专利名称：：采用Klebsiellasp.DB-2菌修复地下水中硝酸盐污染的方法
技术领域：
：本发明涉及一种污染物的修复方法，特别涉及一种硝酸盐污染地下水的修复方法，确切地说是采用可溶解的含碳有机物和DB-2菌修复地下水中硝酸盐污染的方法。
背景技术：
：农业化肥的过量使用，工业污水排放量剧增，农田大面积污灌，使地下水中的硝酸盐氮污染严重，我国大多数地区的地下水在不同程度上都遭受到硝酸盐污染，并且污染程度不断增加。地下水中的大量硝酸盐对人类和动植物健康有害，人体摄入的硝酸盐绝大部分来自蔬菜和饮用水，高浓度N03'的摄取会严重影响人类健康，如婴儿的高铁血红蛋白、蓝色婴儿综合症，甚至致癌。因此，控制地下水硝酸盐污染是一个迫切问题，对保障居民身心健康和湖泊富营养化防治具有双重价值。地下水硝酸盐污染的治理己被广泛研究并付诸实践，在诸多的方法中，生物修复方法是地下水污染修复的经济有效途径，通过反硝化细菌的生物反硝化作用使N(V被转变为N(V、NO、N20直至N2从地下水中去除，而产生的只是生物固体。反硝化细菌是进行反硝化作用的微生物，在自然界中普遍存在。在已有的地下水硝酸盐污染治理技术中大多采用土著微生物进行原位或异位修复。但由于土著菌包含许多种类的细菌，其生长速度慢、代谢活性不高，相互之间会因为对能源的竞争而使所需的反硝化细菌生长受到抑制，数量减少，反硝化作用不明显。地下水环境属于兼氧或缺氧环境，硝酸盐随地下水进入深层地下，一些好氧反硝化细菌不能发挥作用，因此需要经过专门筛选、培养的高效兼氧优势反硝化细菌。在兼氧或缺氧的条件下反硝化细菌以NOx-N为电子受体，以有机物(有机碳)为电子供体去除地下水中的硝酸盐，因此需要提供足量的有机碳才能够完成生物反硝化作用，而地下水中通常缺乏有机碳。
发明内容本发明是为避免上述现有技术所存在的问题，提供一种采用《/e6wW/flDB-2菌修复地下水中硝酸盐污染的方法，利用纯化的/:/^5&/&w.DB-2菌，以可溶解的含碳有机物为碳源，以便有效地用于地下水硝酸盐污染的生物修复。本发明解决技术问题采用如下技术方案本发明采用《/e6wW/aw.DB-2菌修复地下水中硝酸盐污染的方法的特点是以可溶解含碳有机物作碳源，使用纯化《/efc/e/ZaDB-2菌作为生物修复菌株，修复方法包括原位修复和异位修复。本发明采用K/efc/e/tow.DB-2菌修复地下水中硝酸盐污染方法的特点也在于所述可溶解含碳有机物为乙醇或乙酸盐。所述原位修复方法是在硝酸盐污染地区钻井或钻孔，向井内或孔内灌注或加压灌注纯菌和含碳有机物的混合液，首次添加时维持水中菌浓度为106-109个凡、可溶解含碳有机物与硝酸盐氮的摩尔比C/N为1~5:1，对于硝酸盐氮含量超过100mg/L的地下水，第15天再添加一次以保持细菌的数量与活性。所述异位修复方法是将硝酸盐污染地区的井水抽出，混合幻e&s/e/tow.DB-2菌种和可溶解的含碳有机物后，重新灌注到地下；首次添加时维持水中菌浓度为106-109个1、可溶解的含碳有机物与硝酸盐氮的摩尔比C/N为1~5:1，对于硝酸盐氮含量超过100mg/L的地下水，第15天再投加一次以保持细菌的数量与活性。所述纯化幻e^'d/a平DB-2菌种的制备按如下过程进行a、菌种的选择取垃圾渗滤液，加入到反硝化细菌培养基中富集，在厌氧条件下得到富集菌液后，取菌液在反硝化细菌培养基上按照倍比稀释的方法涂布，待长出菌落后，挑取菌落，在反硝化细菌培养基上划线，经过多次划线分离，得到纯化的单菌落；将形态不同的单菌落分别接种到反硝化富集培养基中富集后，用格利斯试剂进行定性的菌种筛选，再将所得的菌株分别进行定量实验，筛出一株异养兼性厌氧的高效反硝化细菌，其菌落为圆形、乳白色、表面光滑、中间突起、边缘整齐、易挑取，革兰氏阴性，镜检呈短杆状、八字形排列细菌，经16SrDNA序列数据库鉴定为克雷伯氏幻efeid/asp.