用于制备沼气的煎盘梭菌的制作方法

专利名称：用于制备沼气的煎盘梭菌的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种通过使用煎盘梭菌(Clostridium sartagoformum)微生物由生物 质制备沼气的方法。
背景技术：
沼气装置通过有机物质的微生物分解过程制备甲烷。在此，在多级发酵或消化过 程中，通过厌氧(也就是说，排除空气)微生物的活性产生沼气。从化学层面讲，作为发酵基质使用的有机材料具有高分子量组成，所述高分子量 组成在沼气装置的每个方法步骤中通过微生物的代谢活动分解为低分子量组成。截至目 前，还未充分表征对有机发酵基质的发酵过程具有活性的微生物种群。根据现有技术，存在四种不同的先后、并行以及相互交错的生化代谢过程水解、酸 化、乙酸化和产甲烷，这些代谢过程使得有机发酵基质可以分解为终产物甲烷和二氧化碳。在水解过程中，通常单独存在的高分子有机化合物通过发酵细菌的胞外酶(例如 纤维素酶、淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶)转化为可溶的分解产物。由此分解脂肪，例如脂肪酸，， 碳水化合物，例如多糖、低聚糖和单糖，蛋白质、寡肽或氨基酸。此外，产生的气态产物主要 由二氧化碳组成。在酸化过程中，通常与水解细菌相同，兼性和专性厌氧细菌将水解产物(例如单 糖、二糖、二肽、寡肽、氨基酸、甘油、长链脂肪酸)在细胞内代谢为短链脂肪酸或碳酸，例如 丁酸、丙酸和乙酸，代谢为短链醇，例如乙醇，代谢为气态产物氢气和二氧化碳。在随后的乙酸化过程中，在酸化过程中形成的短链脂肪酸和碳酸以及短链醇被产 乙酸菌消化，并且在β-氧化之后作为乙酸再次排出。乙酸化的副产物为CO2和氢气(H2) 分子。在专性厌氧的产甲烷过程中，乙酸化过程的产物例如乙酸以及其他基质例如乙醇 和甲酸酯通过产甲烷的有机体转化为甲烷和co2。此处产生的CO2以及其他工艺步骤(例 如水解)中形成的CO2也可以与积累的H2通过微生物再次转化为甲烷。制备沼气与每个化学转化过程一样，提高定量原料形成的最终产物产量是过程控 制的主要目的。对于由生物质制备沼气而言，即为由一定量的有机发酵基质中形成尽可能 多的甲烷。此外，应该达到尽可能高的发酵罐容积负荷。发酵罐容积负荷指的是引入发酵罐 中的基质量，该量以千克有机干物质每立方米发酵罐容积每天计。产生的沼气量极大地取 决于发酵罐容积负荷，更高的容积负荷产生更多的沼气。高容积负荷使得沼气形成过程更 为经济可行，但是另一方面却增加了生物发酵过程的不稳定性。因此，需要一种制备沼气的方法，所述方法相对于现有技术可以使容积负荷升高。

发明内容
本发明的目的是提供一种制备沼气的方法，其相对于现有技术可以使发酵反应器的容积负荷升高。通过根据权利要求1所述的制备沼气的方法解决本发明的目的。从属权利要求、 说明书和实施例描述了本发明进一步优选的细节、方面和具体实施方案。本发明提供一种在发酵反应器中由生物质制备沼气的方法。向生物质中添加煎盘 梭菌微生物。出人意料的，通过向发酵基质中添加煎盘梭菌微生物不仅能够升高发酵罐容积负 荷，还显著增加了形成的沼气量。正如在实验中所表明的，添加煎盘梭菌微生物使得发酵罐 容积负荷升高超过50%，却不会影响发酵过程的稳定性。在升高容积负荷的同时，形成的沼 气量也增加一倍以上。此外，由于与不添加煎盘梭菌微生物的情况相比，更多的有机干物质 被分解，因此沼气比产量(spezifische Ausbeute)也升高。在使用改良的基质时，通过升 高的分解度可以获得显著升高的气体比产量。此外，在一定的气体产量下，通过添加煎盘梭 菌微生物可以显著缩短发酵基质在发酵罐中的停留时间，由此可以升高容积负荷。因此，使 用煎盘梭菌微生物显著改善了沼气装置的效率和生产率。发酵在本发明中包括通过微生物作用产生沼气的厌氧和微氧代谢过程。术语“发 酵”的解释以关键词“发酵”记载于由Georg Thieme出版社出版的第9版R5mpp化学词典 的第1306页，在此以引用的方式并入本文。通过将产生的沼气量除以有机干物质量计算产生的沼气的比产量。对于沼气制备 是否在给定发酵罐中的给定条件下以满意的质量进行这种问题，不仅仅根据产生的沼气量 判定。当然，产生的沼气量极大地取决于供应的基质量，也取决于以千克有机干物质计的有 机干物质的量。当发酵过程不稳定时，气体比产量下降。根据本发明添加煎盘梭菌微生物 时，容积负荷可以升高至甚至高于通常的数值，由此产生显著增加的气体量。通过升高的分 解程度，可以在更好的基质使用情况下显著升高气体比产量。术语“微生物的种”在本发明中指的是生物分类学的相应的基本分类。按照其DNA 序列鉴定并区分微生物的种。特定的种不仅包括具有完全确定的DNA序列的微生物，还包 括其一定数量的遗传性变型。本领域技术人员公知哪些微生物菌株落入术语“煎盘梭菌” 的范围。现有技术中公知例如从婴儿粪便中分离煎盘梭菌微生物(Stark，P.L. ；Lee, Α.； J. Pediatr. 1982 ； 100(3)，S. 362-365)。煎盘梭菌微生物与通过发酵有机基质制备沼气的结 合并不为人们所知。根据本发明优选的具体实施方案，以微生物培养物的形式添加煎盘梭菌微生物， 所述微生物培养物主要由煎盘梭菌微生物组成。在沼气装置的发酵基质中，煎盘梭菌微生 物可以仅占存在的微生物总量的小于10-4%的痕量。对于添加微生物来说，由于通过其天 然形式(nattolichen Vorkommen)分离的微生物量不够，因此通常以培养物的形式进行增 殖。实践表明，以微生物培养物的形式向发酵罐的发酵基质中添加微生物最为简单直接。可以以培养物悬浮液的形式，以干燥、冻干或潮湿菌体的形式或者以孢子悬浮液、 孢子制剂或干燥、冻干、潮湿的孢子的形式添加煎盘梭菌的培养物。由于上述发酵过程的各种积极效果与煎盘梭菌微生物相关，待添加的培养物中应 该存在超过天然形式的量的该微生物。当然，可以添加任意组成的混合培养物。唯一的要 求是，存在与天然形式相比更多量的煎盘梭菌微生物。确定混合培养物中不同微生物的含量对于本领域技术人员来说不成问题。因此，
