在快速冷却小型生物学样品中提高冷却速度的系统和方法

专利名称：在快速冷却小型生物学样品中提高冷却速度的系统和方法
在快速冷却小型生物学样品中提高冷却速度的系统和方法 相关申请的交叉引用
根据美国联邦法典35编第119(e)条(35 U.S.C. 119(e))，本申请要求2006 年3月30日提交的美国申请号60〃87，206和2006年9月28日提交的 60/60/847,666的优先权，二者通过引用纳入本文。
對月絲
1. 发明领域
总体上，本发明涉及将小型(IO微升或更小)生物学样品快速冷却至低温 (约150 K或更低)的方法和装置。这些方法和装置能最大程度减小在冷却至低 温的液体和固体(例如，铜)表面之上形成的冷气层厚度，从而能在相同或相似 的压力下用另 一种温度更高且更均匀的气体替代该冷气层。
2. 背景技术描述
冷冻保存蛋白质、细胞、组织和其它生物学样品在现代生物学和医学中起 着至关重要的作用。例如，常将从天然来源提取或从遗传工程改造的生物获得 并溶解于水性(含水的)缓冲液中的蛋白质冷冻在沸点或蒸发温度Tv=77 K的液 氮中，然后储存在液氮、干冰(Tv-195K)或低温冰箱中(Tsl95K)，以防它 们降解。然而，冻融循环常导致会影响蛋白质功能的蛋白质结构改变，以及蛋 白质凝聚和沉淀。
冷冻保存精子对于动物通过人工授精繁殖、治疗人类不育症和保护濒危物 种至关重要。目前的方法通常包括首先在干冰(T^195K)上缓慢冷却，然后在 液氮中快速冷却至T-77K。冷冻保存和融化后的精子存活率，特别是受精率 极为不同，而且往往极端不佳。
冷冻保存对于测定蛋白质分子结构的蛋白质晶体学也至关重要。用于测定 蛋白质和病毒结构的X-射线易于破坏它们的晶体。将这些晶体冷却至T- 120 K或更低能大大降低这种破坏作用。这样就限制了 X-射线吸收产生的羟基、氢基团和其它反应物质的扩散，从而降低它们攻击蛋白质的能力。因为这些晶体 含有大量水，冷冻水产生刚性框架，从而限制分子响应于破坏作用而运动。目 前冷冻保护所采用的方法包括将晶体浸在冷冻保护剂中，然后将晶体插入冷气 流或将其投入液氮或丙垸来冷却。这些方法破坏了晶体、降低了对它们进行
x-射线衍射检测可获得的分子结构的精确性和细节。
在冷冻保存中用于除去样品的热量并将它们维持于低温的普通冷却剂包
括干冰(TV=195K);封闭循环低温冰箱(T 195K); T约100K(氮气)或 T约20K(氦气)的冷气流；处于沸点的液氮(Tv = 77K);温度恰高于融点 的烃类，例如丙烷和乙垸(分别是Tm-卯K和83K);和T-200K以下维 持液态的低温致冷剂(含氯氟烃(CFC)和它们的现代替代品)。与气体相比， 液体常能提供更有效的传热和冷却作用。在汽化之前，融解温度和沸腾温 度之间差别较大(例如丙烷(TV=184K， AT-94K)和乙垸(Tv=231 K， AT = 148 K)并维持于恰在融解温度之上的液体能比例如氮气(Tm-63 K， AT= 14 K)从样品中吸收更多热量。当将温暖样品投入液体中时，围绕其而产生的 蒸气使得该样品与液体隔绝，从而降低了冷却速度；诸如丙烷和乙烷等液 体能减少所产生的蒸气量，通常能获得较大的传热速率。对于液体样品， 可通过在冷金属表面冷冻来消除气体产生的问题，但在金属表面冷却效率 较低和/或破坏蛋白质晶体、细胞和组织。
蛋白质溶液、蛋白质晶体、细胞和组织均含有大量水，因此，最终的样品 温度和冷却至该温度的速度对于测定冷冻样品的特性和冷冻保存的成功至关 重要。如果缓慢冷却水，其形成晶体(通常是六角形的)冰。冰晶体随着水冷冻 的生长可刺穿细胞壁，使蛋白质晶体晶格断裂并对生物学样品造成其它损伤。 如果将水快速冷却至其玻璃化转变温度(Tg 136 K)下，可避免晶体冰形成， 水会形成无定形、玻璃化或玻璃态的状态。
纯水只在冷却速度约106 K/s时玻璃化，只有体积非常小(<10'6微升)的 样品和表面积-体积比非常大的样品可达到这样的冷却速度。冷冻保护剂 (CPA),例如甘油、乙二醇、二甲基亚砜(DMSO)、聚乙二醇(PEG)、糖和甚 至蛋白质(非常髙的浓度)能抑制晶体冰形成，从而能在较高温度以及利用较 低冷却速度获得玻璃相。CPA浓度足够高(例如，60%甘油)，甚至采用非常
6慢的冷却以及在利用干冰或-80'C(193 K)冰箱可接近的温度下亦可获得玻 璃化冰相。因此，冷冻保护剂广泛用于生物学样品的冷冻保存中。