，获得Klebsiellasp.DB-2菌株；b、尺/^5&/^^.08-2菌种子液培养采用反硝化细菌培养基，将所述反硝化细菌培养基的pH调节到7.2-8.4后灭菌，接种步骤a所得iC/efe/e//"平DB-2菌株，28'C3(TC厌氧培养48小时，用血球计数板计算菌数使其浓度达到108~10u个/L数量级。所述接种的反硝化细菌幻efe/eto平DB-2的菌液接种量按体积比为1%~3%。反硝化细菌根据生长碳源不同可分为自养反硝化细菌和异养反硝化细菌，自养反硝化细菌利用无机碳源，以氢或硫及硫的化合物为主要的电子供体，氢是一种理想的电子供体，不会造成二次污染，但是氢气价格昂贵、易燃，和空气混合易爆，而且在水中的溶解度较低(1.6mg/L，20°C)，因此在地下水处理中的运用受到了很大的限制。硫的价格虽然低廉、无毒，但是当水中含有硝酸盐浓度本发明采用平DB-2菌修复地下水中硝酸盐污染，A7e6wW/fl平DB-2是从垃圾渗滤液中分离筛选出的高效异养型兼氧反硝化纯菌，其代谢活性较高、去除硝酸盐速率较快，通过富集该菌菌液和添加可溶性的含碳有机物，利用原位或异位修复技术，使菌液和碳源溶于水后随地下水流动扩散，修复深层地下水中的硝酸盐污染，更适合于区域规模地下水污染原位修复需求。与已有技术相比，本发明有益效果体现在1、本发明添加可溶解的含碳有机物做碳源，采用《/efe/e/to^.DB-2菌对地下水硝酸盐污染进行修复，该菌能够在地下水环境中发生反硝化作用去除硝态氮。当地下水硝酸盐氮含量为50mg/L左右，投菌7天左右地下水硝酸盐氮含量低于地下水质量标准。2、本发明是采用外来反硝化纯化菌种去除地下水硝酸盐污染，可以经过筛选、培养获得高效反硝化细菌，其代谢活性高，去除硝酸盐速率快。当碳源消耗完，该菌也随之衰亡，最终恢复自然的生态平衡。3、本发明利用添加可溶解的含碳有机物作《/etoW/w/7.DB-2菌反硝化作用的碳源，可溶解的含碳有机物包括乙醇、乙酸盐、甲酸盐、蔗糖、葡萄糖、尿素等，溶解到水中可随地下水的流动扩散，使反硝化作用的范围更广。图1为本发明在不同C/N比之下地下水硝态氮的去除情况示意图。图2为本发明在不同C/N比之下地下水总有机碳的变化情况示意图。图3为本发明在不同水流速度下地下水硝态氮的去除情况示意图。图4为本发明在不同水流速度下出水中细菌数量的变化情况示意图。具体实施例方式具体实施中，采用尺/e6wW/a平DB-2菌修复地下水硝酸盐污染的方法，添加含碳有机物为碳源，包括原位修复方法和异位修复方法。在地下水硝酸盐污染盐地区，用电磁勘探技术进行现场勘探，确定该地区来水和出水的分布与走向。并根据其范围(长、宽、深度)计算出该区地下水的总水量V。按照勘探得知的来水和出水的走向上选23个点采用常规钻井或更简便的高压地质直接钻孔。取水样分析井水的硝酸盐氮含量、亚硝酸盐氮含量、TOC、反硝化细菌浓度。其中原位修复的方法是按照可溶解的含碳有机物与硝酸盐氮的摩尔比C/N为1~5:1的比例灌注到井水中，首次添加时维持水中菌浓度为106-109个几，对于硝酸盐氮含量超过100mg/L的地下水，第15天再添加一次以保持细菌的数量与活性。异位修复方法是将硝酸盐污染地区的井水抽出，混合A7^m'd/a平DB-2菌种和可溶解的含碳有机物后，重新灌注到地下，首次添加时维持水中菌浓度为106-109个/匕按照可溶解的含碳有机物与硝酸盐氮的摩尔比C/N为1~5:1的比例，对于硝酸盐氮含量超过100mg/L的地下水，第15天再投加一次以保持细菌的数量与活性。