6可以例如借助荧光标记的寡核苷酸探针具体确定混合物中煎盘梭菌微生物的含量。正如已 提到的，优选以微生物培养物的形式向发酵基质中添加煎盘梭菌微生物，其中所述微生物 培养物主要由煎盘梭菌微生物组成。如果除了确定了煎盘梭菌微生物的数量之外还确定了 微生物的总量，可以以百分比表示培养物中煎盘梭菌微生物的含量。当煎盘梭菌微生物占 混合培养物中存在的不同微生物的最高百分比时，煎盘梭菌微生物是混合培养物中主要存 在的微生物。根据本发明优选的具体实施方案，煎盘梭菌微生物占添加至发酵基质中的培养物 中存在的微生物总量的至少10_4%。特别优选的，煎盘梭菌微生物占培养物中存在的微生 物总量的至少10_2%，更特别优选的，煎盘梭菌微生物占培养物中存在的微生物总量的至少1%。根据另一优选的具体实施方案，煎盘梭菌微生物占培养物中存在的微生物总量的 至少10%，特别优选的，煎盘梭菌微生物占培养物中存在的微生物总量的至少50%，更特 别优选的，煎盘梭菌微生物占培养物中存在的微生物总量的至少90%。根据特别优选的具体实施方案，添加煎盘梭菌微生物的纯培养物。微生物的纯培 养物包括单个细胞的子代，通过多级过程从不同微生物的混合物中分离出该单个细胞。所 述多级机制以从细胞种群中分离出单个细胞开始，并且要求通过生长和细胞分裂从细胞中 产生的菌落与其他单个细胞或菌落保持分离。通过小心分离菌落、重新悬浮至液体中以及 反复筛选(Ausstreichen)可以获得目标微生物的纯培养物。如果原料中所需有机体的数量占多数，也可以在液体营养介质中进行纯培养物的 分离。通过在营养液中连续稀释悬浮液，使得最终在最后的悬浮步骤中仅剩一个细胞。然 后，该细胞作为纯培养物的基底。术语“纯培养物”的含义以及用于形成纯培养物的可能方 法以关键词“纯培养物”记载在“Allgemeine Mikrobiologie” 中(Hans G. Schlegel，第 7 版，1992，Georg Thieme出版社出版，第205页)，在此以引用的方式并入本文。此外，由此获得的纯培养物的生化特征在于特定的代谢过程和代谢活性，以及特 定的生长条件。由于特定的代谢过程和代谢活性，添加发酵微生物的纯培养物特别有助于 更好地控制整个沼气形成过程。根据本发明另一优选的具体实施方案，添加煎盘梭菌微生物作为至少一种固定 化微生物培养物的组成部分。对于添加微生物来说，由于通过其天然形式(nattolichen Vorkommen)分离的微生物量不够，因此通常以培养物的形式进行增殖。实践表明，以固定化 微生物培养物的形式向发酵罐的发酵基质中添加微生物最为简单直接。由于上述发酵过程的各种积极效果与煎盘梭菌微生物相关，待添加的固定培养物 中应该存在超过天然形式的量的该微生物。当然，可以添加任意组成的固定化混合培养物。 唯一的要求是，存在与天然形式相比更多量的煎盘梭菌微生物。根据本发明优选的具体实施方案，煎盘梭菌微生物占添加至发酵基质的固定化培 养物中存在的微生物总量的至少10_4%。特别优选的，煎盘梭菌微生物占固定化培养物中 存在的微生物总量的至少10_2%，特别优选的，煎盘梭菌微生物占固定化培养物中存在的微 生物总量的至少1%。根据另一优选的具体实施方案，煎盘梭菌微生物占固定化培养物中存在的微生物 总量的至少10%。特别优选的，煎盘梭菌微生物占固定化培养物中存在的微生物总量的至少50%，特别优选的，煎盘梭菌微生物占固定化培养物中存在的微生物总量的至少90%。根据特别优选的具体实施方案，至少添加煎盘梭菌微生物的固定化纯培养物。煎盘梭菌微生物固定其上的载体材料可以使用天然或合成聚合物。优选使用形成 凝胶的聚合物。其优点在于，细菌可被容纳或储存在凝胶结构中。优选使用缓慢溶于水或 缓慢分解的材料，使得煎盘梭菌微生物的释放在较长时间段内进行。合适的聚合物的例子为聚苯胺(Polyanillin)、聚吡咯、聚乙烯吡咯烷酮、聚苯乙 烯、聚氯乙烯、聚乙烯醇、聚乙烯、聚丙烯、环氧树脂、聚乙烯亚胺、多糖例如琼脂糖、藻酸盐 或纤维素、乙基纤维素、甲基纤维素、羧甲基乙基纤维素、乙酸纤维素、碱性-纤维素硫酸 酯、聚苯乙烯和马来酐的共聚物、苯乙烯和甲基丙烯酸甲酯的共聚物、聚苯乙烯磺酸酯、聚 丙烯酸酯和聚丙烯酸甲酯、聚碳酸酯、聚酯、硅氧烷、纤维素邻苯二甲酸酯、蛋白质例如明 胶、阿拉伯树胶、白蛋白或纤维蛋白原、明胶和水玻璃的混合物、明胶和多聚磷酸酯的混合 物、明胶和马来酐与甲基乙烯基醚的共聚物的混合物、醋酸丁酸纤维素、壳聚糖、聚二烷基 二甲基氯化铵(Polydialkyldimethylammonium-chlorid)、聚丙烯酸和聚二烷基二甲基氯 化铵的混合物，以及上述物质的混合物。通常也可以使用交联剂例如戊二醛、脲甲醛树脂或 单宁酸化合物使所述聚合物材料交联。藻酸盐作为固定剂(Immobilisate)特别有利，因为一方面其对煎盘梭菌微生物 的活性仅产生很小的负面影响，另一方面其可被微生物缓慢分解。