然而，冷冻保护剂(特别是髙浓度的)会对样品造成渗透压冲击(osmotic shock),从而导致细胞破裂或晶体分裂、蛋白质构象改变及其它化学和物理学 改变，进而使得样品在冷却前和/或随后的升温期间降解。因此，优选较髙的样 品冷却速度以降低获得玻璃化冰所需的冷冻保护剂浓度。
为在冷却期间维持样品的完整性和均匀性，也优选较高的冷却速度，从而 能获取和保留在例如室温或体温下观察到的样品的原始天然结构和功能。样品 的基本上所有物理和化学特性(包括蛋白质构象和溶解性、盐溶解性、pH和水 的活性)随温度而有所不同。这些特性在样品冷却期间发生改变可导致盐或蛋 白质沉淀、蛋白质的构象异质性、膜结构改变和其它问题，从而使得冷冻保存 的样品的结构偏离原始结构。快速冷却使得样品的组分没有时间对改变的温度 起反应，所有的运动即冻结。因此，快速冷却可以更精确地保留样品的天然结 构。
在蛋白质低温晶体学中，将晶体插入TslOO K的冷氮气流中或将其投入 处于沸点的液氮或恰在其融点之上的液体丙垸中使之冷却。报道的冷却速度是 约300-1500 K/s，因此晶体从273 K冷却至120 K的时间是0.1-1 s。甚至在 利用高浓度的冷冻保护剂(例如，30%甘油)时，X-射线衍射检测证实这些中 等冷却速度导致晶体遭相当大的破坏。这种破坏作用是得到的分子结构质 量的主要限制因素。至少在一些情形中，冷冻的蛋白质结构在重要方面与 室温的生物学相关结构不同。与蛋白质溶液、细胞(例如，精子)和组织的冷 冻保存标准方案中的那些冷却速度(通常是0.1-10 K/s的范围)相比，蛋白质 晶体学中达到的这些中等冷却速度仍是极高的。
报道的最快生物学样品冷却速度在低温电子显微术领域达到。将承载在薄 金属栅格上的约0.1微米厚样品(通过显微切片技术产生)以髙速(约5 m/s)投入 液体乙烷中可以达到约300,000 K/s的冷却速度。德国FEI公司出售的Vitrobot 是冷冻样品以进行低温电子显微术的最先进市售装置。与用于低温电子显 微术的超薄电子可透射样品(electron-transmissive sample)相比，蛋白质晶 体、细胞和组织均具有非常大的尺寸和非常小的表面-体积比。它们不能承受液体冷冻剂如此高速的冲击，它们(和它们的样品支架)与液体冷冻剂撞击 时的飞溅很成问题。
通过将非常小(1(T5微升)液滴射入真空环境，然后通过蒸发冷却，或者通 过在真空环境中将小液滴喷在冷的金属表面实现含水液体样品的最快冷却。可 采用这两种方法使纯水玻璃化，而不用加入冷冻保护剂。使样品通过真空(或 低压)环境需要复杂的冷却设备和方案，蒸发冷却所要求的样品蒸发和造成的 脱水作用不能精确地保留天然样品结构。在真空中蒸发冷却只对于非常小的样 品(1(T5微升)比在液体中或固体上冷却更有效。因此，与样品在大气压下通过 气体相比(即使有蒸发存在，其高导热性和热质量(thermal mass)亦能最大程度 减少样品冷却)，较大的样品在投入冷液体之前或在此期间暴露于真空或低压 会导致冷却较慢，冷却相关的破坏更多。
本发明人研究了将水和普通冷冻保护剂混合物液滴浸入(投入)液氮(Tv = 77 K)和液体丙烷(温度恰好高于Tm =卯K)的冷却随液滴体积而变化的情 况。体积较小的液滴的表面-体积比较大，因此估计冷却速度较高。这样， 为将较小液滴冷却成玻璃化冰相需要的冷冻保护剂浓度较低。
给定CPA和样品投入液体的速度约为0.5 m/s，对于0.1微升以上的体积， 发现如估计的那样，所需冷冻保护剂(例如，甘油)最低浓度随样品体积减小而 降低。但与估计相反，随着液滴体积减小到0.1微升以下，所需的冷冻保护剂 的最低浓度维持大致恒定和髙浓度(对于甘油大致是28% w/v)。当将液滴置于 超薄铜箔杯上，然后将该杯的底部投入液氮与之接触，达到玻璃化的冷冻保护 剂浓度随液滴体积减小至检测的最小体积(1(T4微升)而呈单调降低。这表明当 将液滴直接投入冷冻剂时观察到的冷冻保护剂浓度饱和是因为体积低于0.1微 升的冷却速度饱和(在该投入速度下)。由于X-射线晶体学测定分子结构所用的 蛋白质晶体的体积为1(rMoJ微升，常规投入冷却中冷却速度的这种饱和解释 了与较大的晶体相比，为何较小的晶体到目前为止在冷却时未能显示破坏明显 较轻、衍射质量明显较好或所需的冷冻保护剂明显较少。
发明概述
本发明鉴定了样品冷却速度小体积饱和的原因。液体冷冻剂(或冷却至低温的固体的)冷表面将紧邻其上的气体冷却。因此，存在厚度有限的冷气层。 该厚度可定量测定为表面以上的距离，在该距离上气体温度升高，例如液体表