DB-2菌种子液的制备方法为1、菌种选择本发明采用的高效纯化的反硝化细菌是从合肥市垃圾填埋场的渗滤液中，利用公知公用的反硝化细菌培养基经过划线分离、格利斯试剂进行菌种筛选、划线纯化得到的一株异养兼性厌氧的高效反硝化细菌，获得该菌株的方法详见LIUYong,etal,2008年发表的国际会议论文"SimulatedExperimentofRemovingNitratefromGroundwaterbyDenitrobacteria"，Proceedingodthe2ndinternationalconferenceonASIAN-EUROPEANENVIRONMENTALTECHNOLOGYANDKNOWLEDGETRANSFER,Editors:Nellesetal.ISBN578-3-00-024606-7.Hefei.2008，June:5-6:215-217。，经16SrDNA序列数据库鉴定为克雷伯氏iC/efeie//flsp.，命名为A7e&szW/fl^.DB-2，该菌落特征如表l:表1A7efozW/asp.DB-2菌株特征<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>2、K/^w'e/to印.DB-2菌种子液培养采用公知公用的反硝化细菌培养基调节pH为7.2-8.4后灭菌，接种幻efo/e/to平DB-2菌种，28"30。C厌氧培养48小时，用血球计数板计算菌数使其浓度达到1081011个/L数量级。3、反硝化细菌幻6^/6//"平DB-2的接种量为1%~3%(v/v);添加的可溶解的含碳有机物用量按照C/N折算。模拟地下水流动反应器中的实验，实验用水为取自合肥市滨湖硝酸盐污染地区的井水，添加的可溶解的含碳有机物为无水乙醇1、模拟反应器井水中硝态氮的去除情况，以黄砂作含水层填充介质，在不同C/N比下，当水呈静态不流动时，水中硝态氮随时间的变化如图1所示。由图1可见，井水中没有添加乙醇时(即control),因为原井水中含有少量的有机碳，能够为反硝化菌株^^^&//08^08-2提供少量碳源，菌株也可维持活性，但随着碳源的缺失，反硝化进程终止，水中的硝酸盐氮含量基本维持稳定；用乙醇做外加碳源后，当C/N从1到9改变时，硝酸盐氮的去除速率随C/N比的增大而增大，在144小时的实验周期内，最终的硝酸盐氮含量为2.23mg丄—1，去除率达93.6%。2、模拟反应器井水中总有机碳(TOC)的变化情况，在不同C/N比下，当水呈静态不流动时，水中TOC随时间的变化如图2所示。从图2可以看出，没有添加乙醇时，测得井水中存在少量有机碳(41.98mg'I/1),在添加乙醇后，随着菌株反硝化作用的进行，碳源被消耗，反应器出水中的TOC值不断下降，这在C/N比较低(C/NS5)时很明显，在C/N55时出水中TOC较低；而当C/N比为7和9时，反应器出水中TOC的残留量较高，说明C/N过量，超过了菌体生长对碳源的需求。因此，在为菌体生长和反硝化作用提供碳源时，应该综合考虑硝酸盐氮的去除与菌株对碳源的需求量，本实验条件下C/N55较为适宜。3、反应器中不同水流速度对硝酸盐氮去除的影响，出水中硝酸盐氮含量随时间变化结果如图3所示。从图3可以看出水流速度快则硝酸盐氮去除率低，三条曲线在144小时以后仍然有下降趋势，由于本实验模型含水层高度仅为80cm，而如果用于地下水原位修复，水的流径会延长，细菌反硝化作用的时间也相应增加，则水中硝酸盐氮的浓度会进一步降低。另外，地下水流速范围一般在几十cm，d'1，在平原区，地下水径流速度更低。