专利名称：一株可代谢尼古丁的根癌土壤杆菌及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体的说涉及一株可代谢尼古丁的根癌土壤杆菌及其应用。
背景技术：
尼古丁(nicotine)，是许多烟草中的主要生物碱，含量达0.5～12％。它在人们吸食烟草的行为中扮演着重要的角色，使人们对烟草产生了很强的依赖性。然而，尼古丁同时也是一种“有毒的危险物质”，一次性吸入量达40ml/人时，会抑制中枢神经，导致心脏麻痹，有致命的危险；尼古丁和烟草中的其它生物碱在烟草加工过程中和吸烟瞬间会被亚硝化生成烟草中特有的N-亚硝胺(tobacco-specific nitrosamines，TSNA)，如nitrosamine4-(methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanone(NNK)，它们是强烈的肺癌致癌剂。
烟草加工过程产生了大量的固体废物，这些废物由于其物理性质无法再被使用，其中含有以尼古丁为主的有毒物质，成为一种“危险的有毒废物”。它们由于不易被降解而长期存在于环境中，给人类生存带来了极大威胁。这些废物中的尼古丁平均含量达18g/Kg干重，当尼古丁含量高于500mg/Kg干重时，欧盟法律把它们定为“危险的有毒废物”。1994年，美国环保局已将尼古丁列入有毒物质释放目录(Toxics Release Inventory，TRI)中。更为严重的是尼古丁有很好的水溶性，极易造成地下水的污染。因此迫切需要采取一些措施来有效的处理烟草加工产生的废物等问题。
近几十年，一些微生物由于具有代谢尼古丁的能力而受到人们的广泛关注，一些微生物也相继报道。如美国学者Rittenberg课题组(1959)分离白土壤的一株氧化节杆菌(Arthrobacter oxidans)P-34。Uchida等(1983)考察了包括烟草致病菌在内的11株真菌和6株放线菌降解尼古丁的能力，发现只有丝核薄膜革菌(Pellicularia filamentosa)JTS-208和棘孢小克银汉霉(Cuninghamella echinulata)IFO-4444具有降解尼古丁的能力。袁勇军等(2005)报道从土壤中分离得到一株Ochrobactrum intermedium，该菌株可以尼古丁为唯一碳源生长，在其优化条件下，可将0.5g/L的尼古丁在36h内降解97.6％。Ruan等(2005)报道从烟草废物污染的土壤中分离得到一株假单胞菌(Pseudomonas sp.)HF-1，该菌株可以尼古丁为唯一碳源和氮源生长，在其优化条件下，可将1.3g/L的尼古丁在25h内降解99.6％。虽然这些微生物可代谢尼古丁，但其代谢能力均较弱，对尼古丁毒性的抗性较弱，这些均限制了它们在实际生产中的应用。
发明内容
针对上述现有的可代谢尼古丁微生物的缺点，本发明提供一株具有较强的尼古丁代谢能力和尼古丁毒性抗性的根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)，及以该菌株的完整细胞为生物催化剂生物降解烟草加工产生的固体废物中尼古丁的应用。该方法具有反应时间短，操作简单，安全性好的特点。
本发明涉及的可代谢尼古丁的菌株为根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)wsn1-4。已于2006年11月22日保藏于中国典型培养物保藏中心(武汉大学，中国，武汉)，其保藏编号为CCTCC NO.M206131。
上述Agrobacterium tumefaciens wsn1-4CCTCC NO.M206131的菌落形态和细胞形态特征为，菌落直径0.5-1.0mm，表面光滑，有光泽，边缘半透明，中央乳白色；细胞为长杆状，微弯曲，两端钝圆，长为1.60～1.84μm，直径为0.32～0.41μm(附图1)；革兰氏染色阴性，半固体穿刺为运动性。
上述Agrobacterium tumefaciens wsn1-4CCTCC NO.M206131的生理生化特征详见表1。
表1 Agrobacterium tumefaciens wsn1-4CCTCC NO.M206131的生理生化特征
注+阳性，-阴性。
上述Agrobacterium tumefaciens wsn1-4CCTCC NO.M206131的碳源利用情况详见表2。
表2.Agrobacterium tumefaciens wsn1-4CCTCCNO.M206131的碳源利用情况
注+可利用，-不利用。
上述Agrobacterium tumefaciens wsn1-4CCTCC NO.M206131的16S rDNA序列与已报道的其它根癌土壤杆菌以及土壤杆菌属的其他细菌的16S rDNA序列具有100％的同源性，但不同的是，已报道的其它菌株都不能代谢尼古丁，详见表3。
表3 Agrobacterium tumefaciens wsn1-4 CCTCC NO.M206131的16S rDNA序列比对结果
上述Agrobacterium tumefaciens wsn1-4 CCTCC NO.M206131的16S rDNA序列长度为1371bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
上述Agrobacterium tumefaciens wsn1-4CCTCC NO.M206131能以尼古丁为唯一碳源、氮源和能源生长，生长温度范围为20～37℃，pH范围为6.0～8.0，可代谢尼古丁的浓度可达5g/L(附图2)。