面温度和远离该表面的气体温度之间差异的70%,或升高至水的玻璃化转变温 度，或升高至7jC的均相成核温度(homogeneous nucleation temperature),或升 髙至其融化温度。
大体积(热质量髙)样品可穿过该冷气层而其温度几乎不降低。在此情形 中，几乎所有冷却发生在液体中，由液体内的热传递来确定冷却速度(时间)。
然而，体积足够小的样品在气体层中快速冷却，其在表面以上给定髙度处 的温度接近该高度处气体的温度。在此情形中，几乎所有冷却发生在气体层中， 其中达到液体(或固体)表面温度的样品恰高于该表面。这样就将由样品穿越冷 气层所花的时间来确定冷却速度。由冷气层厚度与样品穿越冷气层的速度之比 可大致获得冷却时间。因此，如果投入速度维持恒定，足够小的样品的冷却速 度大致不依赖于样品体积。那么对于含有冷冻保护剂的水溶液，达到玻璃化的 最低冷冻保护剂浓度应不依赖于样品体积。
本发明的实验显示，对于约0.5 m/s的样品投入速度，这些大体积和小体 积冷却方式之间的交叉点出乎意料地在约0.1微升的大样品体积处。这比蛋白 质晶体学中冷却晶体的尺寸大1-6个数量级，而比典型细胞的尺寸大5个数量 级。
提高小型样品冷却速度的一种方法是提高样品通过冷气层的投入速度。进 入液体冷冻剂的投入速度的实际限制有小型装置中样品加速度和减速度的最 高值；样品进入液体冷冻剂表面时液体冷冻剂的飞溅；及加速度和冲击所致的 样品变形、破坏和相对于样品支架的滑移。与用手易于达到的(0.5 m/s)相比， 用于冷冻样品以进行低温电子显微术的现有市售装置只将投入速度增加约10 倍，因此小型样品的冷却速度提高相似倍数。当冷却发生在固体表面上时，投 入速度髙甚至更不切实际。因此，需要能降低冷气层对小型样品投入冷却的影 响的技术。
本发明通过提供将小型(10微升或更小)样品快速冷却至低温的方法和装 置解决了该需要，最大程度降低在冷却至低温的液体冷冻剂和固体(例如，铜) 表面之上形成的冷气层厚度，从而能在相同或相似的压力下用另一更温暖且更
9均匀的温度下的气体替代该冷气层。在一优选方法中，可通过简单地将冷气层 吹走实现。这极大增加了紧邻在液体或固体表面之上的气体的温度梯度，因此， 当小型样品穿过气体向表面运动时，从其初始温度大部分的冷却发生在其进入 液体时(或与固体接触时)而不是在上方的气体层中，即使样品以中等速度运动。 因此，冷却期间的热传递速度极大增加，在样品的初始温度(例如，远离表面 的室温)和液体或固体温度之间冷却样品所需的时间大大縮短。基础实验提示
对于垂直于表面以低于1 m/s的速度运动和在大气压下的样品，这种非常简单 的方法可产生的冷却速度最高达100,000 K/s，这与真空中微米尺寸水滴和将液 滴通过真空喷雾到冷金属表面的蒸发冷却所报道的最高冷却速度相当。所需的 中等样品速度降低了样品与液体撞击而遭破坏的可能性，从而能快速冷却脆弱 的样品。
在第一个优选的实施方式中，本发明通过沿着或横穿样品到达液体或固体 表面的路径产生温暖而干燥的气流，从而基本上降低液体或固体表面附近的冷 气层厚度来克服上述冷却效应。釆用每秒几米或低一些的中等N2流速的实验 确认采用该技术能将上述气体层厚度从约1 cm降低至< 0.01 cm。通过以此方 式基本上除去冷气层，以0.5 m/s中等速度投入液氮(T = 77 K)的80微米热电偶 的检测冷却时间从约0.2 s縮短至约0.01 s，冷却速度增加至15,000 K/s。将样 品体积减小至10微米(单细胞和目前用于蛋白质晶体学的最小蛋白质晶体的大 小)，冷却时间縮短至约0.001 s。因此，通过以非常适中的速度穿过在大气压 下的气体而投入最廉价和最安全的液体冷冻剂可以实现数量级为100,000 K/s 的冷却速度。
实验还确认与目前实践中约30%相比，通过以此方式除去冷气层，在投入 液氮冷却期间达到玻璃化样品所需的最低甘油浓度可随体积连续降低至io'4 微升体积时的约6%。将数据外推至更小的体积产生0甘油浓度时与在真空中 蒸发冷却水滴和将液滴通过真空喷雾到冷金属表面所得一样的体积。因此，除 去冷气层能提供巨大的改进，可能达到最高冷却速度。
可通过几种机构除去冷气层。首先，可利用设置在样品初始位置之上的喷 嘴或其它孔口沿着样品的投入路径喷射温暖而干燥的气流。在此处，"温暖"是 相对于冷表面的温度而言，通常是初始样品温度。对于含水的生物学样品，气体温度应高于样品的玻璃化转变温度和结晶冰形成的均相成核温度，通常还高