通过藻酸盐固定剂的缓 慢分解可以逐渐释放被包覆的煎盘梭菌微生物。对于固定化来说，将微生物与聚合物凝胶混合，然后在合适的硬化剂溶液中硬化。 为此，首先使其与凝胶溶液混合，然后以合适高度将其滴入硬化剂溶液中。用于固定化的确 切操作步骤对于本领域技术人员来说是公知的。根据另一具体实施方案，在添加煎盘梭菌微生物的同时，可在发酵反应器中加入 额外的生物质。在此，“同时”指的是在添加微生物和随后添加新的基质之间所经历的时间 段。该时间段应保持尽可能的短，因此术语“同时”也包括并行添加煎盘梭菌微生物和新的基质。所述时间段也可以延伸至数个小时直至一天或数天。在此，可以通过连续添加新 的基质从而连续升高发酵反应器容积负荷，或使容积负荷基本保持恒定，其中可以在任何 容积负荷下，优选在>0.5千克有机干物质每立方米每天[kg oTS/m3d]的容积负荷下，更 优选在彡4. 0kgoTS/m3d的容积负荷下，特别优选在彡8. Okg oTS/m3d的容积负荷下进行发 酵，其与现有技术相比容积负荷升高至两倍以上。因此，根据另一优选的具体实施方案，通过连续添加生物质从而连续升高发酵反 应器容积负荷。特别优选的，在彡0.5kg (^5/!113(1，特别优选彡4.01^ oTS/m3d，非常特别优 选彡8. Okg oTS/m3d的容积负荷下由生物质制备沼气。所使用的发酵基质也可以特别地具有高含量的固体组成部分。通过添加具有水解 活性的煎盘梭菌发酵微生物至少部分地液化该固体组成部分。由于添加煎盘梭菌微生物而 达到的发酵基质的液化可以防止并针对性地抵抗发酵罐材料的稠化。可以避免在发酵过程 中以水或厩液的形式向发酵基质中添加其他液体。因此，另一优点是保护淡水资源。由此 获得可搅拌和可泵送的基质也是有利的。因此保护了搅拌器和泵，并且搅拌过程所需能量 显著减少。
根据另一具体实施方案，在不断搅拌发酵基质的情况下由生物质制备沼气。通过 不断搅拌发酵基质可以使煎盘梭菌的培养物更好地分散在发酵基质中。此外，形成的沼气 可以更好地从发酵过程中导出。此外，不断搅拌发酵基质可使发酵反应器中的热量均勻分布。发酵反应器中的温 度测量值(定期循环且连续进行)表明，发酵基质在20°C至80°C，优选约40°C至50°C的温 度下有效发酵。因此，本发明优选这些温度范围。除了水解之外，发酵过程的最后步骤，即 通过产甲烷微生物形成甲烷的步骤，在高温下特别高效。因此，优选在20°C至80°C，特别优选40至50°C的温度下由生物质制备沼气。本发明所有的具体实施方案显然并不局限于制备沼气的一级方法。使用煎盘梭菌 微生物也可以以二级或多级方法进行。根据另一具体实施方案，连续添加发酵基质和煎盘梭菌微生物。在稳定的微生物 群落的情况下，连续操作发酵反应器可连续形成沼气，由于会扰乱发酵过程，因此应避免突 然停止添加用于发酵的基质。同样地，所述发酵方法和连续过程的具体实施方案也可以间歇进行，例如“分批” 发酵。因此，根据另一具体实施方案，在发酵过程中，可以例如定期向发酵基质中添加煎盘 梭菌微生物。定期添加煎盘梭菌微生物使活细胞数量增加，并且因此使发酵过程(例如水 解)更好地进行，同时更好地利用了用于发酵的发酵基质。根据本发明优选的具体实施方案，将一定量的煎盘梭菌微生物添加至发酵基质 中，使得在添加之后，煎盘梭菌微生物的含量占发酵基质中存在的微生物总量的10_8%至 50%。特别地，取决于发酵罐尺寸以及发酵基质量，为了获得所需的效果，可以添加量非常 不同的微生物。确定发酵基质中微生物的总量和确定发酵基质中不同微生物的含量对于本领域 技术人员来说不成问题。因此，可以例如借助荧光标记的寡核苷酸探针具体确定发酵基质 中不同微生物的含量。特别优选的，将一定量的煎盘梭菌微生物添加至发酵基质中，使得在添加之后，煎 盘梭菌微生物占发酵基质中存在的微生物总量的10_6%至25%。特别优选的，将一定量的 煎盘梭菌微生物添加至发酵基质中，使得在添加之后，煎盘梭菌微生物占发酵基质中存在 的微生物总量的10-4%至10%。非常特别优选的，将一定量的煎盘梭菌微生物添加至发 酵基质中，使得在添加之后，煎盘梭菌微生物占发酵基质中存在的微生物总量的10_3%至 1%。应进一步注意，可以在发酵过程的每个任意时间点添加煎盘梭菌微生物，特别地， 在发酵罐首次运转或再次运转时，也可以使用煎盘梭菌微生物接种发酵基质。在发酵过程波动时，也可以添加煎盘梭菌微生物来稳定发酵。可以通过监测发酵 过程的特定表征参数早期检测到所述波动。特征参数提供了关于制备沼气的发酵过程的质 量信息。这些表征参数不仅有形成的沼气量，还有形成的沼气的甲烷含量，以及例如形成的 沼气的氢气含量，发酵基质的PH值，发酵基质的氧化还原电位，发酵基质的碳酸含量，发酵 基质中不同的碳酸的含量，发酵基质的氢气含量，发酵基质的干物质含量，发酵基质的有机 干物质的含量，发酵基质的粘度以及发酵反应器容积负荷。本发明还包括煎盘梭菌微生物在由生物质发酵制备沼气中的用途。