本发明所述的利用一株具有较强的尼古丁代谢能力和尼古丁毒性抗性的根癌土壤杆菌的完整细胞为生物催化剂生物降解烟草加工固体废物中的尼古丁的应用，该应用涉及的方法步骤如下(1)微生物菌株选用根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)wsn1-4CCTCC NO.M206131；(2)斜面培养将上述菌株接种于含有质量体积比为0.02～0.3％的尼古丁的固体斜面培养基上，20℃～37℃条件下，静止培养24～36小时；(3)种子培养将步骤(2)培养的菌株，在无菌条件下用接种环接1～2环于20～100mL含有质量体积比为0.02～0.3％的尼古丁液体培养基中，20℃～37℃条件下，在摇床上振荡培养6～30小时，制得一级种子；(4)扩大培养以5～10％的体积比的接种量，接一级种子于200～1000mL含有质量体积比为0.02～0.3％的尼古丁液体培养基中，20℃～37℃条件下，在摇床上振荡培养6～30小时，制得二级种子；(5)发酵罐培养以5～10％的体积比的接种量，接二级种子于5～20L含有质量体积比为0.1～0.5％的尼古丁液体培养基中，25℃～37℃条件下培养，期间测定细胞浓度，当620nm下的OD值达到1.2～3.9，终止发酵培养；(6)收集细胞取步骤(5)的培养液5,000转/分钟条件下离心10～15分钟，收集发酵培养的细胞，并用20～100mmol/L pH7.0磷酸缓冲液洗涤，再以相同的条件离心，重复2～3次，收集沉淀的细胞，此细胞即为生物催化剂，在4℃储存，备用；(7)烟草加工固体废物中尼古丁的去除将步骤(6)制得的生物催化剂悬浮于20～100mmol/L pH7.0磷酸缓冲液中，混匀，使混合物中的生物催化剂在620nm下的OD值为2～10，再按照烟草加工废物质量与生物催化剂悬液的体积比为1∶8～20的比例，以g/mL计，向生物催化剂悬液中加入烟草加工固体废物，在20℃～40℃、180～350转/分钟条件下振荡；处理期间取样，用气相色谱法检测尼古丁的降解情况，当混合物中尼古丁完全检测不到后，继续振荡1～4小时后终止处理；(8)将步骤(7)终止处理后的混合物，以6,000～12,000转/分10～30分钟离心，去除不含有尼古丁的上清液，得到步骤(7)中所加入的生物催化剂和废物残渣，去除上层的废物残渣，收集下层的生物催化剂；(9)生物催化剂的重复利用将步骤(8)收集得的生物催化剂按照步骤(7)所述的方法重复利用，重复该步骤3～7次，最后弃去离心的沉淀；(10)将步骤(8)和步骤(9)得到的上清液混合，随同一般废水一起进一步处理，步骤(8)得到废物残渣和步骤(9)得到的沉淀则可与一般废物一起处理。
上述步骤(3)、(4)(5)所述的液体培养基的配方是K2HPO4·3H2O 13.3g/L，KH2PO44g/L，MgSO4·7H2O 0.2g/L，酵母粉1.0g/L，金属离子混合液0.5mL/L；调节pH7.0，115℃条件下灭菌20分钟；其中，金属离子混合液的配方是以1mol/L盐酸溶液为溶剂，CaCl2·2H2O 0.05g/L，CuCl2·2H2O 0.05g/L，MnSO4·H2O0.008g/L，FeSO4·7H2O 0.004g/L，ZnSO40.1g/L，Na2MoO4·2H2O 0.1g/L，Na2WO4·2H2O0.05g/L。
上述步骤(2)所述的固体斜面培养基的配方是向所述的液体培养基中优选加入质量体积比为1.5～2.0％的琼脂。
上述步骤(2)、(3)、(4)(5)所述的尼古丁浓度优选0.1～0.3％。
上述步骤(2)、(3)、(4)(5)所述的菌体培养温度优选29～32℃。
上述步骤(2)所述的菌体培养时间优选26～30小时。
上述步骤(3)、(4)所述的菌体培养时间优选12～24小时。
上述步骤(6)所述的磷酸缓冲液的浓度优选50mmol/L。
上述步骤(7)所述的生物催化剂是指根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)wsn1-4CCTCC NO.M206131的完整细胞。
上述步骤(7)所述的磷酸缓冲液优选40～80mmol/L。
上述步骤(7)所述的混合物中的生物催化剂在620nm下的OD值优选5～7。
上述步骤(7)所述的烟草加工废物质量与生物催化剂悬液的体积比优选1∶10～15。
上述步骤(7)所述的转化反应温度优选28℃～32℃。
上述步骤(7)所述的继续振荡的时间优选2～3小时。
上述步骤(7)所述的气相色谱法采用VARIAN CP3380气相色谱仪，色谱柱为SPB-5毛细管柱(内径0.32mm，长30m，膜厚0.25μm，美国Supelcol公司)，氮气作为载气，检测条件为，进样器温度260℃，柱温140℃，检测器温度280℃，进样量1μl。
上述步骤(7)所述的处理期间所取样品需要按照以下方法处理后利用气相色谱法测定尼古丁样品于6,000～12,000转/分10～30分钟离心，取0.2ml上清于一具有密封盖的小瓶中，加入1.8ml蒸馏水，再加入50μl 1M碳酸钠水溶液，用2ml氯仿30℃振荡萃取30min，氯仿相溶液用于气相色谱法测定。
本发明提供的一株可代谢尼古丁的根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)wsn1-4CCTCC NO.M206131，具有较强的尼古丁代谢能力和抗尼古丁毒性的能力，可代谢尼古丁的浓度可达5g/L，较适宜的浓度为1.0～3.0g/L。这解决了目前已报道菌株尼古丁代谢能力和抗毒性低的问题。
本发明提供的利用可代谢尼古丁的根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)wsn1-4CCTCC NO.M206131的完整细胞做生物催化剂，来处理烟草加工固体废物的方法，具有以下特点(1)用根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)wsn1-4CCTCC NO.M206131的完整细胞作为生物催化剂，废物处理速度快，节约时间和能源。
(2)制备生物催化剂采用的菌株所需的培养基简单、成本低。