于样品内水性混合物的融化温度。对于纯水，这些温度分别约为136 K、 233 K 和273 K。"干燥"表示不含水蒸气，虽然也优选除去融点和/或沸点低于冷 表面温度的其它气体(例如，氧气和二氧化碳)。所有这些气体可能会凝结在 样品和冷表面上，从而污染它们。因此，优选氩气和氦气。
气流可以与投入路径同轴，或者其可与投入途径成任意角度，包括沿着冷 表面。可将气体喷嘴或出口置于固定位置，或者可将其附连于保持样品的垂直 移动机构，从而能与样品一起移动。可以调节喷嘴的大小和形状、其在液体冷 冻剂表面以上的距离以及气体离开其的流速，从而能最有效地除去冷气层并在 液体冷冻剂或固体表面附近产生最大的温度梯度。
气流可以是连续的，或者可以恰好在投入之前利用，例如机械、气动或电 动阀门启动并在投入后关闭。使气流脉动可以尽量减少液体冷冻剂的蒸发，在 液体冷冻剂维持在远低于其沸点(例如，丙烷或乙烷)或固体表面的温度的情形 中，这样能尽量减少表面附近的液体或固体升温。
在第二机构中，连续或间歇的温暖干燥气流流过存在样品的管子，样品通 过该管子在投入液体冷冻剂(氮、丙垸、乙烷)或固体表面上的期间移动。可将 该管子置于冷表面之上，从而其管壁可保持温暖。在该管子较低一端排出的气 体可通过该管壁的孔口，或通过该管子的末端。该管子应由低热质量和低导热 性的材料，例如塑料或玻璃制成。
在第三机构中，液体冷冻剂或冷表面之上可具有封闭的气体空间(gas volume)。用温暖干燥气体替代该气体后，立即投入(样品)。样品可通过在清洗 该空间时关闭的闸门进入。可先通过抽吸除去气体，再引入新的气体，随后立 即投入(样品)。
第四机构将液体冷冻剂升起以接触样品，而不是将样品投入冷冻剂中，其 方式能使其上的冷气流走。然而，这种方法在将冷气层压縮至最小厚度方面通 常不如上述方法有效。
除了上述机构外，可将薄的屏蔽件置于紧邻液体冷冻剂或固体表面之上， 覆盖其大部分或全部。如果其由隔热材料制成并具有整合的辐射屏蔽作用(例 如，镀铝的聚酯薄膜)，可用其降各次投入之间水汽在冷表面上的凝结和冻结。它还可减少暴露面积和热传递，从而减少液体冷冻剂的蒸发。减少暴露面积还 可降低冷气层的天然髙度，以及除去冷气层所需的温暖干燥气体的流速和流 量。投入样品时可打开屏蔽件中的小闸门或孔口。
与存在冷气层的常规投入冷却相比，对于体积在io微升以下(投入速度低) 和r微升以下(普通投入速度)的样品，上述设备可大大增加冷气速度。
对于生物学或其它脱水-或空气-敏感的样品，该设备可包括由阀门或闸门 与投入样品的室或空间隔开的单独样品室。可调节样品室中的环境(例如，湿 度、温度和氧分压)，从而能在冷却前维持或达到所需的特性。
这些设备还包括在样品经冷冻并转移至储存容器后获取样品的机构。例 如，当在液体冷冻剂中进行冷却，其可包含插入有样品的冷冻管，例如汉普顿
研究公司(Hampton Research)出售的那些。其可包含浸入冷冻剂中并插入有样 品的多样品圆盘传送带(例如，金属制成)。还可包括保持并移动这些支架(或 样品)的机构。对于在固体表面冷冻，可以包括将样品从表面刮下并置于储存 容器中的机构。
附图简述
从许多优选实施方式的以下详述连同下文简述的附图可明白本发明的特 征和优点。


图1是使甘油-水混合物玻璃化所需的最低甘油浓度与液滴体积的关系图。 空心圆圈是通过将保持在钨丝环(体积大于1 pl)或微制造(microfabricate)的 聚酰亚胺环(小于1 nl)中的液滴投入液氮(Tv - 77 K)而不除去冷气层所收 集的数据。实心圆圈表示将液滴喷雾到25 fim厚铜杯底上，然后将该杯底 投入液氮中所收集的数据。垂直线表明立方体样品的相应线性尺寸。
图2是在用于投入冷却蛋白质晶体和细胞的标准20cm直径广口杜瓦瓶之 上测得的等温曲线(equal-temperature contours),其中将T,77 K的液氮注入 距该杜瓦瓶边缘4cm内。
图3是对于不同的液体注入液位(以距离边缘的cm测量)，在20 cm杜瓦 瓶中心附近气体温度与保持在Tv=77 K的液氮之上高度的函数关系图。插页显 示当T - 293 K的干燥氮气沿热电偶的路径吹扫时，同一杜瓦瓶中气体温度与液氮之上高度的关系，如本发明所述。Th和Tgo分别表示纯水的均匀冰晶体 成核温度及其玻璃化转变温度。
