专利名称：一种利用原生质体融合技术制备微生物絮凝剂的方法
技术领域：
本发明涉及一种微生物絮凝剂，尤其涉及一种利用原生质体融合技术制备微生物絮凝剂的方法。
背景技术：
水是人类生存最基本的需求，然而随着工业的迅猛发展，水体污染问题日益突出， 同时，人们物质生活水平的不断提高对水质也提出了更高的要求。在水处理剂絮凝技术发展史上，60年代开发了无机盐类的絮凝剂(如硫酸铝、氯化铝、氯化铁等)，其处理效果不理想，进而研制的高分子聚合无机盐型絮凝剂(如聚合氯化铝、聚合硫酸铁等)在水处理中收到了很好的效果，但聚合氯化铝其铝离子在使用过程中会对环境产生一定的二次污染，而且会导致老年痴呆症等毒性效应；聚丙烯酰胺在环境中难以降解，导致二次污染，而且具有强烈的神经毒性和“三致”效应。因此寻求兼有高效、环保、经济且无二次污染的水处理剂是当前水处理领域的研究热点和前沿课题。微生物絮凝剂作为第三代有机高分子絮凝剂，是一种高校、无毒、无二次污染、能自行降解、使用范围广的新一代絮凝剂。它是通过直接利用微生物细胞，或细胞提取物，或代谢产物提取、精制而得到的有絮凝活性的物质。微生物絮凝剂可以克服无机或有机高分子絮凝剂本身固有的成本高、絮凝效果有存在二次污染且对人体有害的缺陷。中国专利 (申请号200910042265. 7)公开了一种微生物絮凝剂的生产方法，该方法以体积比计，按 1.5-3.0 100的接种量在培养基中接入荧光假单细菌，在温度为25 30°C，培养30 48 小时，制得微生物絮凝剂。微生物絮凝剂在处理废水方面有着突出的优越性，它的大规模生产和应用将有广阔的市场前景。但是从规模化生产和废水处理角度看，目前国内外对微生物絮凝剂的研究还存在着如下一些方面的问题(1).制备成本高绝大多数按照食品发酵和生物制药的思路制备微生物絮凝剂， 即采用单一菌种和价格昂贵培养基，制备成本偏高。(2).测定絮凝剂活性的指标单一目前，国内外只用微生物絮凝剂处理高岭土悬浊液的能力来表征其活性，对于性质和种类千差万别的工业废水而言，此指标显然不能全
面衡量。(3).针对性不强在研究微生物絮凝剂处理废水时，尚没有关于絮凝剂种类、成分与处理废水类型对应关系的研究，这将造成微生物絮凝剂在使用过程中的盲目性和缺乏针对性，从而难以提高微生物絮凝剂处理废水的效率。微生物原生质体融合技术是近20年来国内外细胞工程领域的一个研究热点。它通过溶菌酶处理而制各，在高渗条件下通过PEG促融，使具有不同优良性状的两株菌通过破壁、促融，将两个优良性状集中于一种微生物内。基于此，原生质体融合技术作为一种育种技术，不仅可以大幅度提高产絮菌株的絮凝活性和产絮产量，还可以获得新的遗传特性。本发明利用原生质体融合技术提高微生物絮凝剂的絮凝活性，获得微生物絮凝剂
3产生菌原生质体形成和再生条件、与降解菌进行原生质体融合和融合菌株发酵絮凝条件。
发明内容
本发明的目的是克服现有絮凝剂制备方法的不足，提供一种利用原生质体融合技术制备微生物絮凝剂的方法，获得微生物絮凝剂产生菌原生质体形成和再生条件、与降解菌进行原生质体融合和融合菌株发酵絮凝条件。一种利用原生质体融合技术制备微生物絮凝剂的方法，该方法包括絮凝剂产生菌LV-I制备及再生条件是以0. 5 2%接种量在CM液体培养基中活化5 10小时，酶解前加入2 6mol/L甘氨酸处理5 15小时，酶浓度0. 05 0. 2mg/ mL，37°C水浴酶解1 4小时，并涂布以蔗糖为稳定剂的再生平板；絮凝剂融合菌株LV-2发酵及絮凝条件蔗糖8 12g/L，乳糖5 10g/L，硝酸铵 0. 4 1. 2g/L，蛋白胨0. 