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本发明还包括煎盘梭菌微生物的菌株SBG1，其保藏号为NO.DSM19861。根据布达 佩斯条约，所述煎盘梭菌微生物SBGl以纯培养物的形式保藏在不伦瑞克市的德国微生物 菌种保藏中心。其名称为煎盘梭菌SBG1，保藏号为DSM 19861。可以借助本领域技术人员公知的方法从发酵罐的发酵基质中分离出煎盘梭菌细 菌。为此，将来自发酵罐的合适基质引入筛选培养基中，经过长时间的培养并最终从筛选培 养基中分离出微生物的单菌落。在借助PCR扩增所获得的微生物的DNA之后，可以基于16S rRNA筛选出煎盘梭菌微生物。从第二发酵罐的发酵基质中分离出煎盘梭菌细菌SBGl。为此，使氮气和二氧化碳 通过液体筛选培养基，然后向筛选培养基中添加Na2S并高压灭菌(20分钟，121°C )。然后 将从第二发酵罐获得的生物质引入筛选培养基中，并在至少30°C的温度下培养至少一周。 将从液体筛选培养基获得的样本涂覆于固体筛选培养基上，然后筛选在固体筛选培养基上 生长的微生物群落。在借助PCR扩增所获得的微生物DNA之后，可以与已知的DNA序列进 行比较。从第二发酵罐的发酵基质中成功分离出煎盘梭菌细菌SBGl之后，对该微生物进 行序列分析。16S rRNA序列SEQ ID No. 1包括948个核苷酸。作为下一子代，鉴定出具有 基因序列SEQ ID No. 2的非培养细菌克隆aaa62b07。所述序列的比对表明，总共有9个核 苷酸或空位被取代。借助于FASTA算法，使用煎盘梭菌SBGl的948个核苷酸的序列长度计 算出99. 2%的同一性。本发明还包括含有核酸的微生物，所述核酸具有核苷酸序列，该核苷酸序列包括 一个序列区，该序列区与核苷酸序列SEQ ID No. 1的序列同一性大于99.2%。特别优选 的，该核苷酸序列包含一个序列区，该序列区与核苷酸序列SEQ ID No. 1的序列同一性大于 99.4%，特别优选的，该核苷酸序列包含一个序列区，该序列区与核苷酸序列SEQ IDNo. 1的 序列同一性大于99.6%。根据另一优选的具体实施方案，该微生物具有核苷酸序列，该核苷酸序列具有一 个序列区，该序列区与核苷酸序列SEQ ID No. 1的序列同一性大于99.8%，且特别优选的， 该核苷酸序列包含一个序列区，该序列区与核苷酸序列SEQ ID No. 1的序列同一性大于 99. 9%。根据特别优选的具体实施方案，该核苷酸序列包含一个序列区，该序列区与核苷 酸序列SEQ ID No. 1完全相同。本发明还包括所有如下的含有核酸的微生物，其核苷酸序列具有至少一个序列 区，该序列区与核苷酸序列SEQ ID No. 1相比仅在一个位点上具有核苷酸取代。本发明还 包括所有如下的微生物，其DNA序列具有至少一个序列区，该序列区与核苷酸序列SEQ ID No. 1相比，仅在两个位点上具有核苷酸取代。此外，本发明还包括所有如下的微生物，其 DNA序列包含至少一个序列区，该序列区与核苷酸序列SEQID No. 1相比，仅在三个位点上 具有核苷酸取代。此外，本发明还包括所有如下的微生物，其DNA序列具有至少一个序列区，该序列 区与核苷酸序列SEQ ID No. 1相比，仅在四个位点上具有核苷酸取代。本发明还包括所有如 下的微生物，其DNA序列具有至少一个序列区，该序列区与核苷酸序列SEQ ID No. 1相比， 在五个位点上具有核苷酸取代。此外，本发明还包括所有如下的微生物，其DNA序列包含至少一个序列区，该序列区与核苷酸序列SEQ ID No. 1相比，在六个位点上具有核苷酸取代。此外，本发明还包括所有如下的微生物，其DNA序列具有至少一个序列区，该序列 区与核苷酸序列SEQ ID No. 1相比，在七个位点上具有核苷酸取代。本发明还包括所有如 下的微生物，其DNA序列具有至少一个序列区，该序列区与核苷酸序列SEQ ID No. 1相比， 在八个位点上具有核苷酸取代。应理解，核苷酸的取代可以存在于DNA序列的任何位点上。特别地，取代可以存在 于任意相互分离的位点上。如果与核苷酸序列SEQ IDNo. 1相比，例如取代了六个核苷酸， 所述六个取代的核苷酸可以相邻。在这种情况下，核苷酸序列SEQ ID No. 1的六个核苷酸 长的片段被改变。所述六个取代的核苷酸也可以例如各自相互间隔100个核苷酸。取代可 以以随意的组合存在。所述取代也可以以空位的形式存在。本发明还包括所有如下的含有核酸的微生 物，其核苷酸序列具有至少一个序列区，该序列区与核苷酸序列SEQ ID No. 1相比仅在一个 位点上缺失核苷酸。本发明还包括所有如下的微生物，其DNA序列具有至少一个序列区，该 序列区与核苷酸序列SEQ ID No. 1相比，仅在两个位点上缺失核苷酸。此外，本发明还包括 所有如下的微生物，其DNA序列具有至少一个序列区，该序列区与核苷酸序列SEQ ID No. 1 相比，仅在三个位点上缺失核苷酸。此外，本发明还包括所有如下的微生物，其DNA序列具有至少一个序列区，该序列 区与核苷酸序列SEQ ID No. 1相比，在四个位点上缺失核苷酸。本发明还包括所有如下的 微生物，其DNA序列具有至少一个序列区，该序列区与核苷酸序列SEQ ID No. 1相比，在五 个位点上缺失核苷酸。此外，本发明还包括所有如下的微生物，其DNA序列具有至少一个序 列区，该序列区与核苷酸序列SEQ ID No. 1相比，在六个位点上缺失核苷酸。此外，本发明还包括所有如下的微生物，其DNA序列具有至少一个序列区，该序列 区与核苷酸序列SEQ ID No. 1相比，在七个位点上缺失核苷酸。本发明还包括所有如下的 微生物，其DNA序列具有至少一个序列区，该序列区与核苷酸序列SEQ ID No. 1相比，在八 个位点上缺失核苷酸。应理解，核苷酸可以在DNA序列的任意位点缺失。特别地，空位可以存在于任意相 互分离的位点上。