图4是使水-甘油混合物玻璃化所需的最低甘油浓度与样品体积的关系图。 空心圆圈是直接投入液氮而不除去冷气层的图1所示数据。实心正方形是利 用干燥氮气流除去冷气层后直接投入液氮中收集的数据。实心圆圈是在真 空中通过将小液滴喷在冷的铜表面而使纯水玻璃化的现有技术结果。
图5是减少或消除毗邻液体冷冻剂表面的冷气层的第一种优选实施方式 的示意图，其中与样品投入路径同轴的气流喷嘴沿样品的投入路径在液体冷冻 剂之上提供温暖(例如，室温)干燥气体。
图6显示将气流沿表面引导的第二种优选实施方式。
图7显示图5所示实施方式的一种改变形式，其中首先将样品维持在环境 受控室中，然后经过用于除去冷气层的第二室移入液体冷冻剂。
图8显示图6所示实施方式的一种改变形式，包括环境受控样品室、能除 去冷气层的室和在样品冷冻后获取的旋转支架。
图9显示在冷金属板或杯上快速冷却液体样品或包含在液滴中的样品的 第三种优选实施方式。先除去板上的冷气，再立即分配样品，然后将样品射向 冷板的表面并在其上冷冻。
优选实施方式详述
在给予本发明各种优选实施方式的更详细讨论之前，先讨论最终导致本发 明产生的发明人进行的说明和研究。
首先，发明人研究了将普通水-冷冻保护剂混合物浸在液氮和液体丙垸的 中进行快速冷却(flash cooling)与所冷却的体积的函数关系。将液滴样品从空气 投入液氮或丙垸的杜瓦瓶中来冷却，该方法与低温晶体学用于快速冷却蛋白质 晶体的方法相同。图1显示了投入液氮后获得玻璃化样品所需的最低甘油浓度。 空心圆圈是通过将保持在钨丝圈(体积大于1 jil)或微制造的聚酰亚胺环(小 于1 jil)中的液滴投入液氮(Tv = 77 K)而不除去冷气层所收集的数据。实心 圆圈表示将液滴喷雾到25 fim厚铜杯底上，然后将该杯底投入液氮中所收 集的数据。垂直线表明立方体样品的相应线性尺寸。
13将液滴直接投入液氮的数据显示对于体积为O.l ^以下的样品，甘油浓
度和因此的样品冷却速度饱和，表明采用更小的体积没有益处(降低甘油浓度)。 当在温度恰维持于其融点之上的液体丙垸中冷却样品时观察到相似的饱和情 况。相反，利用铜箔杯获得的数据未显示这种饱和情况，即使液氮从未接触液 滴，冷冻保护剂浓度随体积减小而呈单调降低。这表明在铜上冷冻较小的液滴 远快于直接投入液氮中。
图2是在用于投入冷却蛋白质晶体和细胞的标准20cm直径广口杜瓦瓶之 上测得的等温曲线，其中将Tv-77K的液氮注入距该杜瓦瓶边缘4cm内。在 装有常规通风装置的房间中，在开放实验台上进行该测量。对于液氮，在液体 表面之上约2.5 cm处气体的温度低于水的融化温度Tm = 273 K，在液体表面 之上约2 cm处低于水的均相成核温度Th = 233 K，在液体表面之上约0.7 cm 处低于水的玻璃化转变温度Tg，Q - 136 K。
图3是对于不同的液体注入液位(以距离边缘的cm测量)，在20 cm半球 形杜瓦瓶中心附近气体温度与保持在Tv=77 K的液氮之上高度的函数关系图。 插页显示当T = 293 K的干燥氮气沿热电偶的路径吹扫时，气体温度与液氮之 上高度的关系，如本发明所述。以非常适中的速度(每秒几米)吹扫将液体(注入 到边缘以下4 cm的深度)之上冷气层的厚度从约2 cm减小至不到100 nm，减 小超过两个数量级。
图4显示了减小小型样品上气体层厚度的惊人作用。图4显示了使水-甘 油混合物玻璃化所需的最低甘油浓度与样品体积的关系。空心圆圈是直接投入 液氮而不除去冷气层的图1所示数据。实心正方形是利用干燥氮气流除去 冷气层后直接投入液氮中收集的数据。除去冷气层消除了 0.1 pl体积以下 的甘油浓度和冷却速度的小体积饱和情况，而甘油浓度持续降低至检测到 的最小体积(1(T4 nl)。不除去冷气层，0.1微升以下的所需浓度在28% w/v 饱和。除去冷气层，所需的甘油浓度随体积持续降低，体积为0.1 nl时为 约6%。此外，将利用气体流动的投入冷却数据外推至更小体积产生O甘油浓 度时与在真空中蒸发冷却纯水液滴和将纯水液滴在真空中喷雾到冷金属表面 所得大致相同的体积。因此，除去冷气层能提供巨大的改进，且理论上可能达 到。
14因此，不除去冷气层，0.1 jil以下体积的样品的冷却速度和最低甘油浓 度饱和，而O.l pl是一大于例如X-射线晶体学中所用的几乎所有蛋白质晶
体，也远大于单细胞的尺寸的体积。通过除去冷气层消除了该饱和现象，
用80 pm热电偶检测的冷却速度可以从几百K/s增加至15,000 K/s或更髙。 因此，通过除去冷气层并利用小体积样品，可将液氮中的样品冷却速度增 加两个数量级或更高，而无需诉诸更危险或昂贵的冷却剂，例如丙烷，或 使样品暴露于真空的脱水作用之下。