(3)该菌株的细胞通透性好，不需破碎，可直接用完整细胞降解尼古丁，操作方便。
(4)生物催化剂可以用离心法去除，并且可以回收重复使用3～7次。
(5)处理过程简单，条件温和，易操作，易控制。
(6)废物中的尼古丁可被彻底去除。
因此，本发明提供的一株可代谢尼古丁的根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)wsn1-4CCTCC NO.M206131及其处理烟草加工固体废物的方法具有重要的实际应用价值。
本发明涉及的一株可代谢尼古丁的根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)，名称为根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)wsn1-4，已于2006年11月22日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO.M206131。
图1为本发明的根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)wsn1-4CCTCC NO.M206131细胞放大15000倍的扫描电镜照片。
图2为本发明的根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)wsn1-4CCTCC NO.M206131在含有5g/L尼古丁的液体培养基中生长和降解尼古丁的情况。
其中，符号■表示培养基中尼古丁的浓度(g/L)，符号●表示细菌生长后的细胞干重(g/L)。
图3为利用本发明的根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)wsn1-4CCTCC NO.M206131在620nm下OD值为6的细胞作生物催化剂处理尼古丁含量约为30mg/g干重的烟草加工废物过程中尼古丁的降解情况。
其中，烟草加工废物质量(g)与生物催化剂悬液的体积(mL)比为1∶10。
具体实施例方式
实施例1Agrobacterium tumefaciens wsn1-4CCTCC NO.M206131菌株的筛选从山东潍坊等地的长期种植烟草的大田中采集烟草植株根部土样，取2～4g加入到含有1g/L尼古丁的液体培养基中，30℃条件下在摇床上振荡培养2～4天，然后转接5mL到相同的培养基中培养，照此方法连续转接3～5次，将获得的培养液稀释后涂布到含有1g/L尼古丁的固体平板培养基上，30℃条件下培养1～3天，待长出菌落后，挑取大菌落在同样的尼古丁的固体平板培养基上连续划线，确认该菌株具有降解尼古丁的能力，并且为纯培养，然后挑取单菌落到含有1g/L尼古丁的固体斜面培养基上，30℃条件下培养1～3天，得到本发明的根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)wsn1-4，该菌株己于2006年11月22日保藏于中国典型培养物保藏中心(武汉大学，中国，武汉)，其保藏编号为CCTCC NO.M206131。
上述所述的液体培养基的配方是K2HPO4·3H2O 13.3g/L，KH2PO44g/L，MgSO4·7H2O 0.2g/L，酵母粉1.0g/L，金属离子混合液0.5mL/L；调节pH7.0，115℃条件下灭菌20分钟；其中，金属离子混合液的配方是以1mol/L盐酸溶液为溶剂，CaCl2·2H2O 0.05g/L，CuCl2·2H2O 0.05g/L，MnSO4·H2O0.008g/L，FeSO4·7H2O 0.004g/L，ZnSO40.1g/L，Na2MoO4·2H2O 0.1g/L，Na2WO4·2H2O0.05g/L。
上述所述的固体平板培养基和固体斜面培养基的配方是向所述的液体培养基中加入质量体积比为1.5％的琼脂。
实施例2上述根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)wsn1-4CCTCC NO.M206131菌株16S rDNA的获取收集生长到稳定期的根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)wsn1-4CCTCC NO.M206131的培养物2mL，6,000转/分钟离心5分钟，去上清；沉淀物中加入565μL TE溶液，TE溶液的配方为10mmol/L的三羟甲基氨基甲烷(Tris)、1mmol/L的乙二胺四乙酸(EDTA)、用盐酸调整pH为8.0；用吸管反复吹打使沉淀物悬浮，再加入30μL质量体积比浓度为10％的十二烷基磺酸钠(SDS)和5μL 20mg/mL的蛋白酶K(Merck公司，美国)，混匀，于37℃下水浴1小时；加入100μL 5mol/L的NaCl，充分混匀，再加入80μL的CTAB/NaCl溶液，CTAB/NaCl溶液的配方为将质量体积比浓度为10％的十六烷基三乙基溴化铵(CTAB)溶于0.7mol/L的NaCl溶液中；混匀后于65℃水浴10分钟；加入等体积的氯仿/异戊醇，混匀，12,000转/分钟离心5分钟，将上清转入一支新管中；加入等体积的酚/氯仿/异戊醇，混匀，12,000转/分钟离心5分钟，将上清转入一支新管中；加入0.6倍体积的异丙醇，轻轻混匀直至DNA沉淀，12,000转/分钟离心5分钟，弃上清，用70％乙醇洗涤；12,000转/分钟离心5分钟，弃上清，沉淀于室温下干燥10分钟，加入100μl TE缓冲液重溶，该溶液为根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)wsn1-4CCTCC NO.M206131的基因组DNA溶液。