这种实际情况将更有利于硝酸盐氮的去除。因此以乙醇为外加碳源按照C/N比为15:1加入到地下水中，利用反硝化细菌《feZwW/flsp.DB-2可以有效去除硝酸盐氮污染，同时不会因使用的碳源过量而导致二次污染，出水中远硝酸盐含量低于地下水质量标准。4、从反应器出水中检测的尺/e^/e/tosp.DB-2菌株的数量随时间的变化看来，当碳源被消耗时，细菌衰亡，其数量大幅度下降，最终恢复自然的生态平衡。权利要求1、一种采用Klebsiellasp.DB-2菌修复地下水中硝酸盐污染的方法，其特征是以可溶解含碳有机物作碳源，使用纯化Klebsiellasp.DB-2菌作为生物修复菌株，修复方法包括原位修复和异位修复。2、根据权利要求1所述的采用《fe^/e/tow.DB-2菌修复地下水中硝酸盐污染的方法，其特征是所述可溶解含碳有机物为乙醇或乙酸盐。3、根据权利要求1所述的采用DB-2菌修复地下水中硝酸盐污染的方法，其特征是所述原位修复方法是在硝酸盐污染地区钻井或钻孔，向井内或孔内灌注或加压灌注纯菌和含碳有机物的混合液，首次添加时维持水中菌浓度为106-109个几、可溶解含碳有机物与硝酸盐氮的摩尔比C/N为1~5:1，对于硝酸盐氮含量超过100mg/L的地下水，第15天再添加一次以保持细菌的数量与活性。4、根据权利要求1所述的采用夂/^wW/fl平DB-2菌修复地下水中硝酸盐污染的方法，其特征是所述异位修复方法是将硝酸盐污染地区的井水抽出，混合/^^&/^^.DB-2菌种和可溶解的含碳有机物后，重新灌注到地下；首次添加时维持水中菌浓度为106-109个几、可溶解的含碳有机物与硝酸盐氮的摩尔比C/N为1~5:1，对于硝酸盐氮含量超过100mg/L的地下水，第15天再投加一次以保持细菌的数量与活性。5、根据权利要求1所述的采用DB-2菌修复地下水中硝酸盐污染的方法，其特征是所述纯化尺/efe/e/^^.DB-2菌种的制备按如下过程进行a、菌种的选择取垃圾渗滤液，加入到反硝化细菌培养基中富集，在厌氧条件下得到富集菌液后，取菌液在反硝化细菌培养基上按照倍比稀释的方法涂布，待长出菌落后，挑取菌落，在反硝化细菌培养基上划线，经过多次划线分离，得到纯化的单菌落；将形态不同的单菌落分别接种到反硝化富集培养基中富集后，用格利斯试剂进行定性的菌种筛选，再将所得的菌株分别进行定量实验，筛出一株异养兼性厌氧的高效反硝化细菌，其菌落为圆形、乳白色、表面光滑、中间突起、边缘整齐、易挑取，革兰氏阴性，镜检呈短杆状、八字形排列细菌，经16SrDNA序列数据库鉴定为克雷伯氏幻efc!W/a印.，获得Klebsiellasp.DB-2菌株；b、幻efe!W/a^.DB-2菌种子液培养采用反硝化细菌培养基，将所述反硝化细菌培养基的pH调节到7.2-8.4后灭菌，接种步骤a所得K/efe/e〃a平DB-2菌株，28匸30'C厌氧培养48小时，用血球计数板计算菌数使其浓度达到1081011个/L数量级。6、根据权利要求书5所述的方法，其特征是所述接种的反硝化细菌《/eZ^Wto^.DB-2的菌液接种量按体积比为1%~3%。全文摘要一种采用Klebsiellasp.DB-2菌修复地下水中硝酸盐污染的方法，其特征是以可溶解含碳有机物作碳源，使用纯化Klebsiellasp.DB-2菌作为生物修复菌株，修复方法包括原位修复和异位修复。本发明方法可以有效地用于地下水硝酸盐污染的生物修复。文档编号C02F3/34GK101613156SQ20091014440公开日2009年12月30日申请日期2009年8月7日优先权日2009年8月7日发明者严小三,咏刘,钱家忠,舟陈,陈天虎,雷马申请人:合肥工业大学