本发明属于冷冻干燥领域，特别涉及一种恒温检测酶制剂冷冻干燥的工艺方法。
背景技术：
1、真空冷冻干燥是利用升华的原理使物料脱水的一种干燥技术。其大致的原理过程为将湿物料或溶液在较低的温度下冻结，然后在真空 (低于水的三相点压力)条件下升华干燥，使物料中的水分不经过液态直接升华到气态（除去冰晶），待升华干燥后再进行解析干燥，最终使物料或溶液脱水的冷冻干燥技术。
2、与需要升温、降温等步骤的pcr检测相比，等温恒温检测在等温恒温（37～42℃）条件下即可检测。10～20分钟出具结果，具有检出时间短，方便，快捷等优点。
3、然而，等温恒温检测也存在着一些限制。例如，在液体状态下的恒温检测酶制剂保存和运输过程对温度的要求都极高。过高的温度会使得酶制剂变性失活，所以一般要求在-70℃以下保存，常用干冰运输。而使用干冰则意味着高成本，显然不能适应市场需求。
4、在这种情况下，考虑将酶制剂进行冷冻干燥，成为了一个新的突破口。有鉴于此，得到一种用于恒温检测酶制剂冷冻干燥的方法是本发明技术方案所研究的内容。
技术实现思路
1、本发明提供一种恒温检测酶制剂冷冻干燥的方法，其目的是要解决恒温检测酶制剂运输保存成本高的问题。
2、为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：
3、一种恒温检测酶制剂冷冻干燥的方法，其特征在于：包括以下步骤：
4、步骤一：在-10℃至0℃下，将酶制剂、双蒸水、冷冻干燥保护剂按2～7 : 2～7 : 2～3的质量比例混合均匀，并在-10℃至0℃静置20～30min，得到预混合液；
5、其中，所述冷冻干燥保护剂为海藻糖、麦芽糖、聚乙二醇三者的混合物，其中，海藻糖占预混合液的3～8%（w/v），麦芽糖占预混合液的0.5～2%（w/v），聚乙二醇占预混合液的5～12%（w/v）；
6、步骤二：
7、将预混合液放入冻干机，先在-45℃至-55℃下进行5～8小时预冻，
8、之后，在-25℃至-35℃、压力0.10～0.60 mbar条件下进行5～10小时升华干燥，去除预混合液中游离态的水，
9、接着，在23℃至34℃、压力0.01～0.10 mbar条件下进行5～10小时的解析干燥，去除绝大部分结合水，得到冷冻干燥的恒温检测酶制剂。
10、其中的，所述酶制剂包括酶组合物，所述酶组合物包括dna聚合酶、辅助因子、单链结合蛋白、重组酶。
11、其中的，所述酶制剂包括反应试剂，所述反应试剂包括dntps、atp、tris、dtt、肌酸激酶。
12、其中的，所述酶制剂中，包括酶组合物和反应试剂，所述酶组合物和反应试剂的质量比为3～10:10～15，所述酶组合物包括dna聚合酶、辅助因子、单链结合蛋白、重组酶，所述反应试剂包括dntps、atp、tris、dtt、肌酸激酶。
13、其中的，所述海藻糖占预混合液的4～7%（w/v），麦芽糖占预混合液的0.75～1.1%（w/v），聚乙二醇占预混合液的6～10%（w/v）。上述“w/v”代表质量浓度。
14、其中的，所述聚乙二醇的分子量为20000-40000。
15、其中的，双蒸水（ddh2o）是指经过2次蒸馏后取得的水，双蒸水中的有机物、微生物、有机物、可溶解气体和挥发性的含量都变得极低，同时还去除了热源，一般用于注射用水。
16、另外，在解析干燥过程中，可按定时结束，但从节能环保的角度，可通过多种现有方法判断干燥终点，如通过电容真空计和皮拉尼真空计测定真空度数值一致判断升华干燥结束。同样的，从节能环保的角度考虑，可通过温度探头法判定解析干燥结束，但按定时结束也是可行的。
17、冷冻干燥后的酶制剂，可添加乙酸镁和双蒸水的混合物，复原酶制剂。乙酸镁中的镁离子是dna聚合酶不可或缺的辅助因子，镁离子可以启动整个扩增反应。
18、关于本发明设计原理和效果是：
19、本发明技术方案中，冷冻干燥过程主要包括预冻、升华干燥、解析干燥。
20、预冻是冷冻干燥的第一步，在预冻过程中，预冻速率、预冻温度和预冻时间是影响冷冻干燥后续过程的主要因素。冻结速度的快慢对冻品和产品有一定的影响，比较而言，冻结速度快，则晶核多，晶型小，冻品结构均一，升华速度快，产品的外观细腻，易于保持原有的结构，且复水性好；冻结速度慢，则晶核少，晶型大，冻品结构的均一性差，升华速度快，但冷冻干燥后产品的外观较粗糙，表面常有一层薄膜或硬壳，同时，由于机械效应和溶质效应，生物药原有结构易受破坏，而且复水性差。
21、本发明的恒温检测酶制剂的冷冻干燥工艺，关键在于预冻温度和时间，升华干燥的温度和时间以及解析干燥的温度和时间。本技术方案的冷冻干燥工艺具有使蛋白质在低温低压下脱水，保证破坏蛋白质活性的化学反应难以进行的同时，对恒温检测酶制剂干粉保存期的延长及保存温度具有良好的作用。干燥后的恒温检测酶制剂具有疏松多孔，呈海绵状，加复溶液溶解迅速而完全，几乎立即恢复原来的形状等优点，有利于储存和运输，对于工业化生产有极大的优势。
22、另外，本技术方案不仅对温度时间进行控制，鉴于冷冻和干燥两个过程无法避免地可能造成部分酶的损伤、死亡。所以，本发明技术方案中还涉及了保护剂的选择，有效的防止活性组分发生变性，提高了产品稳定性。
23、总的来说，本发明的有益效果在于：
24、1冷冻干燥时间短，解决了运输和保存的严苛条件限制，大大减少了运输和贮存的成本，在工业生产上大大节约了生产成本；
25、2 加入复溶液后，能快速完全复溶；
26、3 提高恒温检测酶制剂的保存温度，降低保存温度限制；
27、4 延长恒温检测酶制剂产品的保存期的同时降低了于运输温度的要求。
1.一种恒温检测酶制剂冷冻干燥的方法，其特征在于：包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述酶制剂包括酶组合物，所述酶组合物包括dna聚合酶、辅助因子、单链结合蛋白、重组酶。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述酶制剂包括反应试剂，所述反应试剂包括dntps、atp、tris、dtt、肌酸激酶。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述海藻糖占预混合液的4～7% w/v，麦芽糖占预混合液的0.75～1.1% w/v，聚乙二醇占预混合液的6～10% w/v。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述聚乙二醇的分子量为20000-40000。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述酶制剂中，包括酶组合物和反应试剂，所述酶组合物和反应试剂的质量比为3～10:10～15，所述酶组合物包括dna聚合酶、辅助因子、单链结合蛋白、重组酶，所述反应试剂包括dntps、atp、tris、dtt、肌酸激酶。