以提取的基因组DNA为模板，利用真细菌通用引物27f和1492r，进行PCR扩增，在50μL的反应体系中依次加入下列试剂38μLH2O，5μL10倍浓度的PCR反应缓冲液，10倍浓度的PCR反应缓冲液配方如下500mmol/L的KCl、30mmol/L的二硫苏糖醇(DTT)、100 mmol/L的用盐酸调整pH为8.8的Tris缓冲液、1mg/mL的牛血清白蛋白，4μl 25mmol/L MgCl2，1μL4种dNTP的混合物，0.5μL上游引物，0.5μL下游引物，0.5μL模板DNA即上述根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)wsn1-4CCTCC NO.M206131的基因组DNA溶液，0.5μLTaq DNA聚合酶，混匀后离心5秒钟，将混合物在94℃加热5分钟。按照94℃变性1分钟，50℃退火1分钟，72℃延伸2分钟的程序反应，总共进行30个循环。最后一个循环后，于72℃下保温10分钟，得到的混合物即为根癌土壤杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)wsn1-4CCTCC NO.M206131的16S rDNA的PCR扩增产物，将产物测序。
测序结果根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)wsn1-4CCTCC NO.M206131的16S rDNA序列长度为1371bp，核苷酸序列如下gcttaacaca tgcaagtcga acgccccgca aggggagtgg cagacgggtg agtaacgcgt60gggaacatac cctttcctgc ggaatagctc cgggaaactg gaattaatac cgcatacgcc 120ctacggggga aagatttatc ggggaaggat tggcccgcgt tggattagct agttggtggg 180gtaaaggcct accaaggcga cgatccatag ctggtctgag aggatgatca gccacattgg 240gactgagaca cggcccaaac tcctacggga ggcagcagtg gggaatattg gacaatgggc 300gcaagcctga tccagccatg ccgcgtgagt gatgaaggcc ttagggttgt aaagctcttt 360caccgatgaa gataatgacg gtagtcggag aagaagcccc ggctaacttc gtgccagcag 420ccgcggtaat acgaaggggg ctagcgttgt tcggaattac tgggcgtaaa gcgcacgtag 480gcggatattt aagtcagggg tgaaatcccg cagctcaact gcggaactgc ctttgatact 540gggtatcttg agtatggaag aggtaagtgg aattccgagt gtagaggtga aattcgtaga 600tattcggagg aacaccagtg gcgaaggcgg cttactggtc cattactgac gctgaggtgc 660gaaagcgtgg ggagcaaaca ggattagata ccctggtagt ccacgccgta aacgatgaat 720gttagccgtc gggcagtata ctgttcggtg gcgcagctaa cgcattaaac attccgcctg 780gggagtacgg tcgcaagatt aaaactcaaa ggaattgacg ggggcccgca caagcggtgg 840agcatgtggt ttaattcgaa gcaacgcgca gaaccttacc agctcttgac attcggggta 900tgggcattgg agacgatgtc cttcagttag gctggcccca gaacaggtgc tgcatggctg 960tcgtcagctc gtgtcgtgag atgttgggtt aagtcccgca acgagcgcaa ccctcgccct 1020tagttgccag catttagttg ggcactctaa ggggactgcc ggtgataagc cgagaggaag 1080gtggggatga cgtcaagtcc tcatggccct tacgggctgg gctacacacg tgctacaatg 1140gtggtgacag tgggcagcga gacagcgatg tcgagctaat ctccaaaagc catctcagtt 1200cggattgcac tctgcaactc gagtgcatga agttggaatc gctagtaatc gcagatcagc 1260atgctgcggt gaatacgttc ccgggccttg tacacaccgc ccgtcacacc atgggagttg 1320gttttacccg aaggtagtgc gctaaccgca aggaggcagc taaccacgta g 1371实施例3利用根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)wsn1-4CCTCC NO.M206131的完整细胞处理烟草加工固体废物的方法，其中烟草加工固体废物质量与生物催化剂悬液的体积以g/mL计比值为1∶8(1)微生物菌株选用根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)wsn1-4CCTCC