4 1. 2g/t，，酵母膏0. 1 0. 4g/L，培养温度为20 40°C，最佳的投加量为0.2^-2 ^进一步，所述的利用原生质体融合技术制备微生物絮凝剂的方法，还具有如下技术特征所述的絮凝剂产生菌LV-I的优选制备及再生条件以接种量在CM液体培养基中活化8小时，酶解前加入4mol/L甘氨酸处理10小时，酶浓度0. lmg/mL, 37°C水浴酶解 2小时，并涂布以蔗糖为稳定剂的再生平板。所述的絮凝剂产生菌LV-I的提纯条件如下(1).在母菌发酵液中加入95%乙醇，放置一段时间，收集沉淀，(2).将沉淀物重溶于水，加入1倍体积的氯仿正丁醇混合液，振荡过夜，分层，上层以高速离心lOmin，取上清液，再次加入1倍体积的氯仿正丁醇混合液，以去除蛋白质，(3).再取上清液，加入95%乙醇，放置一段时间，离心收集沉淀，(4).取出沉淀，于氮气保护下干燥3小时后获得为絮凝剂LV-I。所述的絮凝剂融合菌株LV-2的优选发酵及絮凝条件蔗糖作为有机碳源，碳氮源最佳组合为蔗糖10g/L，乳糖9g/L，硝酸铵0. 8g/L，蛋白胨0. 8g/t，，酵母膏0. 2g/L，最佳的培养温度为30°C，最佳的投加量为0. 5% 1 %，摇床培养液初始pH值在6. 8 7. 5内最好。所述的絮凝剂融合菌株LV-2筛选条件为(1).原生质体融合方法将絮凝剂产生菌LV-I和降解菌接种到种子培养基中，絮凝剂产生菌LV-I培养到对数中期制备原生质体并进行60°C，1小时热灭活，降解菌培养6 小时后(处于对数生长中期)，加入亚抑制量的青霉素液2u/mL，继续活化3小时，然后进行离心洗涤制备原生质体并进行紫外灭活1小时，(2).取全部灭活后的原生质体悬浮液两亲本各ImL混合，3000r/min,离心20min，
弃上清液，(3).加入0. 2mL新生磷酸钙溶液，混勻，加入2mLPEG6000，37°C下处理30min，(4).立即用SMM将其稀释，离心，弃上清液，再用SMM定容至2mL，混勻后稀释10 倍，涂高渗再生平板，37°C培养，(5).培养3 4天后，平板上的菌落挑到斜面进行下一步的融合子筛选，
(6).筛选后得到最佳处理效果融合子菌株LV-2进行废水絮凝实验，得出LV-2融合子菌株的COD去除率最佳，确定为絮凝效果最好的融合子菌株。相对于现有技术本发明的优点在于(1).高效性与传统絮凝剂相比，对自来水、工业废水、城市污水的处理效果、效率、成本优于现有的絮凝剂。(2).实施工艺简单不需要大范围改造原有水处理流程，只需在原有流程基础上再添加一道工序。(3).应用范围广产品兼具有良好的絮凝、金属离子吸附、除臭、脱色及有效降低 COD值等诸多功能，具有一定的普适性，对印染、电镀等企业废水均适用。(4).成本低采用原生质体融合技术提高微生物絮凝剂的絮凝活性，减小投放量，使用成本为同类微生物絮凝剂的50%。(5).生物安全性无毒，无二次污染，恢复水体自身净化功能。
具体实施例方式下面结合具体实施例，对本发明所述的利用原生质体融合技术制备微生物絮凝剂的方法，作进一步详细的说明。实施例1絮凝剂产生菌LV-I的制备及再生条件以接种量在CM液体培养基中活化8小时，酶解前加入4mol/L甘氨酸处理10小时，酶浓度0. lmg/mL, 37°C水浴酶解2小时，并涂布以蔗糖为稳定剂的再生平板。其中，原生质体形成率与再生率分别能达到96%和23%。絮凝剂融合菌株LV-2的发酵及絮凝条件蔗糖作为有机碳源，在本实施例中，碳氮源最佳组合为蔗糖10g/L，乳糖9g/L，硝酸铵0. 8g/L，蛋白胨0. 8g/t，，酵母膏0. 