如果与核苷酸序列SEQ ID No. 1相比，例如缺失了六个核苷酸，所述六个 缺失的核苷酸可以在核苷酸序列SEQ ID No. 1中相邻。在这种情况下，核苷酸序列SEQ ID No. 1的六个核苷酸长的片段缺失。所述六个缺失的核苷酸在核苷酸序列SEQ ID No. 1中也 可以例如各自相互间隔100个核苷酸。缺失可以以随意的组合存在。本发明还包括适用于由生物质发酵制备沼气的方法的微生物培养物，其中在该微 生物培养物中存在以保藏号No. DSM 19861保藏的煎盘梭菌微生物SBG1，其中所述微生物 占培养物中存在的微生物总量的至少10_4%。本发明还包括适用于由生物质发酵制备沼气的方法的微生物培养物，其中在该微 生物的培养物中存在含有核苷酸序列的微生物，所述核苷酸序列包含一个序列区，该序列 区与核苷酸序列SEQ ID No. 1的序列同一性至少为99. 2%，其中所述微生物占培养物中存 在的微生物总量的至少10_4%。优选的，适用于由生物质发酵制备沼气的方法的微生物培养物中存在含有核苷酸 序列的微生物，该核苷酸序列包含一个序列区，该序列区与核苷酸序列SEQ ID No. 1的序列
11同一性大于99. 4%。特别优选的，该核苷酸序列包含一个序列区，该序列区与核苷酸序列 SEQ ID No. 1的序列同一性大于99. 6%。根据另一优选的具体实施方案，适用于由生物质发酵制备沼气的方法的微生物培 养物中存在含有核苷酸序列的微生物，该核苷酸序列包含一个序列区，该序列区与核苷酸 序列SEQ ID No. 1的序列同一性大于99.8%。特别优选的，该核苷酸序列包含一个序列区， 该序列区与核苷酸序列SEQ ID No. 1的序列同一性大于99. 9%。根据特别优选的具体方案，适用于由生物质发酵制备沼气的方法的微生物培养物 中存在含有核苷酸序列的微生物，该核苷酸序列包含一个序列区，该序列区与核苷酸序列 SEQ ID No. 1完全相同。根据另一优选的具体实施方案，煎盘梭菌微生物占培养物中存在的微生物总量的 至少10-2%，优选至少1%。特别优选的，煎盘梭菌微生物占培养物中存在的微生物总量的 至少10%，特别优选至少25%。特别优选的，煎盘梭菌微生物占培养物中存在的微生物总量的至少50%，特别是 至少75%。也优选如下的技术方案，其中煎盘梭菌微生物占培养物中存在的微生物总量的至 少90%。特别优选的，其是适用于由生物质发酵制备沼气的方法的微生物的纯培养物，其中 其是煎盘梭菌微生物SBGl的纯培养物，所述煎盘梭菌微生物SBGl以保藏号No. DSM 19861 进行保藏或特征在于上述核苷酸序列。特别优选的，在上述情况下，培养物是固定化微生物培养物。本发明还包括适用于由生物质发酵制备沼气的方法的固定化微生物培养物，其中 在所述固定化微生物培养物中存在以保藏号No. DSM19861保藏的煎盘梭菌微生物。本发明还包括适用于由生物质发酵制备沼气的方法的固定化微生物培养物，其中 在所述固定化微生物培养物中存在含有核苷序列的微生物，该核苷酸序列包含一个序列 区，该序列区与核苷酸序列SEQ IDNo. 1的序列同一性至少为99. 2%。优选的，适用于由生物质发酵制备沼气的方法的固定化微生物培养物中存在含有 核苷酸序列的微生物，该核苷酸序列包含一个序列区，该序列区与核苷酸序列SEQ ID No. 1 的序列同一性大于99. 4%。特别优选的，该核苷酸序列包含一个序列区，该序列区与核苷酸 序列SEQ IDNo. 1的序列同一性大于99. 6%。根据另一优选的具体实施方案，适用于由生物质发酵制备沼气的方法的固定化微 生物培养物中存在含有核苷酸序列的微生物，该核苷酸序列包含一个序列区，该序列区与 核苷酸序列SEQ ID No. 1的序列同一性大于99.8%。特别优选的，该核苷酸序列包含一个 序列区，该序列区与核苷酸序列SEQ ID No. 1的序列同一性大于99. 9%。根据特别优选的具体实施方案，适用于由生物质发酵制备沼气的方法的固定化微 生物培养物中存在含有核苷酸序列的微生物，该核苷酸序列包含一个序列区，该序列区与 核苷酸序列SEQ ID No. 1完全相同。


为了解释本发明以及说明其益处，下文中提供具体实施方案。通过图1至6详细解释该具体实施方案。应理解，本发明不应局限于具体实施方案所提供的信息。附图表示图1 发酵过程的测量结果以沼气产量，沼气产量的6天平均值，理论气体产量以 及发酵罐容积负荷相对于时间绘图；图2 根据图1的发酵过程的测量结果以乙酸浓度，丙酸浓度，乙酸当量和PH值 相对于时间绘图；图3 根据图1的发酵过程的测量结果以发酵罐容积负荷，发酵基质中干物质的 百分比含量和有机干物质的百分比含量相对于时间绘图；图4 添加煎盘梭菌SBGl以及与根据图1至3的发酵过程相同条件下的发酵过程 的测量结果以沼气产量，沼气产量的6天平均值，理论气体产量以及发酵罐容积负荷相对 于时间绘图；图5 根据图4的发酵过程的测量结果以乙酸浓度，丙酸浓度，乙酸当量和PH值 相对于时间绘图；图6 根据图4的发酵过程的测量结果以发酵罐容积负荷，发酵基质中干物质的 百分比含量以及有机干物质的百分比含量相对于时间绘图。