NO.M206131；(2)斜面培养将上述菌株接种于含有质量体积比为0.02％的尼古丁的固体斜面培养基上，20℃条件下，静止培养28小时；(3)种子培养将步骤(2)培养的菌株，在无菌条件下用接种环接1环于20mL含有质量体积比为0.02％的尼古丁液体培养基中，20℃条件下，在摇床上振荡培养6小时，制得一级种子；(4)扩大培养以5％的体积比的接种量，接一级种子于200mL含有质量体积比为0.02％的尼古丁液体培养基中，20℃条件下，在摇床上振荡培养6小时，制得二级种子；(5)发酵罐培养以5％的体积比的接种量，接二级种子于5L含有质量体积比为0.1％的尼古丁液体培养基中，25℃条件下培养，期间测定细胞浓度，当620nm下的OD值达到1.2，终止发酵培养；(6)收集细胞取步骤(5)的培养液5,000转/分钟条件下离心10分钟，收集发酵培养的细胞，并用20mmol/L pH7.0磷酸缓冲液洗涤，再以相同的条件离心，重复2次，收集沉淀的细胞，此细胞即为生物催化剂，在4℃储存，备用；(7)烟草加工固体废物中尼古丁的去除将步骤(6)制得的生物催化剂悬浮于20mmol/L pH7.0磷酸缓冲液中，混匀，使混合物中的生物催化剂在620nm下的OD值为2，再按照烟草加工废物质量与生物催化剂悬液的体积比为1∶8的比例，以g/mL计，向生物催化剂悬液中加入烟草加工固体废物，在20℃、180转/分钟条件下振荡；处理期间取样，用气相色谱法检测尼古丁的降解情况，当混合物中尼古丁完全检测不到后，继续振荡4小时后终止处理；(8)将步骤(7)终止处理后的混合物，以6,000转/分30分钟离心，去除不含有尼古丁的上清液，得到步骤(7)中所加入的生物催化剂和废物残渣，去除上层的废物残渣，收集下层的生物催化剂；(9)生物催化剂的重复利用将步骤(8)收集得的生物催化剂按照步骤(7)所述的方法重复利用，重复该步骤3次，最后弃去离心的沉淀；(10)将步骤(8)和步骤(9)得到的上清液混合，随同一般废水一起进一步处理，步骤(8)得到废物残渣和步骤(9)得到的沉淀则可与一般废物一起处理。
上述步骤(3)、(4)(5)所述的液体培养基的配方是K2HPO4·3H2O 13.3g/L，KH2PO44g/L，MgSO4·7H2O 0.2g/L，酵母粉1.0g/L，金属离子混合液0.5mL/L；调节pH7.0，115℃条件下灭菌20分钟；其中，金属离子混合液的配方是以1mol/L盐酸溶液为溶剂，CaCl2·2H2O 0.05g/L，CuCl2·2H2O 0.05g/L，MnSO4·H2O0.008g/L，FeSO4·7H2O 0.004g/L，ZnSO40.1g/L，Na2MoO4·2H2O 0.1g/L，Na2WO4·2H2O0.05g/L。
上述步骤(2)所述的固体斜面培养基的配方是向所述的液体培养基中优选加入质量体积比为1.6％的琼脂。
上述步骤(7)所述的气相色谱法采用VARIAN CP3380气相色谱仪，色谱柱为SPB-5毛细管柱(内径0.32mm，长30m，膜厚0.25μm，美国Supelcol公司)，氮气作为载气，检测条件为，进样器温度260℃，柱温140℃，检测器温度280℃，进样量1μl。
上述步骤(7)所述的处理期间所取样品需要按照以下方法处理后利用气相色谱法测定尼古丁样品于8,000转/分20分钟离心，取0.2ml上清于一具有密封盖的小瓶中，加入1.8ml蒸馏水，再加入50μl 1M碳酸钠水溶液，用2ml氯仿30℃振荡萃取30min，氯仿相溶液用于气相色谱法测定。
实施例4利用根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)wsn1-4CCTCC NO.M206131的完整细胞处理烟草加工固体废物的方法，其中烟草加工固体废物质量与生物催化剂悬液的体积以g/mL计比值为1∶15(1)微生物菌株选用根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)wsn1-4CCTCC NO.M206131；(2)斜面培养将上述菌株接种于含有质量体积比为0.1％的尼古丁的固体斜面培养基上，30℃条件下，静止培养24小时；(3)种子培养将步骤(2)培养的菌株，在无菌条件下用接种环接1环于50mL含有质量体积比为0.1％的尼古丁液体培养基中，30℃条件下，在摇床上振荡培养12小时，制得一级种子；(4)扩大培养以8％的体积比的接种量，接一级种子于500mL含有质量体积比为0.2％的尼古丁液体培养基中，30℃条件下，在摇床上振荡培养18小时，制得二级种子；(5)发酵罐培养以8％的体积比的接种量，接二级种子于10L含有质量体积比为0.3％的尼古丁液体培养基中，30℃条件下培养，期间测定细胞浓度，当620nm下的OD值达到2.9，终止发酵培养；(6)收集细胞取步骤(5)的培养液5,000转/分钟条件下离心12分钟，收集发酵培养的细胞，并用50mmol/L pH7.0磷酸缓冲液洗涤，再以相同的条件离心，重复3次，收集沉淀的细胞，此细胞即为生物催化剂，在4℃储存，备用；(7)烟草加工固体废物中尼古丁的去除将步骤(6)制得的生物催化剂悬浮于50mmol/L pH7.0磷酸缓冲液中，混匀，使混合物中的生物催化剂在620nm下的OD值为5，再按照烟草加工废物质量与生物催化剂悬液的体积比为1∶15的比例，以g/mL计，向生物催化剂悬液中加入烟草加工固体废物，在30℃、250转/分钟条件下振荡；处理期间取样，用气相色谱法检测尼古丁的降解情况，当混合物中尼古丁完全检测不到后，继续振荡2小时后终止处理；(8)将步骤(7)终止处理后的混合物，以8000转/分15分钟离心，去除不含有尼古丁的上清液，得到步骤(7)中所加入的生物催化剂和废物残渣，去除上层的废物残渣，收集下层的生物催化剂；(9)生物催化剂的重复利用将步骤(8)收集得的生物催化剂按照步骤(7)所述的方法重复利用，重复该步骤5次，最后弃去离心的沉淀；(10)将步骤(8)和步骤(9)得到的上清液混合，随同一般废水一起进一步处理，步骤(8)得到废物残渣和步骤(9)得到的沉淀则可与一般废物一起处理。