2g/L， 培养温度为30°C，投加量为0. 5%，摇床培养液初始pH值为7。实施例2絮凝剂产生菌LV-I的制备及再生条件以0. 5%接种量在CM液体培养基中活化6 小时，酶解前加入3mol/L甘氨酸处理8小时，酶浓度0. lmg/mL，37°C水浴酶解4小时，并涂布以蔗糖为稳定剂的再生平板。其中，原生质体形成率与再生率分别能达到94%和25%。絮凝剂融合菌株LV-2的发酵及絮凝条件蔗糖作为有机碳源，在本实施例中，碳氮源最佳组合为蔗糖8g/L，乳糖6g/L，硝酸铵0. 9g/L，蛋白胨1. 2g/t，，酵母膏0. 2g/L，培养温度为35°C，投加量为0. 8%，摇床培养液初始pH值为7。实施例3絮凝剂产生菌LV-I的制备及再生条件以1. 5%接种量在CM液体培养基中活化 10小时，酶解前加入6mol/L甘氨酸处理12小时，酶浓度0. 2mg/mL, 37°C水浴酶解4小时， 并涂布以蔗糖为稳定剂的再生平板。絮凝剂融合菌株LV-2的发酵及絮凝条件蔗糖作为有机碳源，在本实施例中，碳氮源最佳组合为蔗糖12g/L，乳糖9g/L，硝酸铵0. 6g/L，蛋白胨0. 8g/t，，酵母膏0. 3g/L， 最佳的培养温度为30°C，最佳的投加量为0. 6%，摇床培养液初始pH值为6. 8。在上述各实施例中，涉及到絮凝剂产生菌LV-I的提纯和絮凝剂融合菌株LV-2筛选，其对应的具体方法为
1.所述的絮凝剂产生菌LV-I的提纯条件为(1).在母菌发酵液中加入95%乙醇，放置一段时间，收集沉淀，(2).将沉淀物重溶于水，加入1倍体积的氯仿正丁醇混合液，振荡过夜，分层，上层以高速离心lOmin，取上清液，再次加入1倍体积的氯仿正丁醇混合液，以去除蛋白质，(3).再取上清液，加入95%乙醇，放置一段时间，离心收集沉淀，(4).取出沉淀，于氮气保护下干燥3小时后获得为絮凝剂LV-1，提纯得到的絮凝剂LV-I为乳白色絮状物质，提取率约为10g/L。2.所述的絮凝剂融合菌株LV-2筛选条件为(1).原生质体融合方法将絮凝剂产生菌LV-I和降解菌接种到种子培养基中，絮凝剂产生菌LV-I培养到对数中期制备原生质体并进行60°C，1小时热灭活，降解菌培养6 小时后(处于对数生长中期)，加入亚抑制量的青霉素液2u/mL，继续活化3小时，然后进行离心洗涤制备原生质体并进行紫外灭活1小时，(2).取全部灭活后的原生质体悬浮液两亲本各ImL混合，3000r/min,离心20min，
弃上清液，(3).加入0. 2mL新生磷酸钙溶液，混勻，加入2mLPEG6000，37°C下处理30min，(4).立即用SMM将其稀释，离心，弃上清液，再用SMM定容至2mL，混勻后稀释10 倍，涂高渗再生平板，37°C培养，(5).培养3 4天后，平板上的菌落挑到斜面进行下一步的融合子筛选，(6).筛选后得到最佳处理效果融合子菌株LV-2进行废水絮凝实验，得出LV-2融合子菌株的COD去除率最佳，确定为絮凝效果最好的融合子菌株。以上是对本发明的描述而非限定，基于本发明思想的其它实施方式，均在本发明的保护范围之中。
权利要求
1.一种利用原生质体融合技术制备微生物絮凝剂的方法，其特征在于，该方法包括絮凝剂产生菌LV-I制备及再生条件以0. 5 2 %接种量在CM液体培养基中活化5 10小时，酶解前加入2 6mol/L甘氨酸处理5 15小时，酶浓度0. 05 0. 2mg/mL, 37°C 水浴酶解1 4小时，并涂布以蔗糖为稳定剂的再生平板；絮凝剂融合菌株LV-2发酵及絮凝条件蔗糖8 12g/L，乳糖5 10g/L，硝酸铵0. 4 1. 2g/L，蛋白胨0. 4 1. 2g/t，，酵母膏0. 1 0. 4g/L，培养温度为20 40°C，最佳的投加量为0. 2% 2%。