我们的发明是将小型样品快速冷却至低温的一系列设备，该设备显著 减小在冷表面之上形成的冷气层厚度，从环境温度(例如，室温)几乎突然地 转变成冷液体或冷固体表面温度，从而能最大化气-液或气-固界面附近的温 度空间梯度。在所有情形中，目标是通过除去冷气层或首先是防止其形成 以尽可能减小沿样品路径的冷气层厚度。该设备包括除去液体或固体之 上的冷气层或防止其形成的机构，保持样品的机构，相对于冷液体或固体 移动样品的机构，以及冷液体的容器或由冷液体或低温冰箱冷却的导热固 体材料。
图5显示在诸如液氮、液体丙垸、液体乙烷或具有适当低融化温度的CFC-样致冷剂中冷却至200 K以下温度(通常为Tg。 = 136 K以下)的本发明一种优选 实施方式。通过，例如磁铁、电磁铁、螺钉或扭锁连接装置和正作用爪式夹钳 (可能是电动或气动的)使样品1及其支架2保持在基座3上。
该基座与垂直移动装置4相连。可通过，例如重力(例如，沿导杆的简单 自由落体)、杠杆(可产生大于10 m/s2的样品加速，或类似截切机的机构)、通 过螺线管、通过线性或步进电动机(例如，沿旋转螺杆)、通过毫微米运动电动 机、通过压縮空气(通过活塞)和通过将旋转重物与电离合器耦合于线性移动台 的机构来驱动该垂直移动机构。还可利用多轴机器人臂/机械手进行移动。在各 机构中可调整运动从而能在液体冷冻剂中从静止加速期间和减速至停止期间 提供有限的加速和减速幅度。这样能防止样品在最初加速期间滑出样品支架， 随着样品质量变小该问题不再那么重要。垂直移动机构使样品经温暖气体(例 如，环境温度和压力下的空气)移动至装在杜瓦瓶或其它隔热容器6中的冷液 体5。可通过几种机构除去冷气层。在图5中，温暖(例如，环境温度)干燥气流 (例如，氮气)7从置于样品的初始位置之上的喷嘴8或其它孔口沿样品的投入 路径喷射。该喷嘴通过管子或软管9与气源(例如，压縮气缸、液氮的汽化、 氮气发生器)相连。可将喷嘴置于固定的位置，或者可将其附连于保持样品的 垂直移动机构，因而其可随样品移动。可调节喷嘴的大小和形状、其在液体冷 冻剂表面之上的距离和所喷出的气流速度以最有效地除去冷气层并在液体冷 冻剂表面产生最大温度梯度。基础实验表明非常适中的气流流速(每秒几米或 更小)足以使冷气层厚度縮至100nm以下。气流可以是连续的，或者可以恰 好在投入之前利用，例如机械、气动或电动阀门10将其启动从而尽可能减少 液体冷冻剂蒸发。
气流可以与投入路径同轴，如图5所示，或者其可与投入路径成一定角度 (O-卯。随意)。图6显示了可替换的优选实施方式，其中温暖干燥气体ll通过 喷嘴12和阀门13从与气体源14相连的管子流出，并沿冷液体的表面水平流 动。可以最大程度减小气体在暴露的液体表面之上流动的距离，从而能减少液 体的升温和蒸发。该方法能减小样品在投入液体期间运动穿过的运动气体的厚 度，因此能减少气体运动所致的样品额外蒸发(假如投入速度相对于环境气体 而言小于气体流速)。
图7显示依据图5所示的本发明另一实施方式。在此实施方式中，样品及 其支架附连于垂直移动样品的垂直构件15。首先将样品附连于构件15，然后 通过闸门或阀门16移入维持有，例如理想的温度、相对湿度或氧分压的环境 受控室17中，从而能在冷却之前维持样品的完整性。用隔热且屏蔽辐射的盖 子18罩盖冷液体，所述盖子具有闸门或孔口 19以供样品通过。所述屏蔽盖子 18能减少水蒸气和在高于冷液体温度的温度下会液化和/或冻结的其它气体在 液体表面凝结和冻结。该屏蔽件还能减少热传递，冷液体的升温和蒸发，并减 少样品在投入前的辐射冷却。在投入样品之前，通过使温暖干燥的气体流过而 除去已在冷液体之上形成的冷气，所述温暖干燥的气体从其来源经管子20、阀 门21和扩散器22(产生更几乎均匀的气流)和管子23流动并横穿液体表面，从 管子的底部和域经其侧面的出气孔24排出。一旦以此方法除去了冷气，打开 阀门或闸门25，将样品经管子20投入冷液体中。管子20应置于液体冷冻剂的表面之上，从而其管壁能保持温暖，该管子应用低热质量和低导热性的材料， 例如塑料或玻璃制成。