上述步骤(3)、(4)(5)所述的液体培养基的配方是K2HPO4·3H2O 13.3g/L，KH2PO44g/L，MgSO4·7H2O 0.2g/L，酵母粉1.0g/L，金属离子混合液0.5mL/L；调节pH7.0，115℃条件下灭菌20分钟；其中，金属离子混合液的配方是以1mol/L盐酸溶液为溶剂，CaCl2·2H2O 0.05g/L，CuCl2·2H2O 0.05g/L，MnSO4·H2O0.008g/L，FeSO4·7H2O 0.004g/L，ZnSO40.1g/L，Na2MoO4·2H2O 0.1g/L，Na2WO4·2H2O0.05g/L。
上述步骤(2)所述的固体斜面培养基的配方是向所述的液体培养基中优选加入质量体积比为1.8％的琼脂。
上述步骤(7)所述的气相色谱法采用VARIAN CP3380气相色谱仪，色谱柱为SPB-5毛细管柱(内径0.32mm，长30m，膜厚0.25μm，美国Supelcol公司)，氮气作为载气，检测条件为，进样器温度260℃，柱温140℃，检测器温度280℃，进样量1μl。
上述步骤(7)所述的处理期间所取样品需要按照以下方法处理后利用气相色谱法测定尼古丁样品于8,000转/分20分钟离心，取0.2ml上清于一具有密封盖的小瓶中，加入1.8ml蒸馏水，再加入50μl 1M碳酸钠水溶液，用2ml氯仿30℃振荡萃取30min，氯仿相溶液用于气相色谱法测定。
实施例5利用根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)wsn1-4CCTCC NO.M206131的完整细胞处理烟草加工固体废物的方法，其中烟草加工固体废物质量与生物催化剂悬液的体积以g/mL计比值为1∶20(1)微生物菌株选用根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)wsn1-4CCTCC NO.M206131；(2)斜面培养将上述菌株接种于含有质量体积比为0.3％的尼古丁的固体斜面培养基上，37℃条件下，静止培养36小时；(3)种子培养将步骤(2)培养的菌株，在无菌条件下用接种环接2环于100mL含有质量体积比为0.3％的尼古丁液体培养基中，37℃条件下，在摇床上振荡培养30小时，制得一级种子；(4)扩大培养以10％的体积比的接种量，接一级种子于1000mL含有质量体积比为0.3％的尼古丁液体培养基中，37℃条件下，在摇床上振荡培养30小时，制得二级种子；(5)发酵罐培养以10％的体积比的接种量，接二级种子于20L含有质量体积比为0.5％的尼古丁液体培养基中，37℃条件下培养，期间测定细胞浓度，当620nm下的OD值达到3.9，终止发酵培养；(6)收集细胞取步骤(5)的培养液5,000转/分钟条件下离心15分钟，收集发酵培养的细胞，并用100mmol/L pH7.0磷酸缓冲液洗涤，再以相同的条件离心，重复3次，收集沉淀的细胞，此细胞即为生物催化剂，在4℃储存，备用；(7)烟草加工固体废物中尼古丁的去除将步骤(6)制得的生物催化剂悬浮于100mmol/L pH7.0磷酸缓冲液中，混匀，使混合物中的生物催化剂在620nm下的OD值为10，再按照烟草加工废物质量与生物催化剂悬液的体积比为1∶20的比例，以g/mL计，向生物催化剂悬液中加入烟草加工固体废物，在40℃、350转/分钟条件下振荡；处理期间取样，用气相色谱法检测尼古丁的降解情况，当混合物中尼古丁完全检测不到后，继续振荡1小时后终止处理；(8)将步骤(7)终止处理后的混合物，以12,000转/分10分钟离心，去除不含有尼古丁的上清液，得到步骤(7)中所加入的生物催化剂和废物残渣，去除上层的废物残渣，收集下层的生物催化剂；(9)生物催化剂的重复利用将步骤(8)收集得的生物催化剂按照步骤(7)所述的方法重复利用，重复该步骤7次，最后弃去离心的沉淀；(10)将步骤(8)和步骤(9)得到的上清液混合，随同一般废水一起进一步处理，步骤(8)得到废物残渣和步骤(9)得到的沉淀则可与一般废物一起处理。
上述步骤(3)、(4)(5)所述的液体培养基的配方是K2HPO4·3H2O 13.3g/L，KH2PO44g/L，MgSO4·7H2O 0.2g/L，酵母粉1.0g/L，金属离子混合液0.5mL/L；调节pH7.0，115℃条件下灭菌20分钟；其中，金属离子混合液的配方是以1mol/L盐酸溶液为溶剂，CaCl2·2H2O 0.05g/L，CuCl2·2H2O 0.05g/L，MnSO4·H2O0.008g/L，FeSO4·7H2O 0.004g/L，ZnSO40.1g/L，Na2MoO4·2H2O 0.1g/L，Na2WO4·2H2O0.05g/L。
上述步骤(2)所述的固体斜面培养基的配方是向所述的液体培养基中优选加入质量体积比为2.0％的琼脂。
上述步骤(7)所述的气相色谱法采用VARIAN CP3380气相色谱仪，色谱柱为SPB-5毛细管柱(内径0.32mm，长30m，膜厚0.25μm，美国Supelcol公司)，氮气作为载气，检测条件为，进样器温度260℃，柱温140℃，检测器温度280℃，进样量1μl。
上述步骤(7)所述的处理期间所取样品需要按照以下方法处理后利用气相色谱法测定尼古丁样品于8,000转/分20分钟离心，取0.2ml上清于一具有密封盖的小瓶中，加入1.8ml蒸馏水，再加入50μl 1M碳酸钠水溶液，用2ml氯仿30℃振荡萃取30min，氯仿相溶液用于气相色谱法测定。
