六磷酸酶更稳定(尽管在此实验中对于编号000观察到有大的偏差)。实施例13:计算同一性百分比和鉴定相应位置用EMBOSS软件包2.8.0版本的Needle程序将SEQIDNO:9与SEQIDNO:2比对。所用的取代矩阵为BLOSUM62,缺口开启罚分为10.0，缺口延伸罚分为0.5。得到的比对结果在图2中表示。SEQIDNO:9和SEQIDNO:2之间的同一性程度如下计算精确匹配的数目是406(所有这些用垂直划(verticalstroke)表示)。最短序列的长度是411(SEQIDNO:2)。同一性的百分比是406/411x100%=98.8%。也将图2的比对结果用于推导相应的位置，如下在该比对中互在顶部的氨基酸处于相应的位置。例如在SEQIDNO:2位置3上的氨基酸Q对应84于SEQIDNO:9位置号25的氨基酸P。就本发明而言，我们采用SEQIDNO:2的位置号。因此，可以将SEQIDNO:9考虑为包含取代Q3P的SEQIDNO:2的变体。在比对结果的重叠部分内以取代形式存在的其它差异处于位置31，121，132和139，即N31D，N121T，K132T和Q139K。此外的差异存在于N-末端，在N-末端与SEQIDNO:2相比SEQIDNO:9具有22个氨基酸的延伸。因此总体上，可以将SEQIDNO:9考虑为以下SEQIDNO:2的变体*0aM/*0bS/*0cT/*0dF/*0eI/*0fI/*0gR/*0hL/*0iL/*0jF/*0kF/*0mS/*0nL/*0oL/*0pC/*0qG/*0rS/*0sF/*0tS/*0uI/*0vH/*0wA/Q3P/N31D/N121T/K132T/Q139K。权利要求1.肌醇六磷酸酶，其与SEQIDNO2具有至少74％同一性并与SEQIDNO2相比在选自下组中的至少一个位置包含至少一个变化1，2，3，4，5，31，41，46，52，53，55，57，59，74，76，82，84，91，99，100，104，105，107，109，111，114，115，116，117，118，119，120，121，122，123，124，136，137，141，154，161，162，164，167，171，176，177，179，180，181，182，183，184，185，186，196，199，200，202，203，218，223，239，240，241，247，273，276，281，282，283，284，285，286，289，294，299，308，314，316，324，331，339，351，355，362，379，385，406，409，410和411；条件是该肌醇六磷酸酶不是SEQIDNO3，不是SEQIDNO4，并且不是SEQIDNO6。2.权利要求l的肌醇六磷酸酶不是SEQIDNO:9和其图l中列出的变体。3.权利要求1和2中任意一项的肌醇六磷酸酶，其包含至少一个下列变化1*,2*,3*，4P，5P，31C,T,41P,46C，D,E，52C,E,53V，Q，55D,I，57Y,59C，74A,76G,82E，84Y,91C,P,99C,100C，104A，105F，107D,E，G,109A,G,111P，114H，N,T,115Q,116A，E，P，T，Q,117D，E，K，1181,L，M，T,119G,K，R,S，120K，S,T，Q，121A,D,M,P,T,V,122D,123P,S，124L，T，V，136P，137P，141C,154P，161P，162C，164D，E，167Q，171T，176C，177C,179GI，K,N,Q，180A,E，G,T，181D，QI,K,182H，K，S，Q,183A,L,P，S，V，Q，184*,185*，186*，196Q，199C，200K,R，202N,203T，218Q,223E，239Q,240P，241Q,247C，273L，Q,276K,R，281H，282P,283P，284P，285G,N,R，286K,Q,289P,294T，299L，308A,314GN，316D，324N,331K，339D，351Y,355P,362K,R,379K,R，385D,楊A,409D,E，410D，E和/或411R,K。4.权利要求3的肌醇六磷酸酶，其中位置179,180，181,182，183,184,185和186的氨基酸已被QADKP，GEDKP,NGISA，IAGKS,KEKHQ,KEKQQ,KEKKV或KTDKL取代。5.肌醇六磷酸酶，其与SEQIDNO:2具有至少74%同一性并包含至少一个下列变化1H,K,R,60P,105E，106A，G，155F，157F，173P,175L,188P，205P，215M，231P，254Y，280P,330D和/或371P;条件是该肌醇六磷酸酶不是SEQIDNO:3，不是SEQIDNO:4，不是SEQIDNO:6，且不是SEQIDNO:9及其在图1中列出的变体。6.