图8显示依据图6所示的本发明另一实施方式。样品及其支架依旧装在垂 直移动构件30上，并通过闸门或阀门31移入环境受控室32。用隔热且屏蔽辐 射的盖子33覆盖冷液体，所述盖子具有闸门或阀门34以供样品通过。在此情 形中，该屏蔽件形成冷液体之上封闭室35的顶部。在投入样品之前，通过使 温暖干燥的气体流而除去在冷液体之上形成的冷气层，所述温暖干燥的气体从 其来源经管子36、阀门37和扩散器38,在冷液体表面之上流动，并经阀门39 和出气口 40排出。利用与出气口相连的风扇或泵或活塞促进气体除去。先抽 出封闭室35中的气体，随后打开闽门37立即替换成温暖的气体，再进行(样 品)投入。 一旦用温暖的气体清洗了封闭室35,将样品经阀门34和封闭室35
传送i或支架41或其它机构获取和口保持冷冻后的样品:这些装置便于储存和/ 或移出许多样品。
在目前所述的所有实施方式中，通过使温暖的气体相对于在设备框架中静 止的冷液体表面流动来减小冷气层厚度。还可通过使冷液体相对于周围气体运 动，而不是使气体运动来除去冷气层，而所述周围气体相对于设备的框架是静 止的。例如，可升高液体冷冻剂使之接触样品，而不是将样品投入冷冻剂中， 这种方式能使冷冻剂上的冷气流走。可将盛放液体的容器升高，或者可利用泵 或重力产生的压力将冷液体朝上射向样品(类似于喷泉)或喷射通过水平槽。然 后在冷液体流形成后而厚度明显的冷气层形成前马上将样品投入该喷泉或槽 中。
可通过在紧邻液体表面之上放置隔热固体材料以尽可能减小冷气层的初 始厚度，因而在液体和隔热固体之间填充有气体的间隙非常小。可移开或旋开 此隔热层中铰接或单独安装的孔口盘，如果需要，暖气流过暴露的液体表面之 上后立即投入样品。
对于体积小于10微升，尤其是小于l微升的样品，与存在冷气层的常规 投入冷却相比，这些设备能极大提髙冷却速度。就相对于液体的小型样品速度 而言，冷却速度的提髙尤其大，从而不大可能破坏脆弱的生物学样品。可以实
17现冷却速度的提高同时能使样品维持在环境温度和压力下直至它们进入液体 那一刻，从而能最大程度降低蒸发和蒸发冷却。
图5-8所示的本发明实施方式均利用冷液体作为冷却剂，但也可利用冷固 体表面。所述固体可由高导热性的材料，例如铜制成，其可通过与冷液体，例 如液氮接触或利用封闭循环低温冰箱来冷却。对于蛋白质晶体、细胞和组织， 与固体表面的冲击力可能是破坏性的，从冷固体表面移去冷冻的样品也可能很 困难。然而，对于液体样品，例如蛋白质溶液，冷固体表面(例如，在杯中形 成)可进行快速冷却并易于储存和处理。
图9显示用于冷冻液体样品的本发明一实施方式。液体通过输送管50和 分配尖端51流动，优选产生一系列小体积(小于1 nl)液滴52。然后这些液滴 通过闸门34下落(或通过压力、静电力、或分配尖端的向下运动喷射)到冷金属 板或杯53上，从而在其表面产生冻结的液滴54。可将金属或杯旋转和移动以 使液滴相继地落在暴露的金属表面上。在此情形中，可先关闭气流，然后立即 开始液滴分配，从而使得液滴不会被冷气带走。或者，可减小固体表面和隔热 层之间的距离，从而最大程度减小液滴下落的垂直距离，因此减少其被运动气 体偏转的时间和距离。
对于在冷液体中冷却，关键是设定冷表面和其上方气体的相对运动。因此， 不是使气体流过静止的固体表面，而是可使固体表面快速旋转或移动至新位 置，然后立即投入(样品)，从而将冷气留在后面。例如，冷表面可具有薄金属 叶片的形式，该叶片在其平面中旋转或移动。这样，可利用多个薄的叶片冷冻 和储存多份样品或体积较大的某给定样品。
虽然，根据许多优选实施方式及其改变形式公开了本发明，但应该知道可 以从中作出许多其它改变和改进而不脱离随附的权利要求书所限定的本发明 范围。
权利要求
1.一种将小型生物学样品快速冷却至低温的系统，其包括维持于低温的低温表面；将待低温冷却的生物学样品保持在初始位置使所述样品与所述低温表面之间有一定空隙的装置；使得所述生物学样品与所述低温表面接触的装置；和防止所述生物学样品在其接触所述低温表面之前冷却的装置。
2. 如权利要求1所述的系统，其特征在于，使得所述生物学样品接触所 述表面的装置包括垂直移动机构，该机构附连于保持所述生物学样品的所述装 置和所述低温表面之一。
3. 如权利要求1所述的系统，其特征在于，防止所述生物学样品在其接 触所述低温表面之前快速冷却的所述装置包括基本上除去冷气层的机构，所述 冷气层在所述表面和所述生物学样品的所述初始位置之间的空隙中毗邻所述 低温表面形成。
4. 如权利要求3所述的系统，其特征在于，基本上除去冷气层的所述机 构包括沿样品的移动路径喷射的比所述低温表面温度高的干燥气流。(我们是 否可以不指定气体温度？我想这样可更便于提交进一步限定的修改的权利要 求。)