具体实施例方式对比实施例图1显示了在容积为150升的试验发酵罐中和实际装置条件下的发酵过程中不同 表征参数的测量结果。使用附图标记10标明的曲线显示了以千克有机干物质每立方米每 天(kg oTS/m3d)计的发酵罐容积负荷的时间曲线，使用附图标记20标明的曲线为以标准 升(273. 15K和1013mbar下的气体体积)每天(Nl/d)计的总沼气产量的时间曲线。附图 标记30标明了以[Nl/d]计的总沼气产量的6天平均值的时间曲线，通过附图标记40标明 了以[Nl/d]计的理论气体产量的时间曲线。农业技术与建筑委员会(KTBL)和联邦农业研究中心公布了参考数据，该参考数 据代表在稳定的发酵过程中，根据所使用的基质而预计的沼气量。因此，该理论参考数据可 以反映理论沼气产量。或者，也可以使用其他国家的其他研究所公布的参考数据。通过所 述参考数据计算以[Nl/d]计的理论气体产量的时间曲线40。图1表明，在前35天发生连续且稳定的发酵过程，其特征在于容积负荷升高至约 6.5kg oTS/m3d，且随着容积负荷升高沼气形成也连续增多。从第36天开始观察到沼气产 量与理论气体产量的偏离。由于图2所示的发酵基质中不受控制的高的酸浓度，从第38天 开始通过停止增加基质供应使得容积负荷基本保持恒定。然而，由于酸浓度继续保持不受 控制，在第67天和第76天不供应基质并且从第78天开始完全停止基质供应。这表明，可 以达到5. 5kg oTS/msd的最大容积负荷。在更高的容积负荷下，由于发酵过程崩溃，因此不 可能进行稳定操作。图2显示了根据图1解释的发酵过程中特定羧酸的浓度随时间的变化。其显示了 PH值的时间曲线(用60标明的曲线)、用于测定挥发性脂肪酸的乙酸当量的时间曲线(用 70标明的曲线)和丙酸浓度的时间曲线(用90标明的曲线)。在此，酸浓度以毫克每升发 酵基质(mg/1)计。通过用磷酸酸化的发酵基质样本的蒸汽蒸馏来测定挥发性脂肪酸，作为发酵基质中的总参数。然后使用氢氧化钠对酚酞滴定蒸馏液。或者，为了区别各种羧酸，也可以使用 气相色谱法测定。结果表明，在试验的前35天内，pH值几乎稳定保持在pH 7.5。由于如图1所示的 从第36天开始不受控制的高的酸浓度，首先不继续增加基质供应，并且在第67天，第76天 或从78天开始完全停止基质供应。随着不受控制的高的酸浓度，pH值轻微下降至弱酸性， 导致开始出现不稳定的发酵过程。pH值开始稳定然后进入中性直至弱酸性，而此时酸浓度 降低至零左右。通过不再供应基质促进了发酵基质中的酸的微生物分解，从而解释了该PH 值升高的现象。图3显示了根据图1和2解释的发酵过程中发酵罐内容物的干物质含量随容积负 荷的变化。其显示了以[kg oTS/m3d]计的容积负荷的时间曲线(用附图标记10标明的曲 线)，干物质百分比含量的时间曲线(用附图标记IlOA标明的曲线)和有机干物质百分比 含量的时间曲线(用附图标记IlOB标明的曲线)。干物质百分比含量指明了有机或无机物 质(例如沙子)的总质量。根据图3可知，随着图2所示的第36天时酸浓度的升高，干物质百分比含量和有 机干物质百分比含量升高。尽管在第38天时使容积负荷(其在第38天至第67天之间几 乎恒定保持在5. 5至6. Okg oTS/m3d)降低，有机干物质IlOB仍然增加，其不再能够被充分 发酵。从第78天开始通过停止基质供应才使得生物发酵过程恢复，因此有机干物质被再次 发酵，这显然导致干物质含量IlOB的降低。煎盘梭菌SBGl从第二发酵罐的发酵基质中成功分离出煎盘梭菌细菌SBG1。根据布达佩斯条约， 在德国微生物菌种保藏中心以纯培养物的形式保藏该有机体(煎盘梭菌SBG1，保藏号DSM 19861)。通过筛选培养基分离该微生物，该筛选培养基以羧甲基纤维素作为唯一的碳源。 羧甲基纤维素与在沼气装置的发酵基质中获得的纤维素非常相似，并且通过羟基和羧甲基 (-CH2-COOH-)的连接在水介质中具有改善的溶解性。为筛选煎盘梭菌SBGl而使用的介质 用N2和CO2充气，以便在厌氧条件下进行筛选。然后借助0. 5克/升的Na2S还原所包含的 剩余氧气。然后，用来自第二发酵罐的材料的上清液接种筛选培养基。在40°C下培养一周之 后，通过显微镜分析显示出单个的杆菌(Stabchen) c通过在厌氧羧甲基纤维素板上涂片从 而进行液体培养及进一步的筛选。利用菌落PCR方法，根据标准程序，使用长出的菌落的细 胞材料来扩增微生物DNA。在菌落的序列分析之后，利用数据库www, ncbi. nlm. nih. rov的 BLAST程序(基本局部比对搜索工具)生成的序列数据的种系对比证明，获得的序列可以归 入煎盘梭菌微生物的下一子代。使用具有水解活性的发酵微生物煎盘梭菌SBG 1的纯培养物的研究表明，将其添 加至包含羧甲基纤维素的极粘稠粘性筛选培养基导致培养基的逐步液化。实施例图4显示了在图1至3所描述的装置条件下，在试验装置中的发酵过程中不同 表征参数的测量结果。使用附图标记10标明的曲线表示以千克有机干物质每立方米每 天(kg oTS/m3d)计的发酵罐容积负荷的时间曲线，用附图标记20标明的曲线为以标准升(273. 15K和1013mbar下的气体体积)每天(Nl/d)计的总沼气产量的时间曲线。附图标 记30标明了以[Nl/d]计的总沼气产量的6天平均值的时间曲线，通过附图标记40表示以 [Nl/d]计的理论气体产量的时间曲线。不同于图1至3所描述的发酵过程，在下文通过图4至6讨论的根据本发明的发 酵过程中，向发酵基质中添加煎盘梭菌微生物。通过X轴上使用附图标记50标明的三角形 表示添加煎盘梭菌SBGl的时间点。在所述的具体实施方案中使用煎盘梭菌的纯培养物。也可以使用含有煎盘梭菌成 分的混合培养物。从第215天开始，容积负荷从约4. 25kg oTS/m3d连续升高至第314天的约8. 5kg oTS/m3d。在该时间段内，多次向发酵基质中添加煎盘梭菌SBGl的纯培养物。