权利要求1-4中任一项的肌醇六磷酸酶，其包含选自如下变化52C，141C，162C，31C,52C,99C,59C,100C,141C/199C，4P，5P，111P,137P,161P，52E，57Y，76G,107D，107G，109A，1*，1*/2*，1*/2*/3*,121T，273L,285G，286Q，299L，362K，331K/55D，107E，46E,82E，119R,119K，164E,223E，276R,276K,362R，379R,379K,385D,410D,410E，411R，411K,53V,121D，167Q,196Q，200K,202N，218Q,241Q，285N,314N,314G,楊A，179K/180E/18歸82H/183Q/184*/185*/186*，179K/180E/181K/182Q/183Q/184*/185*/186*，179K/180E/18IK/182K/183V/l84*/185*/186*，179K/180T/181D/182K/183L/184*/185*/186*，111P/241Q，1K,7.权利要求1-6中任一项的肌醇六磷酸酶，其为SEQIDNO:2的肌醇六睃酶的变体(8.权利要求1-6中任一项的肌醇六磷酸酵，其为SEQIDNO:3的肌醇六^^酸酶的变体。9.权利要求1-6中任一项的肌醇六磷酸酶，其为SEQIDNO:4的肌醇六磷酸酶的变体。10.权利要求1-6中任一项的肌醇六磷酸酶，其为SEQIDNO:6的肌醇六磷酸酶的变体。11.权利要求1-6中任一项的肌醇六磷酸酶，其为SEQIDNO:9的肌醇六磷酸酶的变体。12.权利要求1-6中任一项的肌醇六磷酸酶，其为与SEQIDNO:9相关的并在图1中列出的肌醇六磷酸酶变体的任何一个的变体。13.权利要求1-12中任一项的肌醇六磷酸酶，其还包含选自在图1的每行中列出的取代和取代组合中的取代或取代组合。14.权利要求1-13中任一项的肌醇六磷酸酶，其具有改进的热稳定性，改进的pH曲线，改进的比活性，修改的糖基化模式，改进的温度曲线，在动物饲料中改进的性能和/或其掺入潜在的蛋白酶切割位点的变化。15.分离的核酸序列，其包含编码权利要求1-14中任一项的肌醇六磷酸酶的核酸序列。16.核酸构建体，其包含权利要求15的核酸序列，所述核酸序列可操作地连接于一个或多个指导肌醇六磷酸酶在合适的表达宿主中产生的调控序列。17.包含权利要求16的核酸构建体的重组表达载体。18.包含权利要求16的核酸构建体和/或权利要求17的表达载体的重组宿主细胞。19.产生权利要求1-14中任一项的肌醇六磷酸酶的方法，其包括(a)培养权利要求18的宿主细胞以产生包含所述肌醇六磷酸酶的上清液；和(b)回收所述力几醇六磷酸酶。20.—种转基因植物或植物部分，其能够表达权利要求1-14中任一项的肌醇六磷酸酶。21.能够表达权利要求1-14中任一项的肌醇六磷酸酶的转基因非人动物，或其组成部分或产物。22.组合物，其包含权利要求1-14中任一项的至少一种肌醇六磷酸酶，和(a)至少一种脂溶性维生素；(b)至少一种水溶性维生素；和/或(c)至少一种痕量矿物质。23.权利要求22的组合物，其进一步包含至少一种选自下组的酶淀粉酶，肌醇六磷酸酶，磷酸酶，木聚糖酶，半乳聚糖酶，a-半乳糖苷酶，蛋白酶，磷脂酶和/或(3-葡聚糖酶。24.权利要求22-23中任一项的组合物，其为动物饲料添加剂。25.动物詞料组合物，其具有50至800g/kg的粗蛋白质含量并且包含权利要求1_14中任一项的肌醇六磷酸酶或权利要求22-24中任一项的组合物。26.用于改进动物饲料的营养值的方法，其中将权利要求1-14中任一项的肌醇六磷酸酶或权利要求22-24中任一项的组合物添加至饲料。27.降低动物粪便中肌醇六磷酸盐水平的方法，其包括用有效量的权利要求25的詞料喂养动物。28.处理植物蛋白质的方法，其包括将权利要求1-14中任一项的肌醇六磷酸酶或权利要求22-24中任一项的组合物添加到至少一种植物蛋白质或蛋白质源的步骤。29.权利要求1-14中任一项的肌醇六磷酸酶或权利要求22-24中任一项的组合物的用于如下的用途在动物饲料中；在动物祠料的制备中；用于改进动物祠料的营养值；用于降低动物粪便中的肌醇六磷酸盐水平；用于处理植物蛋白质；或用于从肌醇六磷酸酶底物中释放含亚磷的物质。全文摘要本发明涉及与源自布氏柠檬酸菌(Citrobacterbraakii)的肌醇六磷酸酶具有至少74％同一性并与该肌醇六磷酸酶相比包含至少一个变化的肌醇六磷酸酶。这些肌醇六磷酸酶变体具有经过修改，优选改进的特性，如热稳定性、温度曲线、pH曲线、比活性、在动物饲料中的性能，降低的蛋白酶敏感性，和/或修改的糖基化模式。本发明还涉及编码这些肌醇六磷酸酶的DNA，它们的制备方法，以及它们的用途，例如在动物饲料方面和动物饲料添加剂中的用途。文档编号C12N9/16GK101460612SQ200780020771公开日2009年6月17日申请日期2007年3月19日优先权日2006年4月4日发明者伦纳多·德玛利亚,卡斯滕·安德森,拉斯·K·斯科夫,迈克尔·B·索伦森申请人:诺维信公司