序列表<110>山东大学<120>一株可代谢尼古丁的根癌土壤杆菌及其应用<141>2007-01-16<160>1<210>1<211>1371<212>DNA<213>根癌土壤杆菌(Agrobacterfum tumefaciens)<221>根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefacfens)CCTCC NO.M206131 16S rDNA<222>(1)...(1371)<400>1gcttaacaca tgcaagtcga acgccccgca aggggagtgg cagacgggtg agtaacgcgt60gggaacatac cctttcctgc ggaatagctc cgggaaactg gaattaatac cgcatacgcc120ctacggggga aagatttatc ggggaaggat tggcccgcgt tggattagct agttggtggg180gtaaaggcct accaaggcga cgatccatag ctggtctgag aggatgatca gccacattgg240gactgagaca cggcccaaac tcctacggga ggcagcagtg gggaatattg gacaatgggc300gcaagcctga tccagccatg ccgcgtgagt gatgaaggcc ttagggttgt aaagctcttt360caccgatgaa gataatgacg gtagtcggag aagaagcccc ggctaacttc gtgccagcag420ccgcggtaat acgaaggggg ctagcgttgt tcggaattac tgggcgtaaa gcgcacgtag480gcggatattt aagtcagggg tgaaatcccg cagctcaact gcggaactgc ctttgatact540gggtatcttg agtatggaag aggtaagtgg aattccgagt gtagaggtga aattcgtaga600tattcggagg aacaccagtg gcgaaggcgg cttactggtc cattactgac gctgaggtgc660gaaagcgtgg ggagcaaaca ggattagata ccctggtagt ccacgccgta aacgatgaat720gttagccgtc gggcagtata ctgttcggtg gcgcagctaa cgcattaaac attccgcctg780gggagtacgg tcgcaagatt aaaactcaaa ggaattgacg ggggcccgca caagcggtgg840agcatgtggt ttaattcgaa gcaacgcgca gaaccttacc agctcttgac attcggggta900tgggcattgg agacgatgtc cttcagttag gctggcccca gaacaggtgc tgcatggctg960tcgtcagctc gtgtcgtgag atgttgggtt aagtcccgca acgagcgcaa ccctcgccct1020tagttgccag catttagttg ggcactctaa ggggactgcc ggtgataagc cgagaggaag1080gtggggatga cgtcaagtcc tcatggccct tacgggctgg gctacacacg tgctacaatg1140gtggtgacag tgggcagcga gacagcgatg tcgagctaat ctccaaaagc catctcagtt1200cggattgcac tctgcaactc gagtgcatga agttggaatc gctagtaatc gcagatcagc1260atgctgcggt gaatacgttc ccgggccttg tacacaccgc ccgtcacacc atgggagttg1320gttttacccg aaggtagtgc gctaaccgca aggaggcagc taaccacgta g 137权利要求
1.一株可代谢尼古丁的根癌土壤杆菌，其特征在于，该菌株名为根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)wsn1-4，已于2006年11月22日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO.M 206131。
2.如权利要求1所述的可代谢尼古丁的根癌土壤杆菌，其特征在于，菌落表面光滑，有光泽，边缘半透明，中央乳白色；细胞为长杆状，微弯曲，两端钝圆，长为1.60～1.84μm，直径为0.32～0.41μm；革兰氏染色阴性；半固体穿刺为运动性；35℃下和2％NaCl下均能生长；不需要有机生长因子；过氧化氢酶阳性；甲基红试验为阴性；V-P试验为阳性；硝酸盐可作为唯一氮源；石蕊牛奶试验产碱；不产吲哚和H2S；该菌的16S rDNA序列长度为1371bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；上述的根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)wsn1-4 CCTCC NO.M 206131能以尼古丁为唯一碳源、氮源和能源生长，生长温度范围为20～37℃，pH范围为6.0～8.0，可代谢浓度高达5g/L的尼古丁。
3.以根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)wsn1-4 CCTCC NO.M 206131的完整细胞为生物催化剂生物降解烟草加工固体废物中尼古丁的应用。