2.根据权利要求1所述的利用原生质体融合技术制备微生物絮凝剂的方法，其特征在于所述的絮凝剂产生菌LV-I的优选制备及再生条件以接种量在CM液体培养基中活化8小时，酶解前加入4mol/L甘氨酸处理10小时，酶浓度0. lmg/mL, 37°C水浴酶解2小时， 并涂布以蔗糖为稳定剂的再生平板。
3.根据权利要求1所述的利用原生质体融合技术制备微生物絮凝剂的方法，其特征在于所述的絮凝剂产生菌LV-I的提纯条件为(1).在母菌发酵液中加入95%乙醇，放置一段时间，收集沉淀，(2).将沉淀物重溶于水，加入1倍体积的氯仿正丁醇混合液，振荡过夜，分层，上层以高速离心lOmin，取上清液，再次加入1倍体积的氯仿正丁醇混合液，以去除蛋白质，(3).再取上清液，加入95%乙醇，放置一段时间，离心收集沉淀，(4).取出沉淀，于氮气保护下干燥3小时后获得为絮凝剂LV-I。
4.根据权利要求1所述的利用原生质体融合技术制备微生物絮凝剂的方法，其特征在于所述的絮凝剂融合菌株LV-2的优选发酵及絮凝条件蔗糖作为有机碳源，碳氮源最佳组合为蔗糖10g/L，乳糖9g/L，硝酸铵0. 8g/L，蛋白胨0. 8g/t，，酵母膏0. 2g/L，最佳的培养温度为30°C，最佳的投加量为0. 5% 1%，摇床培养液初始pH值在6. 8 7. 5内最好。
5.根据权利要求1所述的利用原生质体融合技术制备微生物絮凝剂的方法，其特征在于所述的絮凝剂融合菌株LV-2筛选条件为(1).原生质体融合方法将絮凝剂产生菌LV-I和降解菌接种到种子培养基中，絮凝剂产生菌LV-I培养到对数中期制备原生质体并进行60°C，1小时热灭活，降解菌培养6小时后(处于对数生长中期)，加入亚抑制量的青霉素液2u/mL，继续活化3小时，然后进行离心洗涤制备原生质体并进行紫外灭活1小时，(2).取全部灭活后的原生质体悬浮液两亲本各ImL混合，3000r/min,离心20min，弃上清液，(3).加入0.2mL新生磷酸钙溶液，混勻，加入2mLPEG6000，37°C下处理30min，(4).立即用SMM将其稀释，离心，弃上清液，再用SMM定容至2mL，混勻后稀释10倍，涂高渗再生平板，37°C培养，(5).培养3 4天后，平板上的菌落挑到斜面进行下一步的融合子筛选，(6).筛选后得到最佳处理效果融合子菌株LV-2进行废水絮凝实验，得出LV-2融合子菌株的COD去除率最佳，确定为絮凝效果最好的融合子菌株。
全文摘要
本发明提出了一种利用原生质体融合技术制备微生物絮凝剂的方法，属于絮凝剂制备领域，该方法包括(1)絮凝剂产生菌LV-1制备及再生条件以0.5～2％接种量在CM液体培养基中活化5～10小时，酶解前加入2～6mol/L甘氨酸处理5～15小时，酶浓度0.05～0.2mg/mL，37℃水浴酶解1～4小时，并涂布以蔗糖为稳定剂的再生平板；(2)絮凝剂融合菌株LV-2发酵及絮凝条件蔗糖8～12g/L，乳糖5～10g/L，硝酸铵0.4～1.2g/L，蛋白胨0.4～1.2g/t，酵母膏0.1～0.4g/L，培养温度为20～40℃，最佳的投加量为0.2％～2％。相对于现有技术，具有高效性、实施工艺简单、应用范围广、成本低及生物安全性等优点。
文档编号C02F3/34GK102241437SQ20101017419
公开日2011年11月16日 申请日期2010年5月13日 优先权日2010年5月13日
发明者黄岚 申请人:上海绿浮环保科技有限公司