第266天容 积负荷暴跌是由于技术问题，当天在沼气装置中暂停基质供应。在第235天首次使用煎盘梭菌SBGl的培养物。在首次添加微生物的时间点，以 约4. 5千克有机干物质每立方米每天的容积负荷操作发酵罐。为此，使用来自在约40°C温 度下培养5天的1升煎盘梭菌SBGl的预培养物的细胞团。该预培养物的细胞浓度为2. Ox IO8个细胞/毫升，且活细胞含量为90%以上。首先以1升的规模每周添加两次，从第227 天开始添加量增倍，即每周添加两次来自2升煎盘梭菌SBGl的预培养物的细胞团。从第293天开始，每周添加三次来自2升煎盘梭菌SBGl的预培养物的细胞团。此 外，预培养物的培养时间延长至至少7天，由此将细胞浓度升高至平均Ix IO9个细胞/毫 升。通过添加煎盘梭菌SBGl的纯培养物，容积负荷可以在继续的试验过程中升高至第314 天所达到的约8. 5kg oTS/m3d的最大值。在容积负荷升高的同时，可以观察到沼气产量的升高。此时观察到与以标准升/ 天[Nl/d]计的理论气体产量一致的以标准升/天[Nl/d]计的沼气产量，其中沼气产量从 第288天开始几乎恒定地保持高于理论预期的沼气产量。其原因在于从第277天开始更多 地添加煎盘梭菌SBGl纯培养物。在第290天和308天之后，观察到气体产量短暂地显著高于理论值，然后再次靠近 理论曲线。所述沼气产量的升高与添加的微生物量的相应升高有关。这说明在适应期(其 间必须建立微生物的基础浓度)之后，细胞数量的升高导致水解加速。图5显示了在图4所述的发酵过程中特定羧酸的浓度随时间的变化。其显示了 pH 值的时间曲线(用附图标记60表明的曲线)，用于测定挥发性脂肪酸的以[mg/1]计的乙酸 当量的时间曲线(用附图标记70标明)，以[mg/1]计的乙酸浓度的时间曲线(用附图标记 80标明的曲线)和以[mg/1]计的丙酸浓度的时间曲线(用附图标记90标明的曲线。)图5表明，发酵过程中pH值保持恒定，且为pH7至8的中性至弱碱性。发酵过程 一开始就能看到乙酸当量浓度、乙酸浓度和丙酸浓度的显著降低。总之，脂肪酸含量长期保 持低水平并且不能观测到丰富含量的长链脂肪酸。根据图4所描述的显著升高的基质供应或在第266天暂停的基质供应均没有导致羧酸浓度的显著升高(auffKlligeSpitzen)。这意味着，在水解和 随后的酸化、乙酸化过程中所产生的中间产物在产甲烷过程(生成沼气的最后步骤)中转 化为沼气。因此，这表明发酵过程在长期高负荷下也可以良好进行，使得不发生有机中间产 物的积累并因此提供发酵过程的长期稳定性。
图6显示了根据图4和5解释的发酵过程中发酵罐内容物的干物质含量和容积负 荷。其显示了以[kg oTS/m3d]计的容积负荷的时间曲线(使用附图标记10标明的曲线)， 干物质的百分比含量的时间曲线(使用附图标记IlOA标明的曲线)和有机干物质的百分 比含量的时间曲线(使用附图标记IlOB标明的曲线)。在第235天首次添加煎盘梭菌SBGl的纯培养物的时间点上，以约4. 5千克有机干 物质每立方米每天的容积负荷操作发酵罐。添加煎盘梭菌SBGl使得装置的容积负荷继续 升高。此时干物质或有机干物质的百分比含量几乎保持恒定。这说明在发酵基质的发酵过 程中没有积累未发酵的有机干物质。添加煎盘梭菌SBGl的纯培养物使得发酵基质中包含 的干物质连续转化，这再次导致连续的发酵，从而避免了干物质的积累。在以恒定容积负荷操作沼气装置的阶段中，甚至观察到干物质的减少，这意味着 煎盘梭菌SBGl微生物通过其水解代谢活性不仅避免了发酵罐中干物质的积累，还改善了 干物质的水解转化。因此，图4至6显示了添加具有水解活性的发酵微生物煎盘梭菌SBGl对于有机干 物质的水解所产生的积极效果。在相同的条件下，通过添加煎盘梭菌微生物可以使发酵罐 容积负荷从约5. 5kg oTS/m3d升高至约8. 5kg oTS/m3d,即升高50%以上，并且不会导致发 酵过程的不稳定性。在容积负荷升高的同时，沼气产量超过两倍。此外，沼气比产量升高， 因为与不添加煎盘梭菌微生物的情况相比，更多的有机干物质被分解。使用煎盘梭菌微生 物使得沼气装置的效率和生产率明显改善。
1权利要求
一种在发酵反应器中由生物质制备沼气的方法，其特征在于，向生物质中添加煎盘梭菌微生物。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，以微生物培养物的形式添加煎盘梭菌微 生物，其中煎盘梭菌微生物占培养物中存在的微生物总量的至少10_4%。
3 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，在微生物培养物中，煎盘梭菌微生物占培 养物中存在的微生物总量的至少10_2%。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，在微生物培养物中，煎盘梭菌微生物占培 养物中存在的微生物总量的至少1%。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，在微生物培养物中，煎盘梭菌微生物占培 养物中存在的微生物总量的至少10%。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，在微生物培养物中，煎盘梭菌微生物占培 养物中存在的微生物总量的至少50%。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，在微生物培养物中，煎盘梭菌微生物占培 养物中存在的微生物总量的至少75%。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，在微生物培养物中，煎盘梭菌微生物占培 养物中存在的微生物总量的至少90%。