5. 如权利要求3所述的系统，其特征在于，基本上除去冷气层的所述机 构包括流过所述生物学样品在移入低温表面期间所通过的管子的温暖干燥气 流。(不必说其最初盛放于其中)
6. 如权利要求3所述的系统，其特征在于，基本上除去冷气层的所述机 构包括在与所述表面平行的方向沿低温表面喷射温暖千燥气体的机构。
7. 如权利要求3所述的系统，其特征在于，基本上除去冷气层的所述机 构包括位于所述低温表面之上的封闭气体空间，先用环境温度的干燥气体替代 冷气，然后立即使该表面与生物学样品接触；其中生物学样品通过在吹扫该空 间时关闭的闸门进入；并且可先除去气体，再引入新的气体，然后立即使该表面与生物学样品接触。
8. 如权利要求3所述的系统，其特征在于，基本上除去冷气层的所述机 构包括升髙低温表面使之与生物学样品接触，而不是将生物学样品移入低温表 面的机构，其方式使得低温表面上的冷气流走，从而产生低温表面和气体的相 对运动，如权利要求4所述。
9. 如权利要求1所述的系统，其特征在于，防止所述生物学样品在其接 触所述低温表面之前快速冷却的所述机构包括具有整合的辐射屏蔽作用的隔 热材料薄屏蔽件，该屏蔽件用于减少水蒸气的蒸发和凝结及冷冻在低温表面的 表面上，其紧邻低温表面之上放置，至少覆盖其大部分，所述屏蔽件包括能打 开以使生物学样品移动成与低温表面接触的小闸门或孔口。
10. 如权利要求1-9中任一项所述的系统，其特征在于，所述低温表面是 低温冷却的金属表面或放置在容器中的低温冷却液体池的表面。
11. 一种将小型生物学样品快速冷却至低温的方法，该方法包括 提供维持在低温的低温表面；将待低温冷却的生物学样品保持在初始位置使所述生物学样品与所述低 温表面之间有一定空隙使得所述生物学样品与所述低温表面接触，同时防止所述生物学样品在接 触所述低温表面之前随着其向所述低温表面运动而冷却，藉此，所述生物学样品只在一旦样品与所述低温表面接触才快速冷却。
12. 如权利要求11所述的方法，其特征在于，防止所述生物学样品随着 其向所述低温表面运动而快速冷却的步骤包括基本上除去毗邻所述低温表面 形成的冷气层。
13. 如权利要求12所述的方法，其特征在于，通过沿样品的移动路径喷 射比低温表面温度髙的干燥气流，从而基本上除去所述冷气层。
14. 如权利要求12所述的方法，其特征在于，通过使温暖干燥的气流流 过生物学样品移入低温表面期间所通过的管子，从而基本上除去所述冷气层。
15. 如权利要求12所述的方法，其特征在于，通过在与低温表面平行的 方向沿所述表面喷射温暖干燥的气流，从而基本上除去所述冷气层。
16. 如权利要求12所述的方法，其特征在于，在低温表面之上设置封闭气体空间，其中先用环境温度的干燥气体替代冷气，然后立即使该表面与生物学样品接触；其中样品通过在清洗该空间时关闭的闸门进入；以及先除去气体， 再引入新的气体，然后立即使该表面与生物学样品接触，从而基本上除去所述 冷气层。
17. 如权利要求12所述的方法，其特征在于，通过以使得低温表面上的 冷气流走的方式升高低温表面以与生物学样品接触，从而基本上除去所述冷气 层。
18. 如权利要求11所述的方法，其特征在于，防止所述生物学样品随着 其向所述低温表面运动而快速冷却的所述步骤包括紧邻低温表面之上放置具 有整合的辐射屏蔽作用的隔热材料薄屏蔽件，该屏蔽件用于减少水蒸气的蒸发 和凝结及冷冻在低温表面的表面上并至少覆盖其大部分，所述屏蔽件包括随后 能打开的小闸门或孔口 ，所述生物学样品移动通过所述孔口从而与低温表面接 触。
19. 如权利要求11-18中任一项所述的方法，其特征在于，所述低温表面 是低温冷却的金属表面或放置在容器中的低温冷却液体池的表面。
全文摘要
快速冷却小型生物学样品的方法和装置，通过将它们投入低温液体，例如液氮中，或者使它们与低温金属表面接触而实现快速冷却，该方法和装置减少或消除在液体冷冻剂或低温表面之上形成的冷气层，从而在样品进入该液体或接触该表面之时产生从环境(例如室温)温度向冷冻剂温度的剧烈转变。为降低或消除冷气层的影响，例如，可沿投入路径引入温暖的干燥气流。通过除去该冷气层，10微米样品(单细胞和目前用于蛋白质晶体学中最小蛋白质晶体的尺寸)的冷却时间可缩短至约0.001s。
文档编号F25D13/06GK101553701SQ200780020151
公开日2009年10月7日 申请日期2007年3月30日 优先权日2006年3月30日
发明者M·沃肯汀, R·E·瑟恩弗, V·贝雷杰诺夫 申请人:康奈尔研究基金会股份有限公司