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述应用涉及的方法步骤如下(1)微生物菌株选用根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)wsn1-4 CCTCC NO.M 206131；(2)斜面培养将上述菌株接种于含有质量体积比为0.02～0.3％的尼古丁的固体斜面培养基上，20℃～37℃条件下，静止培养24～36小时；(3)种子培养将步骤(2)培养的菌株，在无菌条件下用接种环接1～2环于20～100mL含有质量体积比为0.02～0.3％的尼古丁液体培养基中，20℃～37℃条件下，在摇床上振荡培养6～30小时，制得一级种子；(4)扩大培养以5～10％的体积比的接种量，接一级种子于200～1000mL含有质量体积比为0.02～0.3％的尼古丁液体培养基中，20℃～37℃条件下，在摇床上振荡培养6～30小时，制得二级种子；(5)发酵罐培养以5～10％的体积比的接种量，接二级种子于5～20L含有质量体积比为0.1～0.5％的尼古丁液体培养基中，25℃～37℃条件下培养，期间测定细胞浓度，当620nm下的OD值达到1.2～3.9，终止发酵培养；(6)收集细胞取步骤(5)的培养液5,000转/分钟条件下离心10～15分钟，收集发酵培养的细胞，并用20～100mmol/L pH7.0磷酸缓冲液洗涤，再以相同的条件离心，重复2～3次，收集沉淀的细胞，此细胞即为生物催化剂，在4℃储存，备用；(7)烟草加工固体废物中尼古丁的去除将步骤(6)制得的生物催化剂悬浮于20～100mmol/L pH7.0磷酸缓冲液中，混匀，使混合物中的生物催化剂在620nm下的OD值为2～10，再按照烟草加工废物质量与生物催化剂悬液的体积比为1∶8～20的比例，以g/mL计，向生物催化剂悬液中加入烟草加工固体废物，在20℃～40℃、180～350转/分钟条件下振荡；处理期间取样，用气相色谱法检测尼古丁的降解情况，当混合物中尼古丁完全检测不到后，继续振荡1～4小时后终止处理；(8)将步骤(7)终止处理后的混合物，以6,000～12,000转/分10～30分钟离心，去除不含有尼古丁的上清液，得到步骤(7)中所加入的生物催化剂和废物残渣，去除上层的废物残渣，收集下层的生物催化剂；(9)生物催化剂的重复利用将步骤(8)收集得的生物催化剂按照步骤(7)所述的方法重复利用，重复该步骤3～7次，最后弃去离心的沉淀；(10)将步骤(8)和步骤(9)得到的上清液混合，随同一般废水一起进一步处理，步骤(8)得到废物残渣和步骤(9)得到的沉淀则可与一般废物一起处理。
5.如权利要求4所述的以根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)wsn1-4 CCTCCNO.M 206131的完整细胞为生物催化剂生物降解烟草加工固体废物中尼古丁的应用涉及的方法，其特征在于，步骤(3)、(4)、(5)所述的液体培养基的配方是K2HPO4·3H2O 13.3g/L，KH2PO44g/L，MgSO4·7H2O 0.2g/L，酵母粉1.0g/L，金属离子混合液0.5mL/L；调节pH7.0，115℃条件下灭菌20分钟；其中，金属离子混合液的配方是以1mol/L盐酸溶液为溶剂，CaCl2·2H2O 0.05g/L，CuCl2·2H2O 0.05g/L，MnSO4·H2O0.008g/L，FeSO4·7H2O 0.004g/L，ZnSO40.1g/L，Na2MoO4·2H2O 0.1g/L，Na2WO4·2H2O0.05g/L；步骤(2)所述的固体斜面培养基的配方是向所述的液体培养基中加入质量体积比为1.5～2.0％的琼脂。
6.如权利要求4所述的以根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)wsn1-4 CCTCCNO.M 206131的完整细胞为生物催化剂生物降解烟草加工固体废物中尼古丁的应用涉及的方法，其特征在于，步骤(2)、(3)、(4)、(5)所述的尼古丁的质量体积比浓度为0.1～0.3％。
7.如权利要求4所述的以根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)wsn1-4 CCTCCNO.M 206131的完整细胞为生物催化剂生物降解烟草加工固体废物中尼古丁的应用涉及的方法，其特征在于，步骤(7)所述的磷酸缓冲液浓度为40～80mmol/L。
8.如权利要求4所述的以根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)wsn1-4 CCTCCNO.M 206131的完整细胞为生物催化剂生物降解烟草加工固体废物中尼古丁的应用涉及的方法，其特征在于，步骤(7)所述的混合物中的生物催化剂在620nm下的OD值为5～7。
9.如权利要求4所述的以根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)wsn1-4 CCTCCNO.M 206131的完整细胞为生物催化剂生物降解烟草加工固体废物中尼古丁的应用涉及的方法，其特征在于，步骤(7)所述的烟草加工废物质量与生物催化剂悬液的体积为1∶10～15。
10.如权利要求4所述的以根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)wsn1-4 CCTCCNO.M 206131的完整细胞为生物催化剂生物降解烟草加工固体废物中尼古丁的应用涉及的方法，其特征在于，步骤(7)所述的当混合物中尼古丁完全检测不到后，继续振荡2～3小时后终止处理。
全文摘要
本发明公开了一种可以代谢尼古丁的根癌土壤杆菌，该菌株已于2006年11月22日保藏于中国典型培养物保藏中心(武汉大学，中国武汉)，其保藏编号为CCTCC NO.M206131。该菌株具有较强的尼古丁代谢能力和尼古丁毒性抗性能力，可在高达5g/L尼古丁浓度下生长。通过大量培养该菌株，利用该菌株的完整细胞为生物催化剂，与烟草加工产生的固体废物共同悬浮于磷酸缓冲液中振荡，可将废物中的尼古丁彻底生物降解。本发明的根癌土壤杆菌的应用具有操作简单，过程容易控制，尼古丁降解彻底等特点，在烟草加工废物处理方面具有很大的应用前景。
文档编号C02F3/34GK101016529SQ200710013069
公开日2007年8月15日 申请日期2007年1月22日 优先权日2007年1月22日
发明者王书宁, 许平 申请人:山东大学