9.根据权利要求2至8任一项所述的方法，其特征在于，添加煎盘梭菌微生物的纯培养物。
10.根据权利要求2至9任一项所述的方法，其特征在于，向生物质中添加煎盘梭菌微 生物作为至少一种固定化微生物培养物的组成部分。
11.根据权利要求1至10任一项所述的方法，其特征在于，添加煎盘梭菌微生物的同时 向发酵反应器中添加额外的生物质。
12.根据权利要求1至11任一项所述的方法，其特征在于，通过连续添加生物质使发酵 反应器容积负荷连续升高。
13.根据权利要求1至12任一项所述的方法，其特征在于，在>0.5kg oTS/m3d，优选 彡4. Okg oTS/m3d，特别优选彡8. Okg oTS/m3d的容积负荷下由生物质制备沼气。
14.根据权利要求1至13任一项所述的方法，其特征在于，在不断搅拌发酵基质的情况 下由生物质制备沼气。
15.根据权利要求1至14任一项所述的方法，其特征在于，在20°C至80°C的温度下，优 选40°C至50°C的温度下由生物质制备沼气。
16.根据权利要求1至15任一项所述的方法，其特征在于，连续添加发酵基质和连续添 加煎盘梭菌微生物。
17.根据权利要求1至16任一项所述的方法，其特征在于，将一定量的煎盘梭菌微生物 添加至发酵基质中，使得在添加之后，煎盘梭菌微生物的含量占发酵基质中存在的微生物 总量的10_8%至50%。
18.根据权利要求17所述的方法，其特征在于，将一定量的煎盘梭菌微生物添加至 发酵基质中，使得在添加之后，煎盘梭菌微生物的含量占发酵基质中存在的微生物总量的 10-6%至 25%。
19.根据权利要求18所述的方法，其特征在于，将一定量的煎盘梭菌微生物添加至发酵基质中，使得在添加之后，煎盘梭菌微生物的含量占发酵基质中存在的微生物总量的 10-4% 至 10%。
20.根据权利要求19所述的方法，其特征在于，将一定量的煎盘梭菌微生物添加至 发酵基质中，使得在添加之后，煎盘梭菌微生物的含量占发酵基质中存在的微生物总量的 10-3% 至 1%。
21.煎盘梭菌微生物在由生物质发酵制备沼气中的用途。
22.煎盘梭菌微生物菌株SBG1，其在德国微生物菌种保藏中心保藏，保藏号为 No.19861。
23.一种含有核酸的微生物，所述核酸具有核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列 包含一个序列区，该序列区与核苷酸序列SEQ IDNo. 1的序列同一性大于99. 2%。
24.根据权利要求23所述的微生物，其特征在于，所述核苷酸序列包含一个序列区，该 序列区与核苷酸序列SEQ ID No. 1的序列同一性大于99. 4%。
25.根据权利要求24所述的微生物，其特征在于，所述核苷酸序列包含一个序列区，该 序列区与核苷酸序列SEQ ID No. 1的序列同一性大于99. 6%。
26.根据权利要求25所述的微生物，其特征在于，所述核苷酸序列包含一个序列区，该 序列区与核苷酸序列SEQ ID No. 1的序列同一性大于99. 8%。
27.根据权利要求26所述的微生物，其特征在于，所述核苷酸序列包含一个序列区，该 序列区与核苷酸序列SEQ ID No. 1的序列同一性大于99. 9%。
28.根据权利要求27所述的微生物，其特征在于，所述核苷酸序列包含一个序列区，该 序列区与核苷酸序列SEQ ID No. 1完全相同。
29.一种适用于由生物质发酵制备沼气的方法的微生物培养物，其特征在于，在所述微 生物培养物中存在如权利要求22至28所述的煎盘梭菌微生物，其中所述煎盘梭菌微生物 占培养物中存在的微生物总量的至少10_4%。
30.根据权利要求29所述的微生物培养物，其特征在于，煎盘梭菌微生物占培养物中 存在的微生物总量的至少10_2%。
31.根据权利要求30所述的微生物培养物，其特征在于，煎盘梭菌微生物占培养物中 存在的微生物总量的至少1%。
32.根据权利要求31所述的微生物培养物，其特征在于，煎盘梭菌微生物占培养物中 存在的微生物总量的至少10%。
33.根据权利要求32所述的微生物培养物，其特征在于，煎盘梭菌微生物占培养物中 存在的微生物总量的至少25%。
34.根据权利要求33所述的微生物培养物，其特征在于，煎盘梭菌微生物占培养物中 存在的微生物总量的至少50%。
35.根据权利要求34所述的微生物培养物，其特征在于，煎盘梭菌微生物占培养物中 存在的微生物总量的至少75%。
36.根据权利要求35所述的微生物培养物，其特征在于，煎盘梭菌微生物占培养物中 存在的微生物总量的至少90%。
37.根据权利要求36所述的微生物培养物，其特征在于，其是煎盘梭菌微生物的纯培 养物。
38.根据权利要求29至37任一项所述的微生物培养物，其特征在于，其是固定化的微 生物培养物。
全文摘要
本发明涉及一种在发酵反应器中由生物质制备沼气的方法，其中向生物质中添加煎盘梭菌微生物。
文档编号C02F11/04GK101918568SQ200880124105
公开日2010年12月15日 申请日期2008年12月8日 优先权日2008年1月10日
发明者D·法特, M·罗伊特, V·杜霍 申